Ha fatto la trasmissione di Helicobacter pylori da esseri umani causano un focolaio di malattia in una colonia di banda faccia dunnarts (Sminthopsis macroura)?

Forse la trasmissione di Helicobacter pylori
da esseri umani causano un focolaio di malattia in una colonia di banda faccia dunnarts (Sminthopsis macroura
)?
Abstract
Dalla scoperta che Helicobacter pylori
provoca una serie di patologie in stomaci degli esseri umani infetti, è diventato evidente che Helicobacters Quali sono trovato in una vasta gamma di specie animali in cui sono spesso associati con la malattia. Nel 2003 e nel 2004, ci sono stati due focolai di aumento della mortalità associate a sanguinamento gastrico e la perdita di peso in una colonia prigioniera del marsupiale australiano, il Dunnart Stripe-affrontato (Sminthopsis macroura
). La presenza di patologia gastrica ha portato ad un'indagine del potenziale Helicobacter
patogenesi di questi animali. L'esame istologico ha rivelato la presenza di gastrite, e l'analisi PCR ha confermato la presenza di Helicobacter
infezione nello stomaco di questi marsupiali. Sorprendentemente, sequenziamento del 16S rRNA da questi batteri identificato la specie come H. pylori
e PCR ha confermato il ceppo ad essere positivo per l'importante fattore di patogenesi, cagA
. Abbiamo quindi descrivere, per la prima volta, un apparente infezioni zoonotiche inverso dunnarts banda faccia da H. pylori
. Già incline a effetti patologici di stress (come sperimentato durante la stagione di allevamento), concomitante H. pylori
infezione sembra essere un possibile cofattore essenziale ma non sufficiente nel prototipo sanguinamento gastrico e la perdita di peso in questi marsupiali. Il Dunnart Stripe-fronte potrebbe rappresentare un nuovo modello per lo studio Helicobacter
-driven patologia gastrica. Le infezioni da loro gestori umani, in particolare di H. pylori
, può essere un potenziale rischio per le colonie in cattività di marsupiali.
Introduzione
La scoperta di Helicobacter pylori
alla fine ha portato ad una realizzazione che l'infezione del stomaco umano con questo batterio è un fattore eziologico chiave nello sviluppo di ulcera peptica e adenocarcinoma gastrico [1-3]. Un'altra importante conseguenza di questa scoperta è stata la successiva identificazione di una sempre crescente, famiglia apparentemente onnipresente di Helicobacter
specie che infettano il tratto gastrointestinale di quasi tutti gli animali esaminati. In realtà, molti Helicobacter
infezioni sono da ritenersi patogeni e, eventualmente, responsabile di una vasta gamma di condizioni di numerose specie animali (recensione in [4, 5]). Ad esempio, le infezioni da Helicobacter naturale
sono stati collegati con gastrite in piccole e grandi gatti, cani, maiali e furetti [6-10], l'aborto negli ovini [11], colite e epatite nelle scimmie rhesus [12], ulcere delfini e balene [13] e la diarrea nei gatti e pappagalli [14, 15].
in questo rapporto descriviamo due focolai di morti in una colonia prigioniero di un marsupiale australiano, il Dunnart Stripe-affrontato (Sminthopsis macroura
), che sono stati associati con sanguinamento nello stomaco forse a causa di infezione da parte del patogeno umano, H. pylori
.
Materiali e metodi
banda faccia dunnarts Aziende il dunnarts banda facce sono stati alloggiati presso il Dipartimento di Zoologia, Università di Melbourne. La colonia è tenuto entro gabbie mantenuto all'interno di un edificio temperatura regolata appositamente costruito, in un ambiente fisico in condizioni tipiche per coloro per topi abitazioni, tranne che l'illuminazione naturale è stata mantenuta. stabulazione degli animali in gabbie appositamente progettati, la dieta formulata per marsupiali carnivori insettivori e monitoraggio riproduttiva ha seguito lo schema dato in precedenza [16]. Non ci sono altre specie animali sono stati alloggiati in questo edificio. Le dunnarts sono stati forniti acqua ad libitum. Non dunnarts sono stati uccisi appositamente per questo studio; stomaci sono stati raccolti soltanto da animali eutanasia sia a causa di malattia o per altre sperimentazioni approvato dalla Università di Melbourne Science, Optometria & Vision Sciences e Land & Ambiente animale etico-comitato. Gli animali sono stati pesati a intervalli settimanali durante routine di zootecnia prova dell'ureasi
Rapid (test CLO)
biopsie dello stomaco di 1-2 mm sono stati collocati nel gel di un test rapido dell'ureasi (CLOtest;. Kimberly-Clark, Roswell, Georgia, USA). I test sono stati monitorati per un periodo di 24 h per un cambiamento di colore dal giallo al rosso che indicava la presenza di un organismo ureasi producono nello stomaco.
