Gjorde overføring av Helicobacter pylori fra mennesker forårsake et sykdomsutbrudd i en koloni av Stripe-faced dunnarts (Sminthopsis macroura)

? Visste overføring av Helicobacter pylori
fra mennesker forårsake et sykdomsutbrudd i en koloni av Stripe-faced dunnarts (Sminthopsis macroura
)?
Abstract
Siden oppdagelsen at Helicobacter pylori
fører til en rekke patologier i magen på infiserte mennesker, har det blitt klart at Helicobacters
finnes i en rekke ulike dyrearter hvor de er ofte assosiert med sykdom. I 2003 og 2004 var det to utbrudd av økt dødelighet assosiert med mage blødning og vekt-tap i en fange koloni av den australske pungdyr, den Stripe-faced Dunnart (Sminthopsis macroura
). Tilstedeværelsen av mage patologi førte til en undersøkelse av potensialet Helicobacter
patogenesen i disse dyrene. Histologisk undersøkelse viste tilstedeværelsen av gastritt, og PCR-analyse bekreftet tilstedeværelsen av Helicobacter
infeksjon i magen på disse pungdyrene. Overraskende, sekvensering av 16S rRNA fra disse bakteriene identifisert artene som H. pylori Hotell og PCR bekreftet belastning å være positiv for den viktige patogenesen faktor, CagA
. Vi beskriver derfor for første gang, en tilsynelatende omvendt zoonotiske infeksjoner av Stripe-faced dunnarts med H. pylori
. Allerede utsatt for patologiske effektene av stress (som opplevde under hekkesesongen), vises samtidig H. pylori
infeksjon som en mulig viktig, men ikke tilstrekkelig co-faktor i prototypic mage blødning og vekttap hos disse pungdyr. Den Stripe-faced Dunnart kunne representere en ny modell for å undersøke Helicobacter
-driven mage patologi. Infeksjoner fra sine menneskelige handlers, spesielt av H. pylori
, kan være en potensiell risiko for fangenskap kolonier av pungdyr.
Innledning
Oppdagelsen av Helicobacter pylori
slutt førte til en erkjennelse av at smitte av menneskelige magen med denne bakterien er en viktig etiologisk faktor i utviklingen av magesår sykdom og adenokarsinom i ventrikkel [1-3]. En annen viktig konsekvens av at oppdagelsen har vært den påfølgende identifikasjon av en stadig voksende, tilsynelatende allestedsnærværende familie av Helicobacter
arter som infiserer mage-tarmkanalen av praktisk talt alle dyr undersøkt. Faktisk er mange Helicobacter
infeksjoner antas å være sykdomsfremkallende og muligens ansvarlig for en rekke forhold i mange dyrearter (anmeldt i [4, 5]). For eksempel har naturlig Helicobacter
infeksjoner blitt koblet med gastritt i små og store katter, hunder, griser og ildere [6-10], abort hos sau [11], kolitt og hepatitt hos rhesusaper [12], sår i delfiner og hvaler [13] og diaré hos katter og papegøyer [14, 15].
i denne rapporten beskriver vi to utbrudd av dødsfall i en fange koloni av en australsk pungdyr, den Stripe-faced Dunnart (Sminthopsis macroura
), som ble assosiert med blødning i magen muligens på grunn av infeksjon med humant patogen, H. pylori
.
Materiale og metode
Stripe-faced dunnarts
den Stripe-møtt dunnarts ble plassert på Institutt of Zoology, University of Melbourne. Kolonien ble holdt innenfor bur holdt innenfor en spesialbygd temperaturregulert bygning, i et fysisk miljø i forhold typiske for de for boliger mus, bortsett fra at naturlig belysning ble opprettholdt. Animal boliger i spesialdesignet bur, diett formulert for kjøttetinsektet pungdyr og reproduksjonsovervåking fulgt omrisset gitt tidligere [16]. Ingen andre dyrearter ble plassert i denne bygningen. De dunnarts ble gitt vann ad libitum. Ingen dunnarts ble drept spesielt for denne studien; magene var bare samlet inn fra dyr avlives enten på grunn av sykdom eller annen eksperimentering godkjent av University of Melbourne Science, Optometry & Vision Sciences og Land & Miljø dyreetikk-komiteen. Dyrene ble veid hver uke under rutinemessig husdyrhold
Rapid urease test (CLO test)
Mage biopsi av 1-2 mm ble plassert i gelen av en rask urease test (CLOtest;. Kimberly-Clark, Roswell, Georgia, USA). Testene ble overvåket over en 24 timers periode for en fargeforandring fra gult til rødt som indikerte tilstedeværelse av en urease-produserende organisme i magen.
