Istituzione e l'identificazione di un modello di coniglio di carcinosi peritoneale da carcinoma gastrico

Istituzione e l'identificazione di un modello di coniglio di carcinosi peritoneale da carcinoma gastrico
Abstract
sfondo
cancro gastrico carcinosi peritoneale è un problema clinico comune, ma non ci sono adeguati grandi modelli animali per studiare questo problema. Questo studio è stato quello di stabilire un coniglio stabile peritoneale modello carcinosi di cancro gastrico mediante VX2 tumore, e analizzare le caratteristiche clinico-patologiche
Metodi
tumore VX2 è stato impiantato in 36 Nuova Zelanda conigli da 3 metodi:. Iniezione ortotopico laparotomica di cellule tumorali nello strato sottomucosa dello stomaco (Gruppo A), l'impianto laparotomia del tessuto tumorale nel omento immediatamente sotto gastrico (Gruppo B), e l'iniezione percutanea di cellule tumorali direttamente nella cavità peritoneale (gruppo C), 12 conigli in ciascun gruppo. Gli animali sono stati a stretto contatto
osservate e sono stati condotti studi approfonditi clinico-patologici. Risultati
Le percentuali di successo della formazione carcinosi peritoneale sono state del 100% (12/12), 91,7% (11/12) e 58,3% (7 /12), rispettivamente per i gruppi a, B e C (p = 0,019, a contro C; P = 0,077, piuttosto che B, C; P = 0.500, a contro B, test esatto di Fisher). Due settimane dopo le cellule tumorali sottomucosa iniezione nel Gruppo A, cancro gastrico ulcerosa con carcinosi peritoneale hanno mostrato tipica patologia tumorale VX2, con diffusi noduli metastatici intraperitoneale, ascite sanguinose e metastasi polmonari perspicue. Il modello di progressione clinico-patologica era molto simile ai pazienti di cancro gastrico avanzato con carcinosi peritoneale. Gruppi B e C hanno mostrato simile modello di progressione del cancro, ma meno aggressiva
. Conclusioni
primo grande modello animale di carcinosi peritoneale da carcinoma gastrico è stata stabilita mediante iniezione ortotopico laparotomica delle cellule tumorali VX2 nello strato sottomucosa dello stomaco , fornendo un modello più adatto per studi interventistiche chirurgiche. Le caratteristiche clinico-patologiche di questo modello assomigliano carcinosi peritoneale umana.
Sfondo
La progressione locoregionale di gastrointestinali e ginecologici tumori si traduce spesso in carcinosi peritoneale (PC), che si caratterizza per la presenza di noduli tumorali di vario le dimensioni, il numero e la distribuzione sulla superficie peritoneale, con prognosi infausta e una sopravvivenza media di meno di 6 mesi [1, 2]. Gli attuali trattamenti per tale PC sono chemioterapia sistemica, migliore cura di supporto e terapia palliativa, senza alcuna speranza di guarigione. Per far fronte a questo problema, una nuova modalità di trattamento chiamato chirurgia citoriduttiva (CRS) più chemioterapia ipertermica intraperitoneale (HIPEC) è stato sviluppato nel corso degli ultimi due decenni, prendendo i vantaggi di un intervento chirurgico per ridurre la massa tumorale visibile, e la chemioterapia ipertermica regionale per sradicare la micrometastasi [3-6].
Mentre gli studi clinici hanno fatto progressi, sono stati sviluppati alcuni modelli sperimentali animali di PC, tra cui modelli di topi e modelli di ratto per valutare l'efficacia e gli effetti negativi di protocolli sperimentali HIPEC [7-10]. Sebbene tali modelli animali piccoli sono utili in studi sperimentali, è tecnicamente difficile da eseguire operazioni su piccoli animali a causa delle dimensioni piccolo corpo e delicate condizioni emodinamiche. Grande animale come il maiale è stato utilizzato anche per testare la farmacocinetica di HIPEC, ma gli animali impiegati erano maiali sani piuttosto che i maiali con il PC [11]. Pertanto, un grande modello PC animale più adatto per gli studi interventistica chirurgica è auspicabile. Qui riportiamo un modello di coniglio PC da cancro gastrico, con le caratteristiche clinico-patologiche imitano i pazienti con carcinoma gastrico avanzato.