Valutazione istologica della patologia
metà Stomach state fissate in 10% formalina tamponata neutra , inclusi in paraffina, poi 4 sezioni micron di spessore
rilevamento di Helicobacter
infezione tagliate e colorate con ematossilina eosina. da specifici genere PCR
Per la valutazione di Helicobacter
infezione da parte di PCR, feci erano raccolti, o stomaci dunnart stati aperti lungo la curvatura interno e l'intero organo omogeneizzato (GmbH Polytron omogeneizzatore; Kinematica, Svizzera). raschiatura della mucosa sono stati raccolti anche da parte dell'intestino (grandi e piccole). DNA è stato estratto da feci e raschiature intestinali utilizzando un kit di feci QIAamp DNA (Qiagen, Hilden, Germania), e dallo stomaco omogeneizzato utilizzando il kit di DNA del tessuto QIAamp (Qiagen) secondo le istruzioni del produttore. Un Helicobacter
genere PCR mira un frammento di 374 bp del gene 16S rRNA è stata eseguita come descritto in precedenza [17].
Approcci per coltivare dunnart gastrico Helicobacter
dunnart stomaci sono stati raccolti ed omogeneizzato in Brain Heart brodo di infusione (BHI, Oxoid, Basingstoke, UK). Omogenato è stato aggiunto agar sangue di cavallo o piastre GSSA (come precedentemente descritto [18]) che sono stati incubati in un vaso anaerobica con microaerofili kit gassogeno (Oxoid, Basingstoke, UK) per 10 giorni a 37 ° C. Per la tecnica di filtrazione, omogenato è stato posto su 0,65 micron carta da filtro Whatman (GE Healthcare, Rydalmere, Australia), posizionato su piastre HBA, ed incubato a 37 ° C in condizioni microaerofili per 2 h. I filtri sono stati poi rimossi e le piastre incubate a 37 ° C in condizioni microaerofili per un massimo di 10 giorni.
Gene sequenziamento del 16S RNA ribosomiale
, cagA Urea
e
campioni di DNA estratto da nove dunnart stomaco e intestinali raschiatura sono stati sottoposti a sequenziamento. PCR per Helicobacter
geni sono stati eseguiti come descritto in precedenza per il 16S rRNA
[17], cagA
[19] e Urea
[20]. sequenziamento del DNA dei prodotti di PCR positivo è stato fatto per mezzo del terminatore chimica BigDye (Applied Biosystems, Foster City, Stati Uniti d'America). Sequencing sia del 5 'e 3' fine degli ampliconi è verificato in un volume di 20 ml consistente di 3,5 microlitri tampone di sequenziamento, 1 ml BigDye v3.1, 10 pmol /ml di primer necessaria, 40-100 ng di DNA, e acqua per portare a volume finale. Il programma di sequenziamento consisteva di 96 ° C per 1 minuto, 30 cicli di 96 ° C per 10 secondi, 50 ° C per 5 min e 60 ° C per 4 min. . Le sequenze sono state confrontate con sequenze di geni di identità note utilizzando il programma di ricerca Blastn disponibili attraverso il Centro Nazionale for Biotechnology Information (NCBI) sito web [21]
Risultati
Morti in una banda-affrontato Dunnart colonia - 2003
Una colonia di dunnarts banda faccia è in vigore da 26 anni, inizialmente a la Trobe University (Melbourne, Australia), e poi presso il Dipartimento di Zoologia, Università di Melbourne. La colonia è normalmente compreso tra 60-100 animali in cui il rapporto sessuale è 1/1. La morte per malattia è rara in questi animali e in un anno normale, il totale delle morti si verificano a un tasso di circa il 10% o meno del numero di animali nella colonia. La maggior parte dei decessi si verifica a causa di infortuni ottenuti durante l'accoppiamento (La stagione di allevamento da luglio a dicembre) o la vecchiaia.
