transmission de Helicobacter pylori chez l'homme a-t provoquer une épidémie dans une colonie de Stripe face dunnarts (Sminthopsis macroura)?

transmission de Helicobacter pylori
de l'homme a causé une épidémie dans une colonie de Stripe face dunnarts (Sminthopsis macroura
)?
Résumé
Depuis la découverte que Helicobacter pylori
provoque une gamme de pathologies dans les estomacs des humains infectés, il est devenu évident que Helicobacters
se trouvent dans un large éventail d'animaux espèces où ils sont souvent associés à la maladie. En 2003 et 2004, il y avait deux foyers de mortalité accrue associés à des saignements gastriques et la perte de poids dans une colonie captive du marsupial australien, le Dunnart Stripe-face (Sminthopsis macroura
). La présence de la pathologie gastrique conduit à une enquête sur la pathogenèse du potentiel Helicobacter chez ces animaux. L'examen histologique a révélé la présence d'une gastrite et une analyse par PCR a confirmé la présence de Helicobacter de l'infection dans l'estomac de ces marsupiaux. Étonnamment, le séquençage de l'ARNr 16S de ces bactéries a identifié les espèces comme H. pylori
et PCR a confirmé la souche à être positive pour le facteur de la pathogenèse importante, cagA
. Nous décrivons donc, pour la première fois, une infection zoonotique inverse apparente de Stripe face dunnarts à H. pylori
. Déjà sujette à des effets pathologiques de stress (telle que vécue pendant la saison de reproduction), l'infection concomitante H. pylori semble être une possible co-facteur essentiel mais pas suffisant saignements gastriques prototypique et la perte de poids dans ces marsupiaux. Le Dunnart de Stripe-face pourrait représenter un nouveau modèle pour l'étude Helicobacter de pathologie gastrique -Driven. Introduction Les infections causées par leurs maîtres humains, en particulier de H. pylori
, peuvent être un risque potentiel pour les colonies captives de marsupiaux.
La découverte de Helicobacter pylori
a finalement conduit à une prise de conscience que l'infection de la estomac humain avec cette bactérie est un facteur étiologique clé dans le développement de la maladie de l'ulcère gastro-duodénal et adénocarcinome gastrique [1-3]. Une autre conséquence importante de cette découverte a été l'identification subséquente de toujours plus une famille, apparemment omniprésent des espèces Helicobacter qui infectent le tractus gastro-intestinal de pratiquement tous les animaux examinés. En fait, les infections de nombreux Helicobacter sont soupçonnés d'être pathogènes et peut-être responsable d'une large gamme de conditions dans de nombreuses espèces animales (revue dans [4, 5]). Par exemple, les infections à Helicobacter pylori naturel ont été associés à la gastrite chez les chats petits et grands, les chiens, les porcs et les furets [6-10], l'avortement chez les moutons [11], la colite et de l'hépatite chez des singes rhésus [12], les ulcères les dauphins et les baleines [13] et de la diarrhée chez les chats et perroquets [14, 15].
dans ce rapport, nous décrivons deux foyers de décès dans une colonie captive d'un marsupial australien, le Dunnart Stripe-face (Sminthopsis macroura
), qui ont été associés à des saignements dans l'estomac peut-être due à l'infection par l'agent pathogène humain, H. pylori
. Matériaux et méthodes
dunnarts __gVirt_NP_NN_NNPS<__ Stripe face
les dunnarts Stripe à face ont été logés au Département de zoologie, Université de Melbourne. La colonie a eu lieu dans les cages maintenues dans un bâtiment de température régulée construit à cet effet, dans un environnement physique dans des conditions typiques pour ceux pour les souris de logement, sauf que l'éclairage naturel a été maintenue. Logement des animaux dans des cages spécialement conçues, le régime alimentaire formulé pour marsupiaux carnivores et insectivores suivi de la reproduction a suivi le contour donné précédemment [16]. Aucune autre espèce d'animaux ont été logés dans ce bâtiment. Les dunnarts ont été fournis l'eau ad libitum. Aucun dunnarts ont été tués spécifiquement pour cette étude; estomacs n'ont été recueillies à partir d'animaux euthanasiés, soit en raison d'une maladie ou pour d'autres expériences approuvées par l'Université de Melbourne Science, Optometry & Vision Sciences et Land & Environnement éthique animale-comité. Les animaux ont été pesés à des intervalles hebdomadaires pendant l'élevage de routine
rapide test uréase (test CLO)
biopsies d'estomac de 1-2 mm ont été placés dans le gel d'un test rapide à l'uréase (CLOtest;. Kimberly-Clark, Roswell, Géorgie, États-Unis). Des essais ont été suivis sur une période de 24 h pour un changement de couleur du jaune au rouge qui indique la présence d'un organisme uréase produisant dans l'estomac.