Histologisk vurdering av patologien
Mage halvdeler ble fiksert i 10% nøytral bufret formalin , dyppet i parafin, deretter 4 mikrometer tykke seksjoner kuttet og farget med hematoxylin og eosin.
Påvisning av Helicobacter
infeksjon med genus-spesifikk PCR
for vurdering av Helicobacter
infeksjon ved PCR, avføring var samles, eller Dunnart magene åpnet langs den indre krumning, og hele organhomogenisert (Polytron homogenisator GmbH, Kinematica, Sveits). Slimhinne scrapings ble også samlet inn fra tarmen (store og små). DNA ble ekstrahert fra avføring og tarm avskraping ved hjelp av en QIAamp krakk DNA kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), og fra homogenisert magen med QIAamp vev DNA kit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. En Helicobacter
slekten PCR rettet mot et 374 bp fragment av 16S rRNA-genet ble utført som tidligere beskrevet [17].
Tilnærminger for å dyrke Dunnart gastrisk Helicobacter
Dunnart magene ble samlet og homogenisert i hjerne-hjerte- Infusion buljong (BHI; Oxoid, Basingstoke, UK). Homogenatet ble tilsatt til hesteblod-agar eller GSSA plater (som tidligere beskrevet [18]), som ble inkubert i en anaerob krukke med en mikroaerofil gass-genererende kit (Oxoid, Basingstoke, UK) i opptil 10 dager ved 37 ° C. For filtreringsteknikken, ble homogenat plassert på 0,65 mikrometer Whatman filterpapir (GE Healthcare, Rydalmere, Australia), plassert på HBA-plater, og inkubert ved 37 ° C under mikroaerofile betingelser i 2 timer. Filtrene ble deretter fjernet og platene inkuberes ved 37 ° C under mikroaerofile forhold for inntil 10 dager.
Gene sekvensering av 16S ribosomalt RNA
, CagA Hotell og urea
Nine DNA-prøver ekstrahert fra Dunnart mage og tarm scrapings ble utsatt for sekvensering. PCR for Helicobacter
gener ble utført som tidligere beskrevet for 16S rRNA product: [17], CagA product: [19] og urea product: [20]. DNA-sekvensering av de positive PCR-produktene ble gjort ved hjelp av BigDye terminatoren kjemi (Applied Biosystems, Foster City, USA). Sekvensering av både 5 'og 3' ende av amplikonene skjedde i et volum på 20 ul som består av 3,5 ul sekvense buffer, 1 ul BigDye v3.1, 10 pmol /ul av den nødvendige primer, 40-100 ng DNA, og vann for å gi sluttvolumet. Sekvenseringsprogrammet besto av 96 ° C i 1 minutt, 30 sykluser av 96 ° C i 10 sekunder, 50 ° C i 5 minutter og 60 ° C i 4 min. . Sekvensene ble sammenlignet med gensekvenser av kjente identiteter ved hjelp av BLASTn søkeprogrammet tilgjengelig gjennom Nasjonalt senter for Bioteknologi Information (NCBI) hjemmeside [21]
Resultater
Dødsfall i et Stripe-faced Dunnart koloni - 2003
En koloni av Stripe-faced dunnarts har eksistert i 26 år, først på La Trobe University (Melbourne, Australia), og deretter ved Zoologisk institutt, Universitetet i Melbourne. Kolonien har normalt mellom 60-100 dyr hvor kjønnsfordelingen er 1/1. Død av sykdom er sjelden i disse dyrene, og i en normal år, oppstår totale dødsfall ved en hastighet på omkring 10% eller mindre av det antall dyr i kolonien. De fleste dødsfallene skjer som følge av skader oppnådd under parring (hekkesesongen går fra juli til desember) eller alderdom.
