Upprättande och identifiering av en kaninmodell av peritoneal karcinomatos från magcancer

Upprättande och identifiering av en kaninmodell av peritoneal karcinomatos från magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
Magcancer peritoneal karcinomatos är ett vanligt kliniskt problem, men det finns inga lämpliga stora djurmodeller för att studera detta problem. Denna studie var att etablera en stabil kanin peritoneal karcinomatos modell av magcancer med hjälp av VX2 tumör, och analysera klinisk-patologiska drag
metoder
VX2 tumör implanterades i 36 nyzeeländska kaniner med 3 metoder. Laparotomic orthotopic injektion av cancerceller in i submukosala skiktet i magen (grupp A), laparotomic implantation av tumörvävnad in i den större omentum omedelbart under gastrisk antrum (grupp B), och perkutan injektion av tumörceller direkt in i peritonealhålan (grupp C), 12 kaniner i varje grupp. Djuren observeras noggrant och detalj klinisk-patologiska studier genomfördes.
Resultat
andelen framgångsrika peritoneal karcinomatos bildning var 100% (12/12), 91,7% (11/12) och 58,3% (7 /12), respektive, för grupperna A, B och C (P = 0,019, A kontra C; P = 0,077, B kontra C; P = 0,500, A kontra B, Fishers exakta test). Två veckor efter submukosala cancerceller injektion i grupp A, ulcerös magsäckscancer med peritoneal karcinomatos visade typiska VX2 tumörpatologi, med omfattande intraperitoneala metastatiska knölar, blodiga ascites och översiktliga lungmetastaser. Den klinisk-patologisk progression mönster var mycket lik patienter med avancerad magsäckscancer med peritoneal karcinomatos. Grupperna B och C uppvisade liknande mönster av cancer progression, men mindre aggressiv.
Slutsatser
Första stor djurmodell av peritoneal karcinomatos från magcancer har fastställts genom laparotomic orthotopic injektion av VX2 cancerceller in i submukosala lager av magen , vilket ger en mer lämplig modell för kirurgiska interventionsstudier. De klinisk-patologiska drag av denna modell liknar human peritoneal karcinomatos.
Bakgrund
loco-regional progression av gastrointestinala och gynekologiska cancrar ofta resulterar i peritoneal karcinomatos (PC), som kännetecknas av närvaron av tumör noduler av olika storlek, antal och fördelning på den peritoneala ytan, med mycket dålig prognos och en medianöverlevnad på mindre än 6 månader [1, 2]. Nuvarande behandlingar för en sådan dator är systemisk kemoterapi, på bästa sätt stödja vård och palliativ behandling, utan hopp om bot. För att tackla detta problem, som kallas en ny behandlingsform tumörreducerande kirurgi (CRS) plus hyper intraperitoneal kemoterapi (HIPEC) har utvecklats under de senaste två decennierna, med fördelarna med kirurgi för att minska synlig tumörbörda, och regional hyper kemoterapi för att utrota mikrometastaser [3-6].
Medan kliniska studier har gjort framsteg, har vissa experimentella djur PC-modeller också utvecklats, inklusive musmodeller och råttmodeller för att utvärdera effekt och biverkningar av experimentella HIPEC protokoll [7-10]. Även om sådana små djurmodeller är användbara i experimentella studier, är det tekniskt svårt att utföra operationer på små djur på grund av den lilla kroppsstorlek och fina hemodynamiska förhållanden. Stora djur, såsom svin har också använts för att testa farmakokinetiken för HIPEC, men de använda djuren var friska grisar i stället för grisar med PC [11]. Därför är det önskvärt med en stor djurdatormodell mer lämplig för kirurgiska interventionsstudier. Här rapporterar vi om en kanin datormodell från magcancer, med klinisk-patologiska drag härmar patienter med avancerad magsäckscancer.
Metoder
Djur
Trettiosex nyzeeländska vita kaniner, 18 män och 18 kvinnor, kroppsvikt mellan 2,5 ~ 3,0 kg, erhölls från Animal biosäkerhetsnivå 3 Laboratory vid djurexperimentella Center i Wuhan University (Animal Study Certificate SCXK 2003-0004). Djuren inhystes individuellt och fick fri tillgång till standardlaboratorie mat och vatten samt 12 h av ljus och mörker-cykel per dag. Djuret Studieprotokollet godkändes av djurskyddskommittén för Centrum.