Nel 2003 però, ci fu un drammatico aumento del tasso di mortalità di questi animali, con il 29% del dunnarts (30/104; un numero simile di maschi e femmine) che muoiono nel periodo di 6 mesi da luglio a dicembre. Gli animali che muoiono erano 1-2 anni e le morti non erano legate alla vecchiaia. Dunnarts solito perdono peso corporeo durante la stagione riproduttiva e questa perdita di peso è stata anche notevolmente aumentata nel corso del 2003. Maschio dunnarts tipicamente perdere peso medio del 12% del corpo da luglio a dicembre, ma nel 2003 hanno perso in media 27,7%. Allo stesso modo, femminili dunnarts perso una media del 30,3% nello stesso periodo del 2003, a fronte di una tipica perdita media del 16%. La Figura 1 mostra la perdita di peso relativo osservato da questi dunnarts nel 2003, rispetto alla perdita di peso osservato nel 2006, un anno tipico in cui non aumenta la mortalità. Figura 1 perdita di peso corporeo in banda-affrontato Dunnart aumentati durante focolaio di malattia. I valori indicati presente la variazione media del peso corporeo ± S.E.M. di dunnarts banda faccia nei mesi di luglio-dicembre (calcolato come il peso dei singoli animali a settembre e dicembre in percentuale del loro peso nel mese di luglio). I dati indicati sono da un anno dello scoppio della malattia (2003; n
= 25) e un anno normale quando è stato osservato alcun aumento della mortalità (2006; n
= 35). Sia i maschi che le femmine sono inclusi e i dati combinati, come entrambi i sessi hanno perso peso corporeo simili. Non vi era alcuna differenza significativa nel peso corporeo nel settembre 2003 e il 2006. Tuttavia, gli animali hanno perso significativamente più peso nel periodo fino al dicembre 2003, rispetto allo stesso periodo del 2006 (* p
< 0,001; ANOVA).
L'unica patologia evidente osservato post mortem era che quasi la metà degli animali morti o sono stati abbattuti a causa di essere molto malato ha avuto una grave emorragia gastrica. Oltre ad una maggiore perdita di peso, la maggior parte degli animali sembrava in buona salute fino a 1-2 giorni prima della morte, anche se alcuni avevano feci nere (in linea con sanguinamento gastrointestinale) e segni di anemia (muso pallido e gengive).
Morti in una banda faccia dunnart colonia - 2004
il sanguinamento gastrico presente in questi animali ha sollevato la possibilità di ulcere gastriche a causa di Helicobacter
infezione. Pertanto, nel maggio 2004, lo stomaco da due dunnarts femminili asintomatici sono stati testati per Helicobacter
l'infezione con il test CLO. Questi sono stati trovati ad essere positivo, di sostegno di un gastrica da Helicobacter
infezione. L'analisi istologica di questi stomaci rivelato la presenza di un processo infiammatorio relativamente mite, caratterizzato da aggregati linfoidi nella lamina propria (Figura 2), anche se non colonizzazione batterica in entrambi spirale o forma coccoidi potrebbero essere osservate in queste sezioni. Nessun grave patologia era evidente in queste sezioni particolari, anche se questi stomaci sono stati raccolti al di fuori della stagione riproduttiva, quando un aumento della mortalità e sanguinamento gastrico non era accadendo. Figura 2 L'infiammazione nella lamina propria gastrica di un Helicobacter -infected Dunnart. L'immagine viene mostrata da un amplificatore H &; E sezione del corpus gastrica macchiato, da un Helicobacter
-infected Dunnart (ingrandimento × 100). Lo stomaco è stato raccolto nel maggio 2004.
Tra luglio e dicembre 2004 un secondo incidente di un aumento della mortalità si è verificato, con 24 su 81 (30%) della colonia Dunnart morire, 6 dei quali aveva sanguinamento gastrico.