I 2003 var det imidlertid en dramatisk økning i dødeligheten av disse dyrene, med 29% av dunnarts (30/104 Omtrent antall menn og kvinner) som dør i seks måneder fra juli til desember. Den døende dyr var 1-2 år gammel og dødsfallene ble ikke relatert til alderdom. Dunnarts vanligvis miste kroppsvekt i løpet av hekkesesongen, og dette vekttapet ble også økt markert i løpet av 2003. Mann dunnarts vanligvis mister i gjennomsnitt 12% av kroppsvekten fra juli til desember, men i 2003 de mistet et gjennomsnitt på 27,7%. Tilsvarende kvinnelige dunnarts mistet et gjennomsnitt 30,3% i samme periode i 2003, sammenlignet med en typisk gjennomsnittlig tap på 16%. Figur 1 viser den relative vekttap observert av disse dunnarts i 2003, sammenlignet med vekttap observert i 2006, et typisk år der det var ingen økt dødelighet. Figur 1 Økt tap i kroppsvekt i Stripe-møtt Dunnart i løpet av sykdomsutbrudd. Verdier vist til stede den gjennomsnittlige endringen i kroppsvekt ± SEM av Stripe-faced dunnarts i juli-desember (beregnet som vekten av enkeltdyr i september og desember som en prosentandel av sin vekt i juli). Viste data er fra ett år etter sykdomsutbrudd (2003; n
= 25) og et normalår når ingen økt dødelighet ble observert (2006; n
= 35). Både menn og kvinner er inkludert og dataene kombinert, som begge kjønn tapt lignende kroppsvekt. Det var ingen signifikant forskjell i kroppsvekt i september 2003 og 2006. Men dyrene mistet betydelig mer vekt i perioden frem til desember 2003 sammenlignet med samme periode i 2006 (* p
< 0,001; ANOVA).
eneste tydelig patologi observert ved post mortem var at nesten halvparten av dyrene som døde eller ble hentet grunn til å være veldig syk hadde alvorlige mageblødning. Bortsett fra økt vekttap, de fleste dyr virket sunn inntil 1-2 dager før dødsfallet, selv om noen hadde svart avføring (i samsvar med gastrointestinal blødning) og tegn på anemi (bleke snuter og tannkjøtt).
Dødsfall i et Stripe-faced Dunnart koloni - 2004
gastrisk blødning er til stede i disse dyrene tatt opp muligheten for gastrisk sårdannelse som et resultat av Helicobacter
infeksjon. Derfor, i mai 2004 mager fra to asymptomatiske kvinnelige dunnarts ble testet for Helicobacter
infeksjon med CLO test. Disse ble funnet å være positiv, støttende av en mage Helicobacter
infeksjon. Histologisk analyse av disse magene viste nærvær av en relativt mild betennelsesprosessen, preget av lymfoide aggregater i lamina propria (figur 2), selv om ingen koloniserende bakterier i hver spiral eller kokkoid skjema kunne observeres i disse avsnittene. Ingen alvorlig patologi var tydelig i disse spesielle seksjoner, selv om disse magene var samlet utenfor hekkesesongen når økt dødelighet og mage blødning ikke var oppstått. Figur 2 Betennelse i mage lamina propria av en Helicobacter -infected Dunnart. Et bilde er vist fra en H & E farget delen av mage corpus, fra en Helicobacter
-infected Dunnart (forstørrelse x 100). Magen ble samlet i mai 2004.
mellom juli og desember 2004 ble en annen hendelse av økt dødelighet inntraff, med 24 av 81 (30%) av Dunnart kolonien dør, seks av dem hadde mage blødning.