Tumör stam och förberedelse tumörcellen
Rabbit VX2 karcinom användes för att etablera magcancer med PC i denna studie. Den VX2 tumör är en transplanterbara kanin skivepitelcancer, som kännetecknas av snabb tumörtillväxt och tidig metastas, etablerad från en virusinducerad papillom av Rous och medarbetare [12]. Tumören bibehölls genom successiv in vivo
transplantation i bakbenet 2 bärare kaniner används för varje passage.
När VX2 tumören växte till ca 1 cm i diameter på bäraren kanin djuret bedövas genom örat sveninjektion av 3% pentobarbitalnatrium (30 mg /kg). Efter beredning och desinfektion hud, var tumören skars ut från bäraren kanin och placeras i iskall 0,9% natriumkloridlösning. Tumörvävnaden hackades till cirka 1,0 ~ 2,0 mm 3 fragment och suspenderades i 2 ml normal saltlösning, sedan dras in i en 2 ml injektor. Andra tumörvävnader ca 3,0 ~ 5,0 mm 3 placerades i homogenisatorn inbäddad i isbad, till vilken 3 ml iskall normal saltlösning tillsattes, och tumörceller suspensionen gjordes, med tumörceller koncentrationen justerades till 5 × 10 10 flask celler /L.
Konstruktion av magcancer med PC Review Alla kaniner hade fasta över natten före experimentet, men vatten gavs ad libitum
. Efter randomisering, bedövades djuren genom öronvenen injektion av 3% pentobarbitalnatrium (30 mg /kg). Bukhuden var rengöras och desinficeras. Tre tillvägagångssätt antogs för att konstruera kanin modeller av PC, 12 djur för varje grupp. Grupp A i submukosala tumörcell inokulering: En mittlinjesnitt av 3 cm lång gjordes med början 2 cm under xyphoid och den övre delen av buken var öppen. Magen exponerades, 0,1 ml tumörceller (5 x 10 10 ampull celler /L) injicerades i den submukosala lager av magen (Figur 1), genom den serosala skiktet och muskelskiktet, injektionsstället var intryckt i 1 min för att hålla de injicerade tumörcellerna på plats, och buken tillslöts med ett dubbelt lager 3-O vicryl avbruten sutur. Grupp B av tumörvävnad implantation: Snittet var densamma som i grupp A. När magen exponerades, en liten bit färsk tumörvävnad ca 1,0 mm 3 implanterades i större omentum omedelbart under gastrisk antrum, och såret stängdes. Grupp C av perkutan injektion av tumörceller: Efter framställning huden, 0,1 ml tumörceller (5 x 10 10 ampull celler /L) var direkt injiceras i den övre bukhålan, och injektionsstället pressades under 1 min. Efter tumörinokulering, penicillin G i en dos av 100.000 lU /d var intramuskulärt injicerades till varje djur i 3 dagar. Alla djur var ge intravenös vätska rehydrering med 100 ml av 0,9% normal saltlösning. Figur 1 Konstruktion av kanin peritoneal karcinomatos modell från magcancer. När kaninen magen exponerades under narkos, var en 16 G nål in genom serosala och muskelskikt in i submukosala lagret av magen, och 0,1 ml av tumörceller (5 x 1010 flaska celler /L) injicerades, och injektion plats pressades under 1 minut för att hålla tumörcellerna på plats (se texten för en utförlig beskrivning).
djur observation och patologiska studier
efter operation, var daglig observation gjordes på varje kanin för att kontrollera matintag, aktiviteter, och eventuella avvikelser såsom diarré och uttorkning. Kroppsvikten mättes varje 3 dagar och den naturliga historia sjukdomsprogression registrerades. För att få en detaljerad beskrivning av den gradvisa utvecklingen av magcancer PC, var eutanasi utfördes på 3 kaniner i grupp A i slutet av veckorna 1, 2, 3 och 4, genom överdos injektion av 3% pentobarbitalnatrium genom öronvenen . För djur i grupperna B och C, dödshjälp även utförs när djuren uppvisade tydliga tecken på stress och avfall, i enlighet med UKCCCR riktlinjer för djurens välbefinnande i experimentell neoplasi [13]. Post mortem patologiska undersökningar ingick brutto patologi såsom tumörstorlek och fördelningar; lokala tumör funktioner i magcancer inklusive sårbildning, obstruktion och perforering; särdrag peritoneal karcinomatos såsom blodiga ascites, diskreta eller sammanflytande tumörnoduli på bukhinnan, cancerförändringar i större omentum och tarm hinder; metastaser till viktiga organ som levern, binjurarna, bukspottskörteln och lungorna. Alla de misstänkta organvävnader samplades för rutin histopatologi studie med sektioner färgade med hematoxylin och eosin (HE-färgning).