Metodi
Animali
Trentasei Nuova Zelanda conigli bianchi, 18 maschi e 18 femmine, di peso corporeo tra 2,5 ~ 3,0 kg, sono stati ottenuti da animali biosicurezza livello 3 Laboratorio presso il Centro Sperimentale di animali dell'Università di Wuhan (animale Studio Certificato SCXK 2003-0004). Gli animali sono stati alloggiati individualmente e consentito il libero accesso al cibo di laboratorio standard e acqua così come 12 ore di luce e di buio ciclo al giorno. Il protocollo di studio su animali è stato approvato dal Comitato di benessere degli animali del Centro.
Ceppo del tumore e la preparazione delle cellule tumorali di carcinoma
Coniglio VX2 è stato utilizzato per stabilire cancro gastrico con il PC in questo studio. Il tumore VX2 è un carcinoma a cellule squamose trapiantabili coniglio, caratterizzato da una crescita tumorale rapida e metastasi precoce, stabilito da un papilloma virus-indotto da Rous e collaboratori [12]. Il tumore è stato mantenuto da successivi in ​​vivo
trapianto nel zampa posteriore di 2 conigli carrier utilizzati per ogni passaggio.
Quando il tumore VX2 è cresciuto a circa 1 cm di diametro sul coniglio portante, l'animale è stato anestetizzato ad orecchio vena iniezione di 3% di sodio pentobarbital (30 mg /kg). Dopo la preparazione della pelle e la disinfezione, il tumore è stato asportato dal coniglio vettore e inserito in una soluzione gelida 0,9% di cloruro di sodio. tessuto tumorale è stata macinata in circa 1,0 ~ 2,0 millimetri 3 frammenti e sospeso in 2 ml di soluzione fisiologica, poi coinvolto in un mL iniettore 2. Altri tessuti tumorali circa 3,0 ~ 5,0 millimetri 3 sono stati collocati in omogeneizzatore incorporato in bagno di ghiaccio, di cui 3 ml di ghiacciata soluzione fisiologica fredda è stato aggiunto, e la sospensione delle cellule tumorali è stato fatto, con la concentrazione di cellule tumorali rettificato per 5 × 10 10 celle fiala /L.
Edilizia del cancro gastrico con il PC
Tutti i conigli avevano il digiuno durante la notte prima dell'esperimento, ma è stata data acqua ad libitum
. Dopo randomizzazione, gli animali sono stati anestetizzati ad orecchio vena iniezione di 3% di sodio pentobarbital (30 mg /kg). La pelle addominale è stato pulito e disinfettato. Tre approcci sono stati adottati per la costruzione di modelli di coniglio di PC, 12 animali per ciascun gruppo. Gruppo A di inoculazione delle cellule tumorali sottomucosa: un'incisione mediana di 3 cm di lunghezza è stata fatta a cominciare 2 cm sotto il xifoidea e l'addome superiore era aperta. Lo stomaco è stato esposto, 0,1 mL di cellule tumorali (5 × 10 10 cellule fiala /L) è stato iniettato nello strato sottomucosa dello stomaco (Figura 1), attraverso lo strato sierosa e lo strato muscolare, il sito di iniezione era premuto per 1 min per mantenere le cellule tumorali iniettate in posizione, e l'addome è stato chiuso con un doppio strato di 3-O Vicryl interrotto suture. Gruppo B di impianto tessuto tumorale: L'incisione era la stessa come nel gruppo A. Quando lo stomaco è stato esposto, un piccolo pezzo di tessuto tumorale fresco circa 1,0 mm 3 è stato impiantato nel omento immediatamente sotto gastrico, e la ferita è stata chiusa. Gruppo C di iniezione percutanea di cellule tumorali: Dopo la preparazione della pelle, 0,1 mL di cellule tumorali (5 × 10 10 cellule fiala /L) è stato iniettato direttamente nella cavità addominale superiore, e il sito di iniezione è stato premuto per 1 min. Dopo l'inoculazione del tumore, la penicillina G alla dose di 100.000 UI /d è stato intramuscolare iniettato per ciascun animale per 3 giorni. Tutti gli animali erano dare endovenosa reidratazione fluido con 100 mL di 0,9% soluzione salina normale. Figura 1 Costruzione del coniglio modello di carcinosi peritoneale da carcinoma gastrico. Quando lo stomaco coniglio è stato esposto in anestesia generale, un ago G 16 è stato inserito attraverso gli strati sierose e muscolari nello strato sottomucosa dello stomaco, e 0,1 ml di cellule tumorali (5 × 1010 flacone cellule /L) sono stati iniettati, e l'iniezione sito è stato premuto per 1 minuto per mantenere le cellule tumorali in atto (vedere il testo per una descrizione dettagliata). osservazione