Évaluation histologique de la pathologie
moitiés de l'estomac ont été fixés dans 10% du formol tamponné neutre , inclus dans la paraffine, puis 4 sections um d'épaisseur
détection de Helicobacter de l'infection coupées et colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. par
PCR spécifique de genre Pour l'évaluation de l'Helicobacter de l'infection par PCR, les fèces étaient recueillis, ou les estomacs dunnart ont été ouverts le long de la courbure intérieure et l'organe entier homogénéisé (GmbH Polytron homogénéisateur; Kinematica, Suisse). grattages muqueux ont également été recueillies à partir de l'intestin (grandes et petites). L'ADN a été extrait des matières fécales et des raclures intestinales en utilisant un kit QIAamp d'ADN de selles (Qiagen, Hilden, Allemagne) et de l'estomac homogénéise à l'aide du kit d'ADN tissulaire QIAamp (Qiagen) selon les instructions du fabricant. Un Helicobacter de genre PCR ciblant un fragment de 374 pb du gène ARNr 16S a été réalisée comme décrit précédemment [17].
Approches pour cultiver dunnart Helicobacter gastrique
dunnart estomacs ont été recueillies et homogénéisé dans le Coeur du cerveau un bouillon d'infusion (BHI; Oxoid, Basingstoke, Royaume-Uni). Homogénat a été ajouté à la gélose au sang de cheval ou plaques GSSA (comme décrit précédemment [18]) qui ont été incubées dans un bocal anaérobie avec un kit de génération de gaz microaérophile (Oxoid, Basingstoke, Royaume-Uni) pour un maximum de 10 jours à 37 ° C. Pour la technique de filtration, homogénat a été placé sur 0,65 um papier filtre Whatman (GE Healthcare, Rydalmere, Australie), placé sur des plaques d'adaptateur de bus hôte, et on fait incuber à 37 ° C dans des conditions microaérophiles pendant 2 h. Les filtres ont été ensuite enlevés et les plaques incubées à 37 ° C dans des conditions microaérophiles pour un maximum de 10 jours. Séquençage
génique de l'ARN ribosomal 16S
, cagA
et ureA
échantillons Neuf ADN extrait de dunnart estomac et des raclures intestinales ont été soumis à un séquençage. RFP pour les gènes Helicobacter ont été réalisées comme décrit précédemment pour 16S ARNr
[17], cagA
[19] et ureA
[20]. Le séquençage d'ADN des produits positifs de PCR a été réalisée au moyen du terminateur chimie BigDye (Applied Biosystems, Foster City, États-Unis). Le séquençage des deux extrémités 5 'et 3' des amplicons a eu lieu dans un volume de 20 ul constitué de 3,5 ul de tampon de séquençage, 1 pi BigDye v3.1, 10 pmol /pl de l'amorce nécessaire, 40-100 ng d'ADN, et eau pour compléter le volume final. Le programme de séquençage est composée de 96 ° C pendant 1 min, 30 cycles de 96 ° C pendant 10 secondes, 50 ° C pendant 5 min et 60 ° C pendant 4 min. Les Morts Les résultats Les séquences ont été comparées à des séquences de gènes des identités connues en utilisant le programme de recherche BLASTn disponibles par le biais du Centre national d'information sur la biotechnologie (NCBI) site web [21] de dans un Stripe-face Dunnart colonie -., 2003
Une colonie de Stripe face dunnarts a été en existence depuis 26 ans, d'abord à la Trobe University (Melbourne, Australie), puis au Département de zoologie, Université de Melbourne. La colonie a normalement entre 60-100 animaux dans lesquels le sex-ratio est 1/1. La mort de la maladie est rare chez ces animaux et dans une année normale, le total des décès se produisent à un taux d'environ 10% ou moins du nombre d'animaux dans la colonie. La plupart des décès se produisent à la suite de blessures obtenues lors de l'accouplement (les courses de la saison de reproduction de Juillet à Décembre) ou la vieillesse.