Statistisk analys
kroppsvikten och tumörvikten uttrycktes som medelvärde ± standardavvikelse (M ± SD). De intraabdominella metastaser och blodiga ascites registrerades som intervall och medianer. SPSS statistiskt programpaket version 10.0 (SPSS Inc., Chicago Il, USA) användes för analys, med dubbelsidig test och P < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant.
Resultat
Framgång för PC modellbygge
av 36 djur som används för PC modellbygge, operationen var framgångsrik i 33 kaniner och 3 djur dog 3 dagar efter operationen. Av de 3 dödsfall, en kanin i Grupp C dog av spridda peritonit dag tre eftersom perkutan injektion var av misstag in i tunntarmen; och en kanin vardera i grupperna B och C dog av hjärtsvikt på dag 2 på grund av snabb vätske vätskeersättning. Ytterligare 3 kaniner i grupp C inte utveckla PC av okänd anledning. Andelen framgångsrika var 100% (12/12) i grupp A, 91,7% (11/12) i grupp B och 58,3% (7/12) i grupp C (P = 0,019, A kontra C; P = 0,077, B kontra C;. P = 0,500, A kontra B, Fishers exakta test) Review tumörtillväxt och dess inverkan på djur
Efter cancerceller injektion i mag-submukosa i grupp A, visade tumören ökad tillväxt. Tumörstorlekarna var (0,028 ± 0,012) cm 3, (1,183 ± 0,148) cm 3 och (7,706 ± 1,629) cm 3, respektive, vid slutet av veckorna 1, 2, och 3 . djuren visade progressiv minskning av kroppsvikten, från (2,48 ± 0,21) kg före operation för att (2,45 ± 0,21) kg på vecka 1, (2,24 ± 0,19) kg på vecka 2, (2,02 ± 0,18) kg på vecka 3 och (1,81 ± 0,1) kg på vecka 4. Tillsammans med ändringar av kroppsvikt, utfodring och allmänna hälsotillstånd hos djuren försämrades successivt.
Tillväxt egenskaper peritoneal karcinomatos i djurmodell
Tumör egenskaper i grupp A var noga inspelade . En vecka efter submucosa injektion av cancerceller, började många små, hårda och öppna knölar att utvecklas på större omentum och antrum i magen. Ingen ascites observerades. Två veckor senare, knölar på större omentum började att gå samman i sammanflytande massa utan urskiljbara avgränsningar med magen. Massan på magväggen blev större och stack i magen hålighet att bilda typiska ulcerös cancer (Figur 2). Det var ca 5 ml av blodiga ascites i bukhålan. Tre veckor senare, började många knölar bildas i tarmkäxet och retroperitoneum. Den sammanflytande massa på större omentum började invadera levern och innesluta magen (Figur 3). Ofta magen massa och större omentum massan samman till en stor tumör blocket. Blodiga ascites kan nå så mycket som 100 ml. Det fanns även några vätskeansamling i hjärtsäcken. Många knutor sågs på bukväggen. Inga knölar observerades i lungorna. Fyra veckor senare, var talrika tumörnoduler observeras i lungorna, levern, binjurarna, tunntarm, tvärgående tjocktarmen och urinblåsan. Bukväggen var helt invaderades av tumören. Tumörer i grupp B och C visade liknande tillväxtegenskaper. Figur 2 Kanin magcancer i grupp A. Två veckor efter submukosala ympning av VX2 tumörceller, patologisk undersökning efter avlivning visar typisk ulcerös magcancer (pilen) i Nya Zeeland kanin.
Figur 3 Kanin datormodell av gastric ursprung från gruppen A. Tre veckor efter VX2 karcinomceller injicerades i submukosala lagret av magen, sammanflytande tumörmassan på större omentum inneslutna magsäcksväggen (svart pil) och levern (gul pil).