animali e studi patologici
Dopo l'operazione, l'osservazione giornaliera è stata fatta su ogni coniglio per controllare l'assunzione di cibo, attività, ed eventuali anomalie come diarrea e disidratazione. Il peso del corpo è stata misurata ogni 3 giorni ed è stato registrato la storia naturale della progressione della malattia. Per ottenere una descrizione dettagliata del progressivo sviluppo del PC cancro gastrico, l'eutanasia è stata eseguita su 3 conigli in Gruppo A a fine settimane 1, 2, 3 e 4, mediante iniezione sovradosaggio del 3% di sodio pentobarbital attraverso la vena dell'orecchio . Per gli animali in gruppi B e C, l'eutanasia è stata effettuata anche quando gli animali hanno mostrato evidenti segni di sofferenza e di rifiuti, in coerenza con le linee guida UKCCCR per il benessere degli animali in neoplasia sperimentale [13]. Post Mortem esami patologici inclusi patologia grave come la dimensione del tumore e le distribuzioni; caratteristiche del tumore locali del cancro gastrico tra cui la formazione di ulcere, l'ostruzione e perforazione; caratteristiche speciali di carcinosi peritoneale, come ascite sanguinose, noduli tumorali discreti o confluenti sul peritoneo, alterazioni cancerose nel grande omento e ostruzioni intestinali; metastasi ai principali organi quali il fegato, ghiandole surrenali, pancreas e polmoni. Tutti i tessuti di organi sospetti sono stati campionati per lo studio istopatologia di routine con sezioni colorate con ematossilina e eosina (HE macchia) Analisi statistica
Il peso corporeo e del tumore peso
. Sono stati espressi come media ± deviazione standard (M ± DS). Le metastasi addominale e ascite sanguinosi sono stati registrati come gamme e mediane. La versione del software statistico SPSS pacchetto di 10.0 (SPSS Inc., Chicago IL, USA) è stato utilizzato per l'analisi, con la prova su due lati, e P < 0.05 è stato considerato statisticamente significativo.
Risultati
successo del modello di PC costruzione Illustrazione Di 36 animali utilizzati per la costruzione del modello PC, l'operazione ha avuto successo in 33 conigli e 3 animali sono morti 3 giorni dopo l'operazione. Dei 3 morti, 1 coniglio nel gruppo C morì di peritonite diffusa il giorno 3 perché l'iniezione percutanea Errata nel piccolo intestino; e 1 coniglio ciascuno in gruppi B e C è morto di insufficienza cardiaca congestizia il giorno 2 a causa della reidratazione fluido veloce. Un altro 3 conigli nel gruppo C non hanno sviluppato il PC per motivi sconosciuti. Le percentuali di successo erano del 100% (12/12) nel gruppo A, il 91,7% (11/12) nel gruppo B e il 58,3% (7/12) nel gruppo C (p = 0,019, A contro C; P = 0,077, B vs C;. P = 0.500, a contro B, test esatto di Fisher) la crescita
tumore e il suo impatto sulla animale
Dopo l'iniezione cellule tumorali nella sottomucosa gastrica nel Gruppo a, il tumore ha dimostrato una crescita accelerata. Le dimensioni del tumore sono stati (0,028 ± 0,012) cm 3, (1.183 ± 0.148) cm 3 e (7.706 ± 1.629) cm 3, rispettivamente, a fine settimane 1, 2, e 3 . Gli animali hanno mostrato progressiva diminuzione del peso corporeo, da (2,48 ± 0,21) kg prima del funzionamento a (2,45 ± 0,21) kg sulla settimana 1, (2.24 ± 0,19) kg in settimana 2, (2.02 ± 0.18) kg di settimana 3 e (1.81 ± 0.1) kg in settimana 4. con i cambiamenti del peso corporeo, lo stato di alimentazione e di salute generale degli animali deteriorate progressivamente.