I flere tilfeller i 2003 og 2004, til kvinner som ble ansett å være gravid fra reproduksjonsovervåking hadde abortert kullet da de ble undersøkt for å få embryoer.
Helicobacter
infeksjon i Dunnart koloni 2005-2008
i 2005 og i etterfølgende år returnerte dødeligheten til normale nivåer (~ 10% per år) ble observert og ingen flere tilfeller av mage blødning. Men sporadiske forsøk ble gjort for ytterligere å undersøke den tilsynelatende mage Helicobacter
infeksjon i disse dyrene. Disse forsøkene ble begrenset av tilgjengeligheten av dyr for slike studier.
I 2006, tilstedeværelse av Helicobacter
i fekale prøver fra mannlige (n
= 20) og kvinne (n
= 20) dunnarts ble vurdert av genus spesifikk PCR. Ved hjelp av denne tilnærmingen, avføringen til tilsvarende antall mannlige (7/20) og kvinne (7/20) Stripe-faced dunnarts ble vist å være kolonisert med Helicobacter
arter, som gir bevis for tilstedeværelsen av Helicobacters
i GI-systemet av i det minste noen dyr i denne koloni. Forsøk på å dyrke Helicobacter
fra disse prøvene var mislykket.
I juli 2007, mager og tarm scrapings hentet fra dunnarts ble analysert ved genus-spesifikk PCR. Disse viste at 10/12 av dyrene som ble undersøkt hadde mage Helicobacter
infeksjon. Igjen forsøker å dyrke Helicobacter
fra mage prøvene var mislykket.
Artsbestemmelse av Helicobacter
infeksjon i Dunnart magen
å identifisere om en kjent eller roman Helicobacter
arten ble infisere Stripe -faced Dunnart koloni, 16S ribosomalt RNA plakater (rRNA) Helicobacter
genet fra disse mageprøver ble delvis sekvensert. Dette indikerte at 16S rRNA
gensekvensen av Helicobacter
infisere magen på Stripe-faced dunnarts samsvarer med H. pylori
-stammer opprinnelig isolert fra ulike regioner i fordøyelsessystem, inkludert mage og tarm. Identitets prosenter oppnådd med sekvensene var 100% (tabell 1) .table en BLASTn gjenfinning av Helicobacter pylori gensekvenser
BLASTn Hent
GenBank tiltredelse antall
Score (bits)
identitets~~POS=TRUNC
E-verdier
Helicobacter pylori
klone P13 16S ribosomalt RNA
genet
EF684928.1
699
100%
0,0
Helicobacter pylori
belastning CD2 16S ribosomalt RNA
genet
HM243132.1
699
100%
0,0
Helicobacter pylori
belastningsskader HP504 16S ribosomalt RNA
genet
GU449115.1
695
100%
0,0
Helicobacter pylori
v225d 16S ribosomalt RNA
genet
CP001582.1
695
100%
0,0
Helicobacter pylori
belastning 407D5 16S ribosomalt RNA
genet
HM099656.1
695
100%
0,0
Helicobacter pylori
anstrenge 15818 cytotoxin assosiert protein III (CagA
) genet
AF083352.1
1288
96%
0.0
Helicobacter pylori
NCTC 11639 CagA (CagA
) genet
GQ161099 0,1
1282
96%
0,0
Helicobacter pylori
belastning 114C urea ( urea) genet
GQ403154.1
630
96-98%
3e-164 1e-177
Helicobacter
genus-spesifikk PCR produktene stammer fra Dunnart mage DNA-ekstrakter ble sammenlignet med H. pylori
Genbank sekvenser som er oppført i tabellen. De Dunnart prøvene viste 100% sekvensidentitet med 16S rRNA fra fem kliniske isolater av H. pylori
, og 96-98% sekvensidentitet med CagA og urea
fra to kliniske isolater av H. pylori
.
viktig H. pylori
virulens faktor, CAG
PAI (CAG
patogenitet øya) koder for et type IV sekresjon system som involverer CagA. Ikke alle H. pylori
stammer besitte denne virulens faktor, og personer smittet med CAG
PAI positive stammer vanligvis utvikle mer alvorlig gastritt, og har en betydelig økt sjanse for å utvikle til sykdom. Urease, et enzym som består av to subenheter urea
og ureB
, er avgjørende for patogenesen av H. pylori
i magesekken hos mennesket på grunn av sin evne til å nøytralisere magesyre gjennom produksjon av bikarbonat. Analyse ved hjelp av spesifikke PCR primere avslørte at infisere Helicobacter
var CagA Hotell og urea
positiv, og gensekvensering avslørte 96% identitet med CagA Hotell og 96-98% identitet med urea
fra H . pylori product: (tabell 1).