Histopatologiska egenskaper VX2 kanin PC
Alla undersökta tumörprover visade omfattande invasiv tillväxt och vävnadsdöd. Tumörerna, som det större krökning av gastrisk antrum, penetrerade slemhinneskiktet att bilda sår. Mikroskopisk bild kunde hitta cancer bon tränger hela magen väggen, med typiska invasion i muskellagret och gastriska körtlar (Figur 4A). Tumörcellerna är runda, ovala eller atypisk morfologi med många patologiska mitotiska former (Figur 4B). Det fanns också iögonfallande lymfocyter, plasmaceller och andra inflammatoriska celler infiltration. Figur 4 Histopatologi av kaninmodell magcancer med PC, var 2 veckor efter VX2 karcinomceller injiceras i submukosala lagret i magen i grupp A. VX2 tumörceller invaderat hela magväggen (4A, × 100, HE fläckar) och visade många patologiska mitotiska siffror (4B, × 200, HE fläck) katalog. Viktiga funktioner i denna kaninmodell av PC från magcancer kan sammanfattas i tabell 1.Table 1 Tumör egenskaper tre olika ympning metoder
vid grupp A
Grupp B
Grupp C
tekniska funktion
Laparotomic orthotopic
tumörcell injektion i gastric submukosa
Laparotomic orthotopic
tumörvävnad ympning under gastric antrum
Perkutan tumörcellinjektion i bukhinnan
Framgång
100% (12/12) Review 91,7% (11/12) Review 58,3% (7/12) Review Större patologiska händelser
Snabb tumörprogression resulterar i andnödssyndrom, diffust peritonit beroende på perforering av gastric tumör, tarmvred, njursvikt
snabb tumörprogression som leder till tarmobstruktion, njursvikt
snabb tumörprogression som leder till intestinal adhesion ett hinder, njursvikt
Gross patologi
Ulcerös magcancer med PC, ascites
Ulcerös magcancer med PC, ascites
PC utan magsår, ascites
Histopatologi
Penetrerande tillväxten av cancercell-bon invaderar omgivande strukturer, tumörnekros i den centrala zonen av tumörmassan
Fördelar
Mest likna klinisk gastric cancer med PC
Tekniskt mindre svårt
tekniskt enkelt
Nackdelar
tekniskt svårt
Inte exakt härma magsäckscancer med PC Review Felaktig injektion i tarmarna
Diskussion
PC utgör ett allvarligt kliniskt utmana i behandling av gastrointestinala och gynekologisk cancer. I magcancer, är PC en frekvent händelse med 15% till 50% eller fler patienter med PC på kirurgisk undersökning, särskilt när det finns serosala inblandning av tumören [14-16]. Även efter botande resektion av magcancer fortfarande PC ett stort problem med postoperativa återfall. En koreansk studie i 500 patienter med ventrikelcancer behandlas med standardiserade radikal gastrektomi och lymphadectomy, fann att inom 5 år lägga gastrektomi, är PC den vanligaste mönstret (51,7%) återfall av cancer [17]. En annan randomiserad prospektiv studie i Japan fann också peritoneal återfall är den vanligaste händelsen (15,8%) vid 3 år i 530 patienter som behandlats med mycket standardiserad botande gastrektomi [18]. En prospektiv italiensk studie hos 200 patienter fann att, vid genomsnittlig uppföljning av 42,3 månader, stod PC för 32,9% av återfall [19]. En annan italiensk studie med 441 patienter med ventrikelcancer visade 17% PC återfall vid median uppföljningstid på 48 månader [20]. Därför är synkron och metachronous PC viktigaste problemet med magcancer återfall och metastaser. Sådan gastric PC förknippas med dålig prognos med median överlevnad mellan 1-1,6 månader [21, 22] till 3,1-9 månader [1, 15]. Som är med rätta anges, är risken för peritoneal återfall av magcancer särskilt hög hos patienter med diffusa-blandade tumörer och infiltration av serosa, mot vilka enbart kirurgi, oavsett hur radikal, kan erbjuda små möjligheter att ett botemedel [20]. Därför är nya omfattande behandlingsstrategier som krävs.
Kliniska studier tyder på att CRS plus HIPEC kunde uppnå god effekt i utvalda patienter med PC. Såvitt vi vet finns det 4 institutionella studier på CRS plus HIPEC hos patienter med magcancer, 2 retrospektiv (42 och 26 patienterna) [3, 23], 1 blivande (49 patienter) [4] och en jämförande icke-randomiserad ( 34 patienter) studier [24]. Medianöverlevnaden varierade från 6,6 månader [24], 8 månader [23] till 10-11 månader [3, 4], och 5-års överlevnad varierade från 6% [3, 25] till 16% [4]. Dessa kliniska studier är baserade på icke-homogena och icke standardiserade grupper av patienter. För att mer objektivt utvärdera en sådan behandling, är det nödvändigt att studera denna behandlingsform under experimentella betingelser.