In diversi casi nel 2003 e 2004, le femmine che sono stati considerati in stato di gravidanza dal monitoraggio riproduttiva aveva interrotto la lettiera quando sono stati esaminati per ottenere embrioni.
Helicobacter
infezione nel Dunnart colonia 2005-2008
nel 2005, e negli anni successivi, il tasso di mortalità è tornato a livelli normali (~ 10% all'anno) e non altri casi di sanguinamento gastrico sono stati osservati. Tuttavia sporadici tentativi sono stati fatti per esaminare ulteriormente l'apparente gastrica da Helicobacter
infezione in questi animali. Questi tentativi sono stati limitati dalla disponibilità di animali per tali studi.
Nel 2006, la presenza di Helicobacter
in campioni di feci prelevati da maschi (n
= 20) e femminile (n = 20
) dunnarts sono stati valutati per genere specifico di PCR. Usando questo approccio, le feci di numeri equivalenti di sesso maschile (7/20) e femmina dunnarts (7/20) Stripe-faced hanno dimostrato di essere colonizzato da Helicobacter
specie, fornire la prova della presenza di Helicobacters
in GI tratto di almeno alcuni animali in questa colonia. I tentativi di coltivare Helicobacter
da questi campioni non hanno avuto successo.
Nel luglio 2007, lo stomaco e intestinali raschiatura raccolti da dunnarts sono stati analizzati mediante specifici per genere PCR. Questi hanno mostrato che 10/12 degli animali esaminati avevano Helicobacter gastrico
infezione. Anche in questo caso, i tentativi di coltivare Helicobacter
dai campioni gastrici non hanno avuto successo.
L'identificazione delle specie di Helicobacter
infezione nel Dunnart stomaco
per identificare se una nota o un romanzo Helicobacter
specie stava infettando la banda -faced Dunnart colonia, il 16S RNA ribosomiale
(rRNA) Helicobacter
gene da questi campioni gastrici è stato parzialmente sequenziato. Ciò indica che il 16S rRNA
sequenza genica di Helicobacter
infettare gli stomaci di dunnarts banda faccia corrisponde alla H. pylori
ceppi originariamente isolato da diverse regioni del tratto gastrointestinale umano tra lo stomaco e l'intestino. Le percentuali di identità ottenuti con le sequenze sono state 100% (Tabella 1) .table 1 Blastn recupero di Helicobacter pylori sequenze geniche
Blastn Recupera
numero GenBank adesione
Score (bit)
identità
E-valori
Helicobacter pylori
clone P13 16S RNA ribosomiale
gene
EF684928.1
699
100%
0.0
Helicobacter pylori
ceppo CD2 16S RNA ribosomiale
gene
HM243132.1
699
100%
0.0
Helicobacter pylori
deformazione HP504 RNA ribosomiale 16S
gene
GU449115.1
695
100%
0.0
Helicobacter pylori
v225d 16S RNA ribosomiale
gene
CP001582.1
695
100%
0.0
Helicobacter pylori
ceppo 407D5 16S RNA ribosomiale
gene
HM099656.1
695
100%
0.0
Helicobacter pylori
ceppo 15818 citotossina proteina associata III (cagA
) gene
AF083352.1
1288
96%
0.0
Helicobacter pylori
NCTC 11639 CagA (cagA
) gene
GQ161099 .1
1282
96%
0.0
Helicobacter pylori
ceppo 114C urea ( urea) gene
GQ403154.1
630
96-98%
3e-164 1e-177
Helicobacter
prodotti di PCR genere-specifico derivato da dunnart estratti DNA gastrica sono stati confrontati con H. pylori
sequenze Genbank elencate nella Tabella. I campioni dunnart esposti 100% di identità di sequenza con rRNA 16S da cinque isolati umani clinici di H. pylori
, e 96-98% di identità di sequenza con cagA e Urea
da due isolati clinici umani di H. pylori
.
