Fez a transmissão do Helicobacter pylori em humanos causar um surto de doença em uma colônia de Dunnarts Stripe-faced (Sminthopsis macroura)?

Será que a transmissão do Helicobacter pylori
dos seres humanos causar um surto de doença em uma colônia de Dunnarts Stripe-faced (Sminthopsis macroura
)?
Abstract
Desde a descoberta de que Helicobacter pylori
causa uma gama de patologias nos estômagos dos humanos infectados, tornou-se evidente que Helicobacters
são encontrados em uma grande variedade de espécies animais que são frequentemente associados com a doença. Em 2003 e 2004, houve dois surtos de aumento da mortalidade associadas a hemorragia gástrica e perda de peso em uma colônia cativo do marsupial australiano, o sminthopsis Stripe-enfrentado (Sminthopsis macroura
). A presença da patologia gástrica conduziu a uma investigação da potencial Helicobacter
patogénese nestes animais. O exame histológico revelou a presença de gastrite, e análise de PCR confirmou a presença de infecção por Helicobacter
nos estômagos desses marsupiais. Surpreendentemente, a sequenciação do 16S rRNA a partir destas bactérias identificada a espécie como H. pylori Comprar e PCR confirmou a tensão a ser positivo para o importante fator de patogênese, cagA
. Nós, portanto, descrever, pela primeira vez, uma infecção zoonótica reverso aparente de Dunnarts Stripe-faced com H. pylori
. Já propenso a efeitos patológicos de estresse (como experimentadas durante a época de reprodução), infecção concomitante H. pylori
parece ser uma possível co-fator essencial, mas não suficiente sangramento gástrico prototypic e perda de peso nestes marsupiais. O sminthopsis enfrentou-Stripe poderia representar um novo modelo para investigar Helicobacter
patologia gástrica -driven. Infecções de seus tratadores humanos, especificamente do H. pylori
, pode ser um risco potencial para colónias em cativeiro de marsupiais.
Introdução
A descoberta do Helicobacter pylori
levou a uma percepção de que a infecção do estômago humano com a bactéria é um factor etiológico fundamental no desenvolvimento da doença de úlcera péptica e o adenocarcinoma gástrico [1-3]. Outra consequência importante do que a descoberta tem sido a identificação posterior de um cada vez maior, família aparentemente onipresente de Helicobacter
espécies que infectam o trato gastrointestinal de praticamente todos os animais examinados. Na verdade, muitas infecções de Helicobacter
são acreditados para ser patogénica e possivelmente responsáveis ​​por uma ampla gama de condições em numerosas espécies animais (revisto em [4, 5]). Por exemplo, infecções por Helicobacter naturais
têm sido relacionados com gastrite em pequenas e grandes gatos, cães, porcos e furões [6-10], o aborto em ovinos [11], colite e hepatite em macacos rhesus [12], úlceras golfinhos e baleias [13] e diarreia em gatos e papagaios [14, 15].
neste relatório nós descrevemos dois surtos de mortes em uma colônia em cativeiro de um marsupial australiano, o sminthopsis Stripe-enfrentado (Sminthopsis macroura
), que foram associados com hemorragia no estômago, possivelmente devido à infecção pelo patógeno humano, H. pylori
.
Materiais e métodos
Stripe-faced dunnarts
os dunnarts Stripe-enfrentados foram alojados em do Departamento de Zoologia da Universidade de Melbourne. A colônia foi realizada dentro de gaiolas mantidas dentro de uma temperatura regulada edifício construído propositadamente, em um ambiente físico em condições típicas para aqueles para os ratos de habitação, exceto que a iluminação natural foi mantida. alojamento dos animais em gaiolas especialmente concebidos, a dieta formulada para marsupiais insetívoros carnívoras e monitoramento reprodutivo seguido o esquema apresentado anteriormente [16]. Não há outras espécies animais foram alojados neste edifício. Os dunnarts foram fornecidos água ad libitum. Não dunnarts foram mortos especificamente para este estudo; estômagos de animais apenas foram coletadas de animais sacrificados, quer devido a doença ou por outra experimentação aprovado pela Universidade de Melbourne Ciência, Optometria & Ciências da Visão e Land & Ambiente dos animais ética-comité. Os animais foram pesados ​​em intervalos semanais durante pecuária rotina
O teste rápido de urease (teste CLO)
biópsias do estômago de 1-2 mm foram colocadas no gel de um teste rápido da urease (CLOtest;. Kimberly-Clark, Roswell, Geórgia, EUA). Os testes foram monitorizados ao longo de um período de 24 h por uma mudança de cor de amarelo para vermelho, que indicou a presença de um organismo produtor de urease no estômago.