Små djurmodeller för PC har fastställts, inklusive nakna möss modeller och råttmodeller [26-29]. I de flesta av dessa djurmodeller är cancerceller injiceras direkt i bukhinnan, vilket resulterar i utbredd PC i god tid [25, 30-32]. Alla dessa små djurmodeller är endast lämplig för HIPEC ensam eftersom den lilla kroppsstorlek och begränsat utbud blod inte kan stå större kirurgiska ingrepp. Inrättandet av stora djurmodell av PC från magcancer är nödvändigt för experimentella studier testa CRS och HIPEC.
VX2 karcinom är en kanin tumör i epitelialt ursprung, etablerad från en virusinducerad papillom av Rous och medarbetare [12]. Kännetecknas av snabb tumörtillväxt och tidig metastas, är denna tumör extremt elakartad och kan allogeneously transplanteras nästan var som helst i kaniner. Även VX2 är en skivepitelcancer modell, som kan skilja sig från adenokarcinom, har den använts i många experimentella studier på huvud- och halscancer [33-36], lungcancer [37], matstrupscancer [38, 39], bröst cancer [40], magsäckscancer [41, 42], levercancer [43, 44], koloncancer [45, 46], njurcancer [47-49], blåscancer [50], bentumör [51] och enkelt peritoneal karcinomatos [52]. I denna studie konstruerade vi en kaninmodell för magcancer med PC. Våra resultat visade att orthotopic ympning av tumörceller i magen är den lämpligaste metoden, vilket resulterar i typiska ulcerös magsäckscancer och progressiv PC, alla funktioner liknar klinisk-patologisk progression av gastric cancerpatienter. I jämförelse, kunde perkutan injektion av cancerceller i bukhålan resulterar i intestinal skada av misstag. Ingen ulcerös magcancer kunde induceras, och tumör take hastigheten är låg. Dessa resultat stöder uppfattningen att orthotopic tumör modell är att föredra för att studera tumör biologiska beteenden och insatser [53]. Den naturliga historien om denna modell är ca 4 veckor, inklusive en subklinisk skede under den första veckan, kliniska stadiet i den andra veckan, accelererad PC steg i den tredje veckan och slutstadium i den fjärde veckan. Typiska PC funktioner är peritoneal cancer härdarna av varierande storlek under hela bukhålan, "omentum kaka", tarmobstruktion och blodiga ascites. I slutet av den första veckan kunde betraktas som den tidiga PC, medan i slutet av den andra veckan som den avancerade PC. Därför kan specifika behandlingsmetoder vara utformade för att rikta antingen tidigt PC eller avancerad PC.
Slutsatser
en kaninmodell av magcancer med PC har fastställts genom att injicera VX2 cancerceller i submukosala skikt av magen. Modellen kännetecknas av typiska ulcerös magsäckscancer med progressiv PC, vilket gör det mer lämpligt för kirurgiska interventionsstudier för att utvärdera CRS och HIPEC mot gastric PC.
Notes
Lie-juni Mei, Xiao-Jun Yang bidragit lika för detta . förklaringar
arbete
Tack
Detta arbete stöddes fonden för författare National Excellent Doktorsavhandling Kina (nr FANEDD-200.464); Science fond för Creative forskargrupper National Natural Science Foundation i Kina (nr 20.621.502, 20.921.062).
Authors 'ursprungliga inlämnade handlingarna Images of Nedan finns länkar till författarnas ursprungliga inlämnade filer för bilder. 12885_2009_1923_MOESM1_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 1 12885_2009_1923_MOESM2_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 2 12885_2009_1923_MOESM3_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 3 12885_2009_1923_MOESM4_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 4 12885_2009_1923_MOESM5_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 6 konkurrerande intressen
författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

• Dosberoende inhibering av gastrisk skada med väte i alkalisk elektrolys dricka water
• Undersökning av hästdjur glandulärmagen lesioner för bakterier, inklusive Helicobacter spp genom fluorescens in situ hybridisation