En 2003, cependant, il y a eu une augmentation spectaculaire du taux de ces animaux de mortalité, avec 29% de la dunnarts (30/104; nombres similaires de mâles et femelles) qui meurent dans la période de 6 mois de Juillet à Décembre. Les animaux morts étaient âgés de 1-2 ans, et les décès ne sont pas liés à la vieillesse. Dunnarts perdent habituellement le poids corporel au cours de la saison de reproduction et cette perte de poids a également été notamment augmenté en 2003. Homme dunnarts généralement perdre un poids corporel moyen de 12% de Juillet à Décembre, mais en 2003, ils ont perdu une moyenne de 27,7%. De même, dunnarts femmes ont perdu une moyenne de 30,3% au cours de la même période en 2003, comparativement à une perte moyenne typique de 16%. La figure 1 montre la perte de poids observée par ces dunnarts en 2003, par rapport à la perte de poids observée en 2006, une année typique dans laquelle il n'y avait pas une mortalité accrue. Figure 1 Augmentation de la perte de poids corporel en Stripe-face Dunnart lors de flambées de maladies. Les valeurs indiquées présente la variation moyenne du poids corporel ± S.E.M. des rayures face dunnarts en Juillet-Décembre (calculé comme le poids des animaux individuels en Septembre et Décembre en pourcentage de leur poids en Juillet). Les données indiquées sont d'une année de l'éclosion de la maladie (2003; n
= 25) et une année normale lorsque aucune augmentation de la mortalité a été observée (2006; n
= 35). Les mâles et les femelles sont inclus et les données combinées, les deux sexes ont perdu du poids corporel similaires. Il n'y avait pas de différence significative du poids corporel en Septembre 2003 et 2006. Cependant, les animaux ont perdu significativement plus de poids dans la période allant jusqu'à Décembre 2003, par rapport à la même période en 2006 (* p
< 0,001; ANOVA).
La seule pathologie évidente observée au niveau post mortem est que près de la moitié des animaux qui sont morts ou ont été abattus en raison d'être très malade avait une hémorragie gastrique sévère. En dehors de l'augmentation de la perte de poids, la plupart des animaux semblaient en bonne santé jusqu'à 1-2 jours avant la mort, bien que quelques-uns avaient des selles noires (compatibles avec des saignements gastro-intestinaux) et des signes d'anémie (museaux pâles et des gencives).
Décès dans un Stripe-face dunnart colonie - 2004
le saignement gastrique présente chez ces animaux a soulevé la possibilité d'ulcération gastrique à la suite de Helicobacter de l'infection. Par conséquent, en mai 2004, les estomacs de deux dunnarts femmes asymptomatiques ont été testées pour l'infection à Helicobacter pylori en utilisant le test CLO. Ceux-ci se sont avérés positifs, favorables à une infection gastrique Helicobacter
. L'analyse histologique de ces estomacs a révélé la présence d'un processus inflammatoire relativement doux, marqué par des agrégats lymphoïdes dans la lamina propria (Figure 2), même si aucune bactérie colonisant en spirale ou sous forme cocciforme ont pu être observées dans ces sections. Aucune pathologie sévère était évidente dans ces sections particulières, bien que ces estomacs ont été recueillies en dehors de la saison de reproduction où une mortalité accrue et des saignements gastriques a été ne se produisent pas. Figure 2 Inflammation dans la lamina propria gastrique d'un Helicobacter Dunnart infectés par l. Une image est affichée à partir d'un ampli H &; section du corpus gastrique E tachée, à partir d'un Helicobacter
Dunnart infectés par l (grossissement x 100). L'estomac a été recueilli en mai 2004.