A avaliação histológica de patologia
metades do estômago foram fixados em formalina a 10% tamponada neutra , embebidos em parafina, em seguida, 4 seções mm de espessura e corados com hematoxilina e eosina.
detecção da infecção pelo Helicobacter
por gênero específico PCR
Para avaliação da Helicobacter
infecção por PCR, as fezes foram recolhido, ou estômagos sminthopsis foram abertos ao longo da curvatura interior e a todo o órgão homogeneizado (homogeneizador Polytron GmbH; Kinematica, Suíça). raspagens da mucosa também foram coletadas a partir do intestino (grandes e pequenos). O DNA foi extraído a partir de fezes e raspados do intestino utilizando um kit de DNA QIAamp fezes (Qiagen, Hilden, Alemanha), e a partir do estômago homogeneizada utilizando o kit de ADN tecido QIAamp (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Um género Helicobacter
PCR para um fragmento de 374 pb do gene de ARNr 16S foi realizada como previamente descrito [17].
Abordagens para cultivar sminthopsis gástrica Helicobacter
sminthopsis estômagos foram recolhidas e homogeneizadas em Brain Heart caldo de infusão (BHI; Oxoid, Basingstoke, UK). O homogeneizado foi adicionada ao ágar de sangue de cavalo ou placas GSSA (como descrito anteriormente [18]), que foram incubadas num frasco anaeróbio com um kit de gás gerador de microaerofilia (Oxoid, Basingstoke, UK) durante até 10 dias a 37 ° C. Para a técnica de filtração, homogenato foi colocado em 0,65 uM de papel de filtro Whatman (GE Healthcare, Rydalmere, Austrália), colocados em placas de HBA, e incubou-se a 37 ° C sob condições microaerofílicas durante 2 h. Os filtros foram então removidas e as placas incubadas a 37 ° C sob condições de microaerofilia por até 10 dias.
Gene sequenciamento de 16S RNA ribossomal
, cagA
e uréia
amostras de DNA extraídas de Nine sminthopsis estômago e raspados do intestino foram submetidos a sequenciação. PCRs para Helicobacter
genes foram realizadas como descrito anteriormente para 16S rRNA
[17], cagA
[19] e uréia
[20]. A sequenciação de ADN dos produtos de PCR positivos foi feita por meio da química de terminador BigDye (Applied Biosystems; Foster City, EUA). A sequenciação de ambas as extremidades 5 'e 3' dos fragmentos amplificados ocorreu num volume de 20 uL que consiste em 3,5 ul de tampão de sequenciação, 1 uL BigDye v3.1, 10 pmol /uL de iniciador necessária, 40-100 ng de DNA, e água para perfazer o volume final. O programa de sequenciação consistiu de 96 ° C durante 1 min, 30 ciclos de 96 ° C durante 10 segundos, 50 ° C durante 5 min e 60 ° C durante 4 min. . As seqüências foram comparadas com sequências de genes de identidades conhecidos usando o programa de pesquisa BLASTn disponível através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) website [21]

Resultados mortes em um enfrentaram-Stripe sminthopsis colónia - 2003
a colônia de Dunnarts Stripe-faced já existe há 26 anos, inicialmente em La Trobe University (Melbourne, Austrália), e depois no Departamento de Zoologia da Universidade de Melbourne. A colónia tem normalmente entre 60-100 animais em que a proporção entre os sexos é de 1/1. A morte por doença é rara nestes animais e num ano normal, total de mortes ocorrem a uma taxa de cerca de 10% ou menos do número de animais na colónia. A maioria das mortes ocorrem como resultado de ferimentos obtidos durante o acasalamento (a época de reprodução vai de Julho a Dezembro) ou velhice.