Naturlig tap av H. pylori
infeksjon i Stripe-faced Dunnart koloni
Når prøvene ble samlet inn fra 18 kvinnelige dunnarts i juli 2008 overraskende, alle disse dyrene var Helicobacter
negativ indikerer kolonien hadde mistet infeksjonen. Det er ingen åpenbar forklaring på tapet av H. pylori
infeksjon i disse dyrene, så det var ingen endring i reindrift, og heller ikke var dunnarts behandles med antibiotika i løpet av denne perioden.
For klarhet, en kronologi av over hendelser er oppsummert i tabell 2. Dunnart kolonien i zoologi avdeling ved University of Melbourne ble stengt i 2009, utelukker ytterligere study.Table 2 Kronologi av hendelser
Dato
Hendelses
juli-desember 2003
Økt dødelighet observert i Dunnart koloni med mage blødning.
mai 2004
To Dunnart magene ble testet og vist seg å være Helicobacter
positiv av CLO test. Histologi viste mild gastritt.
Juli-desember 2004
Økt dødelighet observert i Dunnart koloni med mage blødning.
2006
Dunnart avføring vist seg å være Helicobacter
positive ved PCR.
2007
Dunnart mager vist seg å være Helicobacter
positive ved PCR. Infeksjonen ble vist å være H. pylori
ved delvis sekvensering av 16S rRNA
, CagA Hotell og urea
.
2008
Dunnart koloni vist seg å være Helicobacter
negativ med PCR av mage vev.
diskusjon
To utbrudd av økt dødelighet i en koloni av den australske pungdyr, den Stripe-faced Dunnart i 2003 og 2004 var assosiert med mage blødning og skjedde tilfeldig med en forbigående infeksjon i magen på dyr i denne koloni med human patogen, H. pylori
. Spesielt, den infiserende stamme besatt virulens faktor CagA
, noe som antyder tilstedeværelsen av den cag
PAI-type IV sekresjon system, forbundet med en økt risiko for utvikling av magekreft eller peptisk ulcus hos mennesker. Selv om bare fem av de ni Dunnart analyserte prøvene var CagA
og urea
positiv, kan dette forklares ved den lave mengden av Helicobacter
DNA i disse eksemplene, selv om muligheten for heterogenitet i de infiserende stammer som ikke kan bli ekskludert.
det var uheldig vi ikke var i stand til å dyrke Helicobacter
fra Dunnart mager, da dette kan ha tillatt oss å studere graden av heterogenitet, om noen, av disse bakteriene i kolonien. De første forsøkene på å dyrke Helicobacter
ble utført i Perth, Western Australia, på prøver som sendes fra Melbourne. Den forsinkelsen forårsaket av innsamling og overføring av disse prøvene kan ha begrenset evne til å isolere de infiserer bakterier. Men i senere studier fant vi forsøker å dyrke dem fra frisk mage vev. Forsøk på fersk vev ved hjelp av HBA plater mislyktes, ikke altfor overraskende, på grunn av soppvekst. Når selektive GSSA plater ble brukt, gjorde vi klarer å begynne med kultur en motile bakterien, men dette ble senere overgrodd av en coccoid organisme. Vi neste prøvde en filtrering tilnærming, som vellykket begrenset forurensning av coccoid organisme, men dessverre også ikke tillate oss å isolere Helicobacter
. Dette kan tyde på at Helicobacter
stede i dunnarts enten hadde dårlig motilitet (en viktig funksjon som kreves for migrering av bakterier gjennom filterpapir) eller var bare til stede i lave nivåer.