caratteristiche di crescita di carcinosi peritoneale in modello animale
caratteristiche del tumore nel gruppo a sono stati accuratamente registrati . Una settimana dopo l'iniezione delle cellule tumorali sottomucosa, molti noduli piccoli, duri e trasparenti cominciato a sviluppare il grande omento e l'antro dello stomaco. Non è stata osservata ascite. Due settimane più tardi, noduli sulla grande omento hanno cominciato a fondersi in masse confluenti senza demarcazioni distinguibili con lo stomaco. La massa sulla parete gastrica cresciuto più grande e sporgeva nella cavità dello stomaco per formare cancro ulcerosa tipica (Figura 2). C'erano circa 5 ml di ascite sanguinosi nella cavità addominale. Tre settimane più tardi, molti noduli hanno cominciato a formarsi nel mesentere e retroperitoneo. La massa confluenti sulla omento cominciò ad invadere il fegato e racchiudere stomaco (Figura 3). Spesso la massa stomaco e il grande omento di massa fusi in un unico blocco di grande tumore. ascite sanguinosa potrebbe raggiungere fino a 100 ml. C'era anche un po 'di accumulo di liquidi nel pericardio. Molti noduli sono stati visti sulla parete addominale. Non sono stati osservati noduli nei polmoni. Quattro settimane più tardi, numerosi noduli tumorali sono stati osservati nei polmoni, il fegato, ghiandole surrenali, intestino tenue, colon trasverso e la vescica. La parete addominale è stato completamente invaso dal tumore. I tumori nei gruppi B e C mostravano caratteristiche di crescita simili. Figura 2 Coniglio cancro gastrico nel gruppo A. Due settimane dopo l'inoculazione sottomucosa delle cellule tumorali VX2, studio patologico dopo l'eutanasia animale mostra cancro gastrico ulcerosa tipica (freccia) in Nuova Zelanda coniglio.
Figura 3 Coniglio modello di computer di origine gastrica dal Gruppo A. Tre settimane dopo che le cellule di carcinoma VX2 sono state iniettate nello strato sottomucosa dello stomaco, confluente massa tumorale sul grande omento incassato parete dello stomaco (freccia nera) e del fegato (freccia gialla).