Entre Juillet et Décembre 2004, un second incident de mortalité accrue a eu lieu, avec 24 sur 81 (30%) de la colonie Dunnart mourant, dont 6 avait des saignements gastriques.
Dans plusieurs cas en 2003 et 2004, les femmes qui ont été considérées comme étant enceinte de la surveillance de la reproduction avait interrompu la litière quand ils ont été examinés pour obtenir des embryons.
Helicobacter de l'infection dans la Dunnart colonie 2005-2008
en 2005, et dans les années suivantes, le taux de mortalité est revenu à des niveaux normaux (~ 10% par an) et aucun autre cas de saignements gastriques ont été observés. Cependant des tentatives sporadiques ont été faites pour examiner plus en détail l'Helicobacter gastrique apparente de l'infection chez ces animaux. Ces tentatives ont été limitées par la disponibilité des animaux pour de telles études.
En 2006, la présence d'Helicobacter
dans des échantillons fécaux prélevés mâle (n
= 20) et femelle (n = 20
) dunnarts ont été évalués par genre PCR spécifique. En utilisant cette approche, les matières fécales des nombres équivalents de mâle (7/20) et femelle dunnarts (7/20) Stripe à face ont été montrés à être colonisé par des espèces Helicobacter, fournissant des preuves de la présence de Helicobacters
dans tractus gastro-intestinal d'au moins une partie des animaux de cette colonie. Les tentatives de cultiver Helicobacter
à partir de ces échantillons ont été infructueuses.
En Juillet 2007, les estomacs et les raclures intestinales recueillies auprès de dunnarts ont été analysés par PCR spécifique du genre. Ceux-ci ont montré que 10/12 des animaux examinés avaient Helicobacter gastrique
infection. L'identification des espèces de Encore une fois, les tentatives de cultiver Helicobacter
à partir des échantillons gastriques ont été infructueuses. Helicobacter de l'infection dans le Dunnart estomac
Pour identifier si une ou des espèces connues de roman Helicobacter infectait le Stripe -faced Dunnart colonie, l'ARN ribosomal 16S
gène
(ARNr) Helicobacter à partir de ces échantillons gastriques a été partiellement séquence. Ceci indique que la séquence du gène de l'ARNr 16S de Helicobacter
infectant les estomacs de Stripe face dunnarts correspondait à H. pylori
souches isolé à l'origine de différentes régions du tractus gastro-intestinal humain, y compris l'estomac et de l'intestin. Les pourcentages d'identité obtenus avec les séquences étaient de 100% (tableau 1) .Table récupération de Helicobacter séquences de gènes pylori
BLASTn Récupérer
1 BLASTn numéro d'accès GenBank

Score (bits)
identité
E-valeurs
Helicobacter pylori
clone 16S P13 ARN ribosomal
gène
EF684928.1
699
100%
0,0
Helicobacter pylori
souche CD2 16S ribosomal RNA
gène
HM243132.1
699
100%
0,0
Helicobacter pylori
souche HP504 ARN ribosomique 16S
gène
GU449115.1
695
100%
0.0
Helicobacter pylori
v225d 16S ARN ribosomique
gène
CP001582.1
695
100%
0,0
Helicobacter pylori
souche 407D5 16S ribosomal RNA
gène
HM099656.1
695
100%
0,0
Helicobacter pylori
souche 15818 cytotoxine protéine associée III (cagA de
) gène
AF083352.1
1288
96%
0.0
Helicobacter pylori
NCTC 11639 cagA (cagA
) gène
GQ161099 .1
1282
96%
0,0
Helicobacter pylori
souche 114C UreA ( ureA) gène
GQ403154.1
630
96-98%
3e-164 1E-177
produits de PCR spécifiques de genre Helicobacter dérivé de dunnart extraits d'ADN gastrique ont été comparés avec H. pylori
séquences Genbank énumérés dans le tableau. Les échantillons dunnart présentaient 100% d'identité de séquence avec 16s ARNr de cinq isolats cliniques humains de H. pylori
, et une identité de séquence 96-98% avec cagA et ureA
de deux isolats cliniques humains de H. pylori
.