Il importante H. pylori
fattore di virulenza, CAG
PAI (CAG
patogenicità isola) codifica per un sistema di secrezione di tipo IV che coinvolge cagA. Non tutti H. pylori
ceppi possiedono questo fattore di virulenza, e gli individui infettati con cag PAI
ceppi positivi tipicamente sviluppare più grave gastrite, e hanno un notevolmente aumentato rischio di progressione di malattia. Ureasi, un enzima composto da due subunità Urea Comprare e ureB
, è essenziale per la patogenesi di H. pylori
nello stomaco umano a causa della sua capacità di neutralizzare l'acido gastrico attraverso la produzione di bicarbonato. Analisi utilizzando specifici primer PCR ha rivelato che l'Helicobacter infettare
erano cagA
e urea
positivo, e sequenziamento del gene ha rivelato 96% di identità con cagA
e 96-98% di identità con urea
da H . pylori
(Tabella 1).
naturale perdita di H. pylori
infezione nel Stripe-affrontato Dunnart colonia
Quando i campioni sono stati raccolti da 18 dunnarts femminili nel luglio del 2008 sorprendentemente, tutti questi animali erano Helicobacter
negativo che indica la colonia aveva perso l'infezione. Non c'è una spiegazione evidente per la perdita di H. pylori
infezione in questi animali, in quanto non vi è stato alcun cambiamento in allevamento, né sono state le dunnarts trattati con un qualsiasi antibiotici durante questo periodo.
Per chiarezza, una cronologia della sopra gli eventi sono riassunti nella Tabella 2. la colonia Dunnart presso il Dipartimento di Zoologia presso l'Università di Melbourne è stato chiuso nel 2009, precludendo ulteriormente study.Table 2 Cronologia degli eventi
Data
evento
luglio-Dicembre 2003
aumento della mortalità osservata in dunnart colonia con sanguinamento gastrico.
maggio 2004
stomaci Due dunnart sono stati testati e dimostrato di essere Helicobacter
positivo test di CLO. Istologia rivelato gastrite lieve.
Luglio-Dicembre 2004
aumento della mortalità osservata in Dunnart colonia con sanguinamento gastrico.
2006
feci dunnart dimostrato di essere Helicobacter
positivo mediante PCR.
2007
stomaci dunnart dimostrato di essere Helicobacter
positivo per PCR. L'infezione ha dimostrato di essere H. pylori
da sequenziamento parziale del 16S rRNA
, cagA
e urea
.
2008
Dunnart colonia dimostrato di essere Helicobacter
negativo PCR di tessuti gastrici.
Discussione
Due focolai di aumento della mortalità in una colonia del marsupiale australiano, la banda-affrontato Dunnart nel 2003 e 2004 sono stati associati con sanguinamento gastrico e si è verificato coincidenza con una infezione transitoria di stomaco dei animali in questa colonia con il patogeno umano, H. pylori
. In particolare, questo ceppo infettante possedeva il fattore di virulenza cagA
, il che suggerisce la presenza del cag
sistema di secrezione di tipo IV PAI, associata ad un aumentato rischio di sviluppare il cancro gastrico o ulcera peptica negli esseri umani. Mentre solo cinque dei campioni nove dunnart analizzati erano cagA
e urea
positivo, questo può essere spiegato con la bassa quantità di Helicobacter
DNA in questi campioni, anche se la possibilità di eterogeneità nei ceppi che infettano non può essere escluso.
'stato un peccato non siamo riusciti a coltivare Helicobacter
dallo stomaco dunnart, in quanto ciò potrebbe ci hanno permesso di studiare il livello di eterogeneità, se del caso, di questi batteri nella colonia. I primi tentativi di coltivare Helicobacter
sono stati eseguiti a Perth, Western Australia, su campioni inviati da Melbourne. Il ritardo causato dalla raccolta e il trasferimento di questi campioni può aver limitato la nostra capacità di isolare i batteri infettanti. Tuttavia, in studi successivi abbiamo tentato di coltivare loro di tessuto gastrico fresco. Tiri nello tessuto fresco utilizzando piastre di HBA fallito, non troppo sorprendentemente, a causa della crescita eccessiva di funghi. Quando sono stati utilizzati piastre selettive GSSA, siamo riusciti a inizialmente cultura un batterio motile, ma questo è stato successivamente coperto da un organismo coccoidi. Abbiamo poi tentato un approccio di filtrazione, che ha limitato con successo la contaminazione da parte dell'organismo coccoidi, ma purtroppo anche non ci ha permesso di isolare Helicobacter
. Ciò potrebbe suggerire l'Helicobacter
presente nei dunnarts sia dovuto scarsa motilità (una caratteristica importante necessario per la migrazione dei batteri attraverso la carta filtro) o erano presenti solo nei livelli bassi.