caratteristiche istopatologiche di VX2 coniglio PC
Tutti i campioni tumorali indagati hanno mostrato ampia crescita invasiva e distruzione dei tessuti. I tumori, sulla grande curvatura gastrico, penetrato lo strato mucoso per formare ulcere. Vista al microscopio potrebbe trovare nidi cancro che penetrano l'intera parete dello stomaco, con l'invasione tipico nello strato muscolare e le ghiandole gastriche (figura 4a). Le cellule tumorali sono rotondi, ovali o morfologia atipica con molte figure mitotiche patologiche (Figura 4B). C'erano anche i linfociti cospicui, plasmacellule e altri cellule infiammatorie infiltrazione. Figura 4 istopatologia del modello di coniglio cancro gastrico con il PC, 2 settimane dopo cellule di carcinoma VX2 è stato iniettato nello strato sottomucosa dello stomaco nelle cellule tumorali A. VX2 Gruppo invaso tutta la parete dello stomaco (4A, × 100, HE macchia) e ha mostrato molti figure mitotiche patologiche (4B, × 200, HE macchia)
. principali caratteristiche di questo modello di coniglio di PC da cancro gastrico potrebbero essere riassunti nella Tabella 1 1.Table caratteristiche del tumore di tre differenti approcci inoculazione

Gruppo A
Gruppo B
Gruppo C
caratteristica tecnica laparotomica
ortotopico
delle cellule tumorali iniezione nella sottomucosa gastrica
laparotomica ortotopico inoculazione del tessuto tumorale
sotto gastrico
iniezione delle cellule tumorali percutanea nel peritoneo
tasso di successo
100% (12/12)
91,7% (11/12)
58,3% (7/12)
grandi eventi patologici
progressione del tumore Rapid con conseguente sindrome da distress respiratorio, peritonite diffusa a causa della perforazione del tumore gastrico, ostruzione intestinale, insufficienza renale
la progressione del tumore rapida con conseguente ostruzione intestinale, insufficienza renale
progressione del tumore Rapid conseguente adesione intestinale un'ostruzione, insufficienza renale
patologia lordo
colite cancro gastrico con il PC, ascite
colite cancro gastrico con il PC, ascite
PC senza ulcera gastrica, ascite
istopatologia
penetrante crescita dei nidi di cellule tumorali che invadono le strutture circostanti, necrosi tumorale nella zona centrale della massa tumorale
Vantaggi
la maggior parte assomigliano cancro gastrico clinica con il PC
tecnicamente meno difficile
tecnicamente facile
Svantaggi
tecnicamente difficile
Non esattamente mimica cancro gastrico con il PC
iniezione Mistaken nell'intestino
Discussione
PC rappresenta un grave clinica sfida nel trattamento dei tumori gastrointestinali e ginecologici. Nel cancro gastrico, PC è un evento frequente con il 15% di pazienti che hanno più PC l'esplorazione chirurgica del 50% o, soprattutto quando vi è coinvolgimento sierosa dal tumore [14-16]. Anche dopo resezione curativa del cancro gastrico, PC rimane un grave problema di recidiva postoperatoria. Uno studio coreano in 500 pazienti affetti da cancro gastrico trattati con gastrectomia radicale standardizzata e lymphadectomy, ha rilevato che entro 5 anni dopo gastrectomia, PC è il modello più frequente (51,7%) di recidiva del tumore [17]. Un altro studio prospettico randomizzato in Giappone anche trovato recidiva peritoneale è l'evento più frequente (15,8%) a 3 anni in 530 pazienti trattati con gastrectomia curativa altamente standardizzato [18]. Uno studio prospettico italiano in 200 pazienti ha rilevato che, al follow-up medio di 42,3 mesi, PC rappresentato il 32,9% di recidiva [19]. Un altro studio italiano con 441 pazienti affetti da cancro gastrico ha mostrato il 17% recidive PC al follow-up mediano di 48 mesi [20]. Pertanto, PC sincrono e metacrono è il problema più importante delle recidive del cancro gastrico e metastasi. Tale PC gastrico è associata a prognosi infausta con una sopravvivenza mediana che vanno da 1-1.6 mesi [21, 22] a 3,1-9 mesi [1, 15]. Come giustamente affermato, il rischio di recidiva peritoneale del cancro gastrico è particolarmente elevata nei pazienti con tumori e infiltrazione della sierosa diffuse-misto, contro la quale la sola chirurgia, non importa quanto sia radicale, in grado di offrire poca possibilità di una cura [20]. Pertanto, sono necessari nuove strategie di trattamento completo.
Studi clinici suggeriscono che CRS più HIPEC potrebbero realizzare una buona efficacia in pazienti selezionati con il PC. A nostra conoscenza ci sono 4 studi istituzionali CRS più HIPEC in pazienti con cancro gastrico, 2 retrospettiva (42 e 26 pazienti, rispettivamente) [3, 23], 1 prospettici (49 pazienti) [4] e 1 non-randomizzato di confronto ( 34 pazienti) studi [24]. La sopravvivenza mediana variava da 6,6 mesi [24], 8 mesi [23] per 10-11 mesi [3, 4], e la sopravvivenza a 5 anni varia dal 6% [3, 25] al 16% [4]. Questi studi clinici sono basati su gruppi non omogenei e non standardizzati di pazienti. Al fine di valutare più oggettivamente tale trattamento, è necessario studiare questa modalità di trattamento in condizioni sperimentali.