Som H. pylori
infeksjon gjør ikke ut til å være en del av den normale flora av disse dyrene (som det spontant ryddet mellom 2007 og 2008) har vi teoretisere at H. pylori
har lagt inn denne kolonien som en infeksjon fra sine menneskelige handlers. Samtidig tilstedeværelse av mageinfeksjon med H. pylori
på tidspunktet for mage blødning hendelser tyder på denne bakterien kan ha bidratt til sykdomsutbrudd. Klart, H. pylori-infeksjon
alene var utilstrekkelig til å bevirke at utbrudd som infeksjonen var til stede i løpet av 2005-2007, uten noen økning i dødelighet. Imidlertid kan det godt ha vært en viktig co-faktor i denne prosessen.
Tap av H. pylori
smitte mellom 2007 og 2008 er spennende, med årsaken til denne forekomsten rester ukjent. Gitt Helicobacter
var til stede i minst tre år, det var ikke et kortsiktig fenomen, men var tilstede over mange avl sykluser. Det synes derfor lite sannsynlig at tap av denne infeksjonen skyldes Helicobacter
blir utkonkurrert av innfødte flora, selv om denne muligheten ikke kan utelukkes. Det er også mulig at dyrene ikke ble overføring av smitte mellom seg selv, men kanskje ble stadig infisert med et humant behandleren. Dersom dette var tilfelle, kan tap av infeksjon har vært på grunn av en endring i behandleren mellom 2007 og 2008 bryte infeksjon overføring.
Stress synes å ha vært en viktig ko-faktor i sykdommen etiologi, som utbruddene oppstod i hekkesesongen i disse dyrene. Hekkesesongen er svært belastende for både mannlige og kvinnelige dunnarts, og i et gjennomsnittsår, er ledsaget av et betydelig tap i kroppsvekt. Pungdyrene kan være usedvanlig følsomme overfor stress, og det har vist seg at spennings hendelser kan ha en stor innvirkning på immunsystemet [22].
Til tross for dette, må det være en annen ko- eller utløsende faktor involvert i 2003-2004 utbrudd, som dunnarts avlet mens infisert med H. pylori
i 2005-2007 uten noen økning i dødeligheten. Dette co-faktor er fortsatt uidentifisert, men synes ikke å være noe relatert til driften som det var ingen endringer i boforhold i kolonien som var knyttet enten sykdomsutbrudd eller tap av H. pylori
infeksjon.
i konklusjonen, foreslår vi at infeksjon med humant patogen H. pylori
kan ha vært en viktig, men ikke tilstrekkelig co-faktor i et utbrudd av mage blødning som fører til døden i en koloni av Stripe-faced dunnarts. Den tilsynelatende tilfeldig infeksjon av disse pungdyr av sine menneskelige handlers, og foreningen med tilfeldig mage patologi, tyder på at disse dyrene kan gi en interessant roman dyremodell for studiet av H. pylori
patogenesen. Videre antyder denne observasjonen en potensiell risikofaktor for å sjarmere pungdyr til infeksjoner båret av sine menneskelige handlers.
Erklæringer
Takk
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser. Vi erkjenner støtte fra Kamani Nanayakkara, Phil Au, Angela Nation og Ellen Menkhorst for husdyrhold og hjelp med innsamling av prøver. Kolonien ble støttet av midler fra New Zealand Foundation for Science and Technology.
Forfatternes opprinnelige innsendte filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes opprinnelige innsendte filer for bilder. 13567_2010_22_MOESM1_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 1 13567_2010_22_MOESM2_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 2 konkurrerende interesser
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende interesser.

• Karakterisering av human magekreft relaterte metylering av 9 MIR CpG øyer og undertrykkelse av deres uttrykk in vitro og in vivo
• Effekter av glukoseavhengig insulinotropisk polypeptid på gastrisk tømming, glykemi og insulinemi under kritisk sykdom: en prospektiv, dobbeltblind, randomisert, crossover study