AS H. pylori
infezione non non sembrano essere parte della normale flora di questi animali (in quanto spontaneamente cancellata tra il 2007 e il 2008) si teorizzare che H. pylori
potrebbe essere entrato in questa colonia come un'infezione da loro gestori umani. La concomitante presenza di infezione allo stomaco da H. pylori
al momento degli incidenti sanguinamento gastrico suggerisce fortemente questo batterio può aver contribuito allo scoppio della malattia. Chiaramente, H. pylori
infezione da sola non era sufficiente a causare le epidemie come l'infezione era presente nel periodo 2005-2007, senza alcun aumento della mortalità. Tuttavia, può anche essere stato un importante co-fattore in questo processo.
La perdita di H. pylori
infezione tra il 2007 e il 2008 è intrigante, con la ragione di questo evento rimanendo sconosciuta. Helicobacter Dato
erano presenti per almeno tre anni, non è stato un fenomeno di breve termine, ma era presente nel corso di molti cicli di allevamento. Sembra quindi improbabile che la perdita di questa infezione era dovuto al Helicobacter
essere fuori-gareggiato da flora autoctona, anche se questa possibilità non può essere esclusa. È anche possibile che gli animali non trasmettevano l'infezione tra loro, ma forse venivano costantemente infettate da un gestore umana. Se questo fosse il caso, la perdita di infezione potrebbe essere stato a causa di un cambiamento di gestore tra il 2007 e il 2008 la rottura della trasmissione dell'infezione.
Lo stress sembra essere stato un importante cofattore nell'eziologia della malattia, come si sono svolti i focolai durante la stagione riproduttiva in questi animali. La stagione riproduttiva è estremamente stressante per entrambi dunnarts maschile e femminile, in un anno medio, è accompagnata da una notevole perdita di peso corporeo. I marsupiali possono essere notevolmente sensibile allo stress, ed è stato dimostrato che gli eventi lo stress può avere un importante effetto sul loro sistema immunitario [22].
Nonostante questo, ci deve essere un altro co-fattore causale o coinvolti nel 2003-2004 epidemie, come i dunnarts allevati mentre infettati da H. pylori
nel periodo 2005-2007, senza alcun aumento del tasso di mortalità. Questo co-fattore rimane non identificato, ma non sembra essere tutto ciò che riguarda l'allevamento in quanto non vi sono stati cambiamenti nelle condizioni abitative della colonia che sono stati associati sia con i focolai di malattia o la perdita di H. pylori
infezione.
in conclusione, proponiamo che l'infezione con il patogeno H. pylori umana
potrebbe essere stato un elemento essenziale, anche se non sufficiente co-fattore in un focolaio di sanguinamento gastrico con conseguente morte in una colonia di dunnarts Stripe facce. L'infezione apparente accidentale di questi marsupiali dai loro gestori umani, e l'associazione con una coincidenza patologia gastrica, suggerisce che questi animali possono fornire un interessante modello animale romanzo per lo studio di H. pylori
patogenesi. Inoltre, questa osservazione suggerisce un potenziale fattore di rischio per marsupiali in cattività a infezioni portati dai loro gestori umani.
Dichiarazioni
Ringraziamenti
Gli autori non hanno interessi in competizione. Riconosciamo l'appoggio di Kamani Nanayakkara, Phil Au, Angela Nazione e Ellen Menkhorst per la zootecnia e l'assistenza con la raccolta di campioni. La colonia è stato sostenuto da un finanziamento della Fondazione Nuova Zelanda per la Scienza e la Tecnologia.
Autori fascicoli presentati originali per
di seguito sono riportati i link ai file degli autori originali inviati per le immagini. 'file originale per la figura 1 13567_2010_22_MOESM2_ESM.pdf Autori 13567_2010_22_MOESM1_ESM.pdf autori file originale per la figura 2 interessi in competizione
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.

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