facteur de virulence de l'importante H. pylori, cag
PAI (cag
île de pathogénicité) code pour un système de sécrétion de type IV impliquant cagA. Les souches de tous H. pylori possèdent pas ce facteur de virulence, et les individus infectés par le cag
souches positives PAI se développent généralement une gastrite plus sévère, et avoir une chance grandement accru de progression vers la maladie. Uréase, une enzyme composée de deux sous-unités ureA
et ureB
, est essentiel pour la pathogenèse de H. pylori dans l'estomac
humaine en raison de sa capacité à neutraliser l'acide gastrique par la production de bicarbonate. Analyse en utilisant des amorces de PCR spécifiques a révélé que le Helicobacter infectant
étaient cagA et
ureA
positif, et le séquençage des gènes a révélé l'identité de 96% avec cagA
et de l'identité de 96-98% avec ureA
de H . pylori
(tableau 1).
perte naturelle de H. pylori
infection dans la Stripe-face Dunnart colonie
Lorsque les échantillons ont été prélevés sur 18 femmes dunnarts en Juillet 2008 étonnamment, tous ces animaux étaient Helicobacter de la négative indiquant la colonie avait perdu l'infection. Il n'y a pas d'explication évidente pour la perte de l'infection de H. pylori chez ces animaux, car il n'y avait pas de changement dans l'élevage, pas plus que les dunnarts traités avec des antibiotiques au cours de cette période.
Pour plus de clarté, une chronologie de la ci-dessus les événements sont résumés dans le tableau 2. la colonie Dunnart dans le département de zoologie à l'Université de Melbourne a été fermé en 2009, ce qui exclut en outre study.Table 2 Chronologie des événements
date
événement
Juillet-décembre 2003
Augmentation de la mortalité observée dans la colonie dunnart avec des saignements gastriques.
mai 2004
estomacs Deux dunnart ont été testés et démontré que Helicobacter
positif par le test CLO. L'histologie a révélé une gastrite légère.
Juillet-décembre 2004
Augmentation de la mortalité observée dans Dunnart colonie avec des saignements gastriques. 2006

fèces dunnart avérés Helicobacter
positifs par PCR.
2007
estomacs dunnart montré pour être Helicobacter
positifs par PCR. L'infection a été démontré que H. pylori
par séquençage partiel de 16S ARNr
, cagA
et ureA
.
2008
Dunnart colonie révélée Helicobacter
négative Rapport de PCR de tissus gastriques.
Deux foyers de mortalité accrue dans une colonie du marsupial australien, le Dunnart de Stripe-face en 2003 et 2004 ont été associés à des saignements gastriques et est survenue fortuite avec une infection transitoire de l'estomac de animaux dans cette colonie avec l'agent pathogène humain, H. pylori
. Notamment, cette souche infectante possédait le facteur de virulence cagA
, ce qui suggère la présence du cag
PAI système de type IV sécrétion, associée à un risque accru de développer un cancer de l'estomac ou des ulcères peptiques chez les humains. Bien que seulement cinq des neuf échantillons analysés étaient dunnart cagA et
urée
positif, ce qui peut être expliqué par la faible quantité de Helicobacter de l'ADN dans ces échantillons, bien que la possibilité d'hétérogénéité dans les souches infectant ne peut pas être exclus.
Il est regrettable que nous étions incapables de cultiver Helicobacter
de l'estomac dunnart, car cela pourrait nous ont permis d'étudier le niveau d'hétérogénéité, le cas échéant, de ces bactéries dans la colonie. Les premières tentatives de cultiver Helicobacter
ont été effectuées à Perth, Western Australia, sur des échantillons envoyés à partir de Melbourne. Le retard causé par la collecte et le transfert de ces échantillons peut avoir limité notre capacité à isoler les bactéries qui infectent. Cependant, dans des études ultérieures, nous avons essayé de les cultiver du tissu gastrique frais. Les tentatives sur tissu frais en utilisant des plaques HBA a échoué, pas trop surprenant, en raison de la prolifération fongique. Lorsque des plaques GSSA sélectifs ont été utilisés, nous avons réussi à d'abord la culture une bactérie motile, mais cela a ensuite été envahi par un organisme cocciforme. Nous avons ensuite tenté une approche de filtration, ce qui restreint avec succès la contamination par l'organisme cocciforme, mais malheureusement aussi ne nous a pas permis d'isoler Helicobacter
. Cela peut suggérer le présent de l'Helicobacter dans les dunnarts avaient soit mauvaise motilité (une caractéristique importante requise pour la migration des bactéries à travers le papier filtre) ou étaient seulement présents dans de faibles niveaux.