Em 2003 porém, houve um aumento dramático na taxa de mortalidade desses animais, com 29% do Dunnarts (30/104; números semelhantes de homens e mulheres) que morrem no período de 6 meses de julho a dezembro. Os animais que morreram eram 1-2 anos e as mortes não estavam relacionadas com a velhice. Dunnarts geralmente perdem peso corporal durante a época de reprodução e esta perda de peso também foi notavelmente aumentada durante 2003. Masculino Dunnarts normalmente perdem um peso médio de 12% do corpo de julho a dezembro, mas em 2003 eles perderam uma média de 27,7%. Da mesma forma, do sexo feminino Dunnarts perderam uma média de 30,3% durante o mesmo período em 2003, em comparação com uma perda média típica de 16%. A Figura 1 mostra a perda de peso relativa observada por estes Dunnarts em 2003, em comparação com a perda de peso observada em 2006, um ano típica em que não houve aumento da mortalidade. Figura 1 O aumento da perda de peso corporal em sminthopsis Stripe-enfrentado durante surto de doença. Os valores mostrados presente a variação média nos pesos corporais �e.p.m de Dunnarts Stripe-enfrentado durante Julho-Dezembro (calculado como o peso de cada animal em setembro e dezembro como uma percentagem do seu peso em julho). Os dados apresentados são de um ano do surto da doença (2003; n
= 25) e um ano normal quando não se observou aumento da mortalidade (2006; n
= 35). Os machos e as fêmeas são incluídos e os dados combinados, como ambos os sexos perdeu pesos corporais semelhantes. Não houve diferença significativa no peso corporal em Setembro de 2003 e 2006. No entanto, os animais perderam significativamente mais peso no período até dezembro de 2003, em comparação com o mesmo período de 2006 (* p Art < 0,001; ANOVA).
a única patologia evidente observado em post mortem foi que quase metade dos animais que morreram ou foram abatidos devido a estar muito doente teve hemorragia gástrica grave. Além do aumento da perda de peso, a maioria dos animais parecia saudável até 1-2 dias antes da morte, embora alguns tinham fezes pretas (consistente com hemorragia gastrointestinal) e sinais de anemia (focinhos pálidos e gengivas).
Mortes em um Stripe-faced sminthopsis colónia - 2004
o sangramento gástrico presente nestes animais levantou a possibilidade de úlceras gástricas, como resultado da infecção por Helicobacter
. Por isso, em Maio de 2004, estômagos de dois Dunnarts femininos assintomáticos foram testados para Helicobacter
infecção utilizando o teste CLO. Estes foram encontrados para ser positivo, de suporte de um Helicobacter
infecção gástrica. A análise histológica desses estômagos revelou a presença de um processo inflamatório relativamente suave, marcados por agregados linfóides na lâmina própria (Figura 2), ainda que sem bactérias colonizadoras em espiral ou qualquer forma cocóide pode ser observado nestas secções. Nenhuma patologia grave foi evidente nessas secções específicas, embora estes estômagos foram coletadas fora da época de reprodução, quando o aumento da mortalidade e sangramento gástrico não estava ocorrendo. Figura 2 Inflamação na lâmina gástrico de uma Helicobacter infectados sminthopsis. Uma imagem é mostrada de um amplificador H &; E seção do corpo gástrico manchado, a partir de uma Helicobacter
infectados sminthopsis (ampliação x 100). O estômago foi recolhido em Maio de 2004.
Entre julho e dezembro de 2004, um segundo incidente do aumento da mortalidade ocorreu, com 24 dos 81 (30%) da colônia sminthopsis morrendo, 6 dos quais tiveram sangramento gástrico.
Em vários casos em 2003 e 2004, as fêmeas que foram considerados estar grávida do monitoramento reprodutivo tinha abortado o lixo quando eles foram examinados para obter embriões.
infecção por Helicobacter
na sminthopsis colônia 2005-2008
em 2005, e nos anos seguintes, a taxa de mortalidade retornou aos níveis normais (~ 10% ao ano) foram observadas e não mais casos de sangramento gástrico. No entanto tentativas esporádicas foram feitas para examinar melhor a infecção do Helicobacter gástrica aparente
nestes animais. Essas tentativas foram limitadas pela disponibilidade de animais para tais estudos.
Em 2006, a presença de Helicobacter
em amostras fecais coletadas de sexo masculino (n
= 20) e feminino (n
= 20) Dunnarts foram avaliados por PCR género específico. Usando essa abordagem, as fezes de números equivalentes de sexo masculino (7/20) e feminino Dunnarts (7/20) Stripe-enfrentados foram mostrados para ser colonizados por Helicobacter
espécies, fornecendo evidências da presença de Helicobacters
em o tracto GI de, pelo menos, alguns animais nesta colónia. As tentativas para cultivar Helicobacter
a partir dessas amostras foram infrutíferas.
Em julho de 2007, estômagos e raspados do intestino coletados de Dunnarts foram analisados ​​por PCR específico do género. Estes mostraram que 10/12 dos animais examinados tinha gástrica Helicobacter
infecção. Mais uma vez, as tentativas de cultivar a Helicobacter
das amostras gástricas foram infrutíferas.