Sono state stabilite Piccoli modelli animali di PC, compresi modelli di topi nudi e modelli di ratto [26-29]. Nella maggior parte di questi modelli animali, cellule tumorali vengono iniettate direttamente nel peritoneo, che provocherà diffusa PC in tempo utile [25, 30-32]. Tutti questi piccoli modelli animali sono adatti solo per la sola HIPEC perché la dimensione del corpo piccolo e limitato apporto di sangue non possono sopportare interventi chirurgici maggiori. L'istituzione di grande modello animale di PC da cancro gastrico è necessario per la sperimentazione CRS studi test e HIPEC.
Carcinoma VX2 è un tumore coniglio di origine epiteliale, stabilito da un papilloma virus-indotto da Rous e collaboratori [12]. Caratterizzato da una crescita tumorale rapida e metastasi precoce, questo tumore è estremamente maligna e può essere allogeneously trapiantato quasi ovunque nei conigli. Anche se VX2 è un modello di carcinoma a cellule squamose, che può essere diverso da adenocarcinoma, è stato utilizzato in molti studi sperimentali sulla testa e del collo [33-36], il cancro del polmone [37], il cancro esofageo [38, 39], del seno cancro [40], il cancro gastrico [41, 42], il cancro al fegato [43, 44], il cancro del colon [45, 46], il cancro del rene [47-49], il cancro della vescica [50], tumore osseo [51] e semplice carcinosi peritoneale [52]. In questo studio abbiamo costruito un modello di coniglio di cancro gastrico con il PC. I nostri risultati hanno dimostrato che l'inoculazione ortotopico di cellule tumorali nello stomaco è il metodo più appropriato, con conseguente tipico cancro gastrico ulcerosa e PC progressiva, tutte caratteristiche simili alla progressione clinico-patologica dei pazienti affetti da cancro gastrico. In confronto, l'iniezione percutanea di cellule tumorali nella cavità addominale può provocare lesioni intestinale per errore. No cancro gastrico ulcerosa potrebbe essere indotta, e il tasso di tumore introito è basso. Questi risultati supportano l'idea che modello di tumore ortotopico è preferito per lo studio dei comportamenti e degli interventi [53] biologiche del tumore. La storia naturale di questo modello è di circa 4 settimane, tra cui uno stadio subclinico nella prima settimana, stadio clinico nella seconda settimana, fase PC accelerato nella terza settimana e la fase terminale della quarta settimana. PC Caratteristiche tipiche sono noduli tumorali peritoneali di varie dimensioni in tutta l'intera cavità addominale, "torta omento", ostruzione intestinale e ascite sanguinose. La fine della prima settimana potrebbe essere considerato come primi PC, mentre l'estremità della seconda settimana come il PC avanzato. Pertanto, approcci terapeutici specifici potrebbe essere progettato per indirizzare sia PC presto o PC avanzate.
Conclusioni
un modello di coniglio di cancro gastrico con il PC è stata stabilita iniettando cellule tumorali VX2 nello strato sottomucosa dello stomaco. Il modello è caratterizzato dalla tipica cancro gastrico ulcerosa con il PC progressiva, che lo rende più adatto per gli studi interventistici chirurgici per valutare CRS e HIPEC contro PC gastrica.
Note
Lie-Jun Mei, Xiao-Jun Yang ha contribuito anche a questo . lavoro
Dichiarazioni
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto Fondazione per l'Autore della nazionale eccellente tesi di Dottorato di Cina (No FANEDD-200.464); il Fondo Science for Creative gruppi di ricerca della National Science Foundation naturale della Cina (n ° 20.621.502, 20.921.062).
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Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.

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