Comme H. pylori
infection ne ne semble pas faire partie de la flore normale de ces animaux (comme spontanément effacé entre 2007 et 2008), nous théoriser que H. pylori
ont peut-être entré dans cette colonie comme une infection de leurs gestionnaires humains. La présence concomitante d'une infection de l'estomac avec H. pylori
au moment des incidents de saignement gastrique suggère fortement cette bactérie peut avoir contribué à l'éclosion de la maladie. De toute évidence, l'infection de H. pylori seul était insuffisante pour provoquer les épidémies que l'infection était présente sur la période 2005-2007, sans aucune augmentation de la mortalité. Cependant, il peut bien avoir été un co-facteur important dans ce processus.
La perte de l'infection de H. pylori entre 2007 et 2008 est intrigante, la raison de cet accident reste inconnue. Helicobacter Compte tenu
étaient présents pendant au moins trois ans, il n'a pas été un phénomène à court terme, mais était présent sur de nombreux cycles de reproduction. Il semble donc peu probable que la perte de cette infection était due à l'Helicobacter
étant hors compétition par la flore indigène, bien que cette possibilité ne peut être exclue. Il est également possible que les animaux ne sont pas transmettre l'infection entre eux, mais peut-être sont constamment infectés par un manipulateur humain. Si tel était le cas, la perte de l'infection peut être due à un changement de gestionnaire entre 2007 et 2008 casser la transmission de l'infection.
Le stress semble avoir été un co-facteur important dans l'étiologie de la maladie, comme les foyers sont apparus au cours de la saison de reproduction chez ces animaux. La saison de reproduction est extrêmement stressant pour les deux dunnarts masculins et féminins, et une année moyenne, est accompagnée d'une perte considérable de poids corporel. Marsupiaux peuvent être remarquablement sensibles au stress, et il a été démontré que les événements de stress peuvent avoir un effet majeur sur leur système immunitaire [22].
Malgré cela, il doit y avoir une autre co- ou facteur causal impliqué dans 2003-2004 les épidémies, les dunnarts BRED alors infectés par H. pylori
en 2005-2007, sans aucune augmentation du taux de mortalité. Cette co-facteur n'a pas été identifié, mais il ne semble pas être tout ce qui concerne l'élevage car il n'y a eu aucun changement dans les conditions de logement de la colonie qui ont été associés soit avec les épidémies ou la perte de l'infection de H. pylori maladie.
en conclusion, nous proposons que l'infection par H. pylori pathogène humain
peut avoir été un élément essentiel, mais non suffisante co-facteur dans un foyer de saignements gastriques entraînant la mort dans une colonie de dunnarts Stripe à face. L'infection apparente accidentelle de ces marsupiaux par leurs maîtres humains, et l'association avec une pathologie gastrique coïncidence, suggère que ces animaux peuvent fournir un nouveau modèle animal intéressant pour l'étude de la pathogenèse de H. pylori. En outre, cette observation suggère un facteur de risque potentiel de marsupiaux en captivité à des infections portées par leurs maîtres humains. Des Déclarations
Remerciements
Les auteurs ont aucun conflit d'intérêts. Nous reconnaissons l'appui de Kamani Nanayakkara, Phil Au, Angela Nation et Ellen Menkhorst pour l'élevage et de l'assistance à la collecte d'échantillons. La colonie a été appuyée par un financement de la Fondation Nouvelle-Zélande pour la science et la technologie.
Auteurs fichiers originaux soumis pour les images
Voici les liens vers les auteurs originaux soumis les fichiers pour les images. de fichier d'origine pour la figure 1 13567_2010_22_MOESM2_ESM.pdf Auteurs 13567_2010_22_MOESM1_ESM.pdf Auteurs fichier d'origine pour la figure 2 Intérêts concurrents
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts.

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