A identificação das espécies da infecção pelo Helicobacter
na sminthopsis estômago
Para identificar se um conhecido ou um romance Helicobacter
espécie foi infectar a listra -faced sminthopsis colónia, o 16S ribosomal RNA
gene (rRNA) Helicobacter
a partir dessas amostras gástricas foi parcialmente sequenciado. Isto indicou que o rRNA 16S
sequência do gene do Helicobacter
infectar os estômagos de Dunnarts Stripe-faced correspondeu a H. pylori
cepas originalmente isoladas de diferentes regiões do trato gastrointestinal humano, incluindo o estômago e intestino. As percentagens de identidade obtidos com as sequências foram de 100% (Tabela 1) .table recuperação 1 BLASTn de sequências de genes pylori Helicobacter
BLASTn Recuperar
número de acesso GenBank
Score (bits)
identidade
E-valores
Helicobacter pylori
clone P13 16S RNA ribossomal
gene
EF684928.1
699
100%
0,0
Helicobacter pylori
estirpe CD2 16S RNA ribossomal
gene
HM243132.1
699
100%
0,0
Helicobacter pylori
tensão 16S HP504 RNA ribossomal
gene
GU449115.1
695
100%
0,0
Helicobacter pylori
v225d 16S RNA ribossomal
gene
CP001582.1
695
100%
0,0
Helicobacter pylori
estirpe 407D5 16S RNA ribossomal
gene
HM099656.1
695
100%
0,0
Helicobacter pylori
estirpe 15818 citotoxina associada proteína III (cagA
) gene
AF083352.1
1288
96%
0.0
Helicobacter pylori
NCTC 11639 cagA (cagA
) gene
GQ161099 0,1
1282
96%
0,0
Helicobacter pylori
estirpe 114C ureia ( uréia) gene
GQ403154.1
630
96-98%
3e-164 1e-177
Helicobacter
produtos de PCR específicos de gênero derivado de extratos de DNA gástrica sminthopsis foram comparados com o H. pylori
GenBank listadas na Tabela. As amostras sminthopsis exibiram 100% de identidade de sequência com 16s rRNA de cinco isolados humanos clínicos de H. pylori
, e 96-98% de identidade de sequência com cagA e uréia
de dois isolados clínicos humanos de H. pylori
.
O importante H. pylori
fator de virulência, cag
PAI (cag
patogenicidade ilha) codifica um sistema de secreção tipo IV envolvendo cagA. Nem todos H. pylori
estirpes possuem esse fator de virulência, e os indivíduos infectados com cag
estirpes PAI positivos geralmente desenvolvem gastrite mais grave, e ter uma muito maior probabilidade de progressão para doença. A urease, uma enzima composta por duas subunidades ureA e ureB

, é essencial para a patogénese de H. pylori
no estômago humano devido à sua capacidade para neutralizar o ácido gástrico, através da produção de bicarbonato. Análise usando iniciadores de PCR específicos revelou que a Helicobacter infectar
eram cagA
e uréia
positiva e seqüenciamento genético revelou 96% de identidade com cagA
e identidade 96-98% com uréia
de H . pylori
(Tabela 1).
perda natural da infecção por H. pylori
na cara de Stripe sminthopsis colónia
Quando as amostras foram coletadas de 18 Dunnarts do sexo feminino em julho de 2008, surpreendentemente, todos estes animais foram Helicobacter
negativo indicando a colônia tinha perdido a infecção. Não há explicação óbvia para a perda de infecção por H. pylori
nesses animais, como não houve mudança na criação, nem foram os Dunnarts tratados com qualquer antibiótico durante este período.
Para maior clareza, uma cronologia da acima de eventos está resumida na Tabela 2. a colônia sminthopsis no Departamento de Zoologia da Universidade de Melbourne foi fechada em 2009, impossibilitando ainda mais study.Table 2 Cronologia dos acontecimentos
Data
evento
julho-dezembro 2003
Aumento da mortalidade observada no sminthopsis colônia com sangramento gástrico.
maio 2004
estômagos dois sminthopsis foram testadas e mostraram-se Helicobacter
positivo pelo teste CLO. A histologia revelou gastrite leve.
Julho-dezembro 2004
Aumento da mortalidade observada no sminthopsis colônia com sangramento gástrico.
2006
fezes sminthopsis mostrado ser Helicobacter
positiva pela PCR.
2007
estômagos sminthopsis mostrado ser Helicobacter
positiva pela PCR. A infecção foi mostrado para ser H. pylori
pelo sequenciamento parcial do 16S rRNA
, cagA
e uréia
.
2008

• Caracterização de metilação relacionadas com carcinoma gástrico humano de 9 ilhas miR CPG e repressão de suas expressões in vitro e in vivo
• Efeitos da glucose polipeptídeo insulinotrópico dependente de esvaziamento gástrico, glicemia e insulinemia durante a doença crítica: um estudo prospectivo, duplo-cego, randomizado, cruzado