Etablering og identifikation af en kanin model af peritoneal carcinomatose fra mavekræft

Etablering og identifikation af en kanin model af peritoneal carcinomatose fra mavekræft
Abstract
Baggrund
mavekræft peritoneal carcinomatose er et almindeligt klinisk problem, men der er ingen egnede store dyremodeller til at studere dette problem. Denne undersøgelse var at etablere en stabil kanin peritoneal carcinomatose model af mavekræft hjælp VX2 tumor, og analysere de klinisk-patologiske træk
Metoder
VX2 tumor blev implanteret i 36 newzealandske kaniner ved 3 metoder:. Laparotomic ortotopisk injektion af cancerceller i det submukøse lag af maven (gruppe A), laparotomic implantation af tumorvæv i større omentum umiddelbart under gastrisk antrum (gruppe B), og perkutan injektion af tumorceller direkte i den peritoneale kavitet (gruppe C), 12 kaniner i hver gruppe. Dyrene blev nøje observeret og detaljerede klinisk-patologiske undersøgelser blev udført.
Resultater Salg The succesrater for peritoneal carcinomatose dannelse var 100% (12/12), 91,7% (11/12) og 58,3% (7 /12), henholdsvis for gruppe A, B og C (P = 0,019, A versus C, P = 0,077, B versus C, P = 0,500, A versus B, Fishers eksakte test). To uger efter submukøs kræftceller injektion i gruppe A, ulcerøs mavekræft med peritoneal carcinomatose viste typiske VX2 tumor patologi, med udbredte intraperitoneale metastatiske knuder, blodige ascites og overskuelig pulmonale metastaser. Den klinisk-patologiske progression mønster var meget lig patienter af fremskreden mavekræft med peritoneal carcinomatose. Grupper B og C viste lignende mønster af cancer progression, men mindre aggressiv.
Konklusioner Salg Første store dyremodel for peritoneal carcinomatose fra mavekræft er blevet etableret ved laparotomic ortotopisk injektion af VX2 cancerceller i submukøse lag af maven , hvilket giver en mere passende model til kirurgiske interventionelle undersøgelser. De klinisk-patologiske træk ved denne model ligner menneskelige peritoneal carcinomatose.
Baggrund
loco-regional progression af gastrointestinale og gynækologisk cancer ofte resulterer i peritoneal carcinomatose (PC), der er kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​tumor knuder af forskellige størrelse, antal og fordeling på den peritoneale overflade, med meget dårlig prognose og en median overlevelse på mindre end 6 måneder [1, 2]. Aktuelle behandlinger for en sådan PC er systemisk kemoterapi, bedste support pleje og palliativ behandling, uden håb om helbredelse. For at løse dette problem, en ny behandlingsmodalitet kaldet cytoreduktive kirurgi (CRS) plus hypertermisk intraperitoneal kemoterapi (HIPEC) er blevet udviklet over de seneste to årtier, idet fordele for kirurgi for at reducere synlige tumor byrde, og regional hypertermisk kemoterapi at udrydde mikrometastaser [3-6].
Mens kliniske undersøgelser har gjort skrider, er også blevet udviklet nogle eksperimentelle dyr PC-modeller, herunder musemodeller og rotte modeller til at vurdere effekt og bivirkninger af eksperimentelle HIPEC protokoller [7-10]. Selv om sådanne små dyremodeller er nyttige i eksperimentelle undersøgelser, er det teknisk vanskeligt at udføre operationer på små dyr på grund af den lille krop størrelse og delikate hæmodynamiske forhold. Store dyr såsom svin er også blevet anvendt til at teste farmakokinetik HIPEC, men de anvendte dyr var raske grise snarere end svin med PC [11]. Derfor et stort dyr pc-modellen mere egnet til kirurgiske interventionelle undersøgelser er ønskelig. Her rapporterer vi om en kanin PC model fra mavekræft, med klinisk-patologiske træk efterligne patienter med fremskreden mavekræft.
Metoder
Dyr
Tredive seks New Zealand hvide kaniner, 18 hanner og 18 hunner, kropsvægt mellem 2,5 ~ 3,0 kg, blev opnået fra Animal biosikkerhedsniveau 3 Laboratory ved Animal Experimental center i Wuhan University (Animal Study Certificate SCXK 2003-0004). Dyrene blev huset individuelt og fik fri adgang til standard laboratorie- foder og vand samt 12 timers lys og mørke cyklus per dag. Dyret undersøgelsesprotokol blev godkendt af Animal Welfare Udvalg for Center.
Tumor stamme og forberedelse tumorceller
Kanin VX2 carcinom blev brugt til at etablere mavekræft med PC i denne undersøgelse. Den VX2 tumor er en transplanterbar kanin pladecellekræft, præget af hurtig vækst tumor og tidlig metastase, etableret fra en virus-induceret papilloma af Rous og kolleger [12]. Tumoren blev opretholdt ved successiv in vivo
transplantation ind bagbenet af 2 carrier kaniner anvendes for hver passage.
Når VX2 tumor voksede til ca. 1 cm i diameter på bæreren kanin blev dyret bedøvet med øret vene injektion af 3% pentobarbital natrium (30 mg /kg). Efter fremstilling hud og desinfektion, blev tumoren udskæres fra bæreren kanin og anbringes i iskold 0,9% natriumchloridopløsning. Tumorvæv blev hakket i tilnærmelsesvis 1,0 ~ 2,0 mm 3 fragmenter og suspenderet i 2 ml normalt saltvand, derefter trukket ind i en 2 ml injektor. Andre tumorvæv ca. 3,0 ~ 5,0 mm 3 blev anbragt i homogenisatoren indlejret i isbad, hvortil 3 ml iskoldt normalt saltvand blev tilsat, og suspensionen tumorceller blev foretaget, med koncentrationen tumorceller indstillet til 5 × 10 10 hætteglas celler /L.
Opførelse af mavekræft med PC
Alle kaniner havde natten fastende før eksperimentet, men vandet blev givet ad libitum
. Efter randomisering blev dyrene bedøvet med ørevene injektion af 3% pentobarbital natrium (30 mg /kg). Den abdominale hud blev renset og desinficeret. Tre tilgange blev vedtaget at konstruere kanin modeller af PC, 12 dyr for hver gruppe. Gruppe A submukøst tumorcelleinokulering: En midtlinjeincision på 3 cm lang blev foretaget begyndende 2 cm under xyphoid og den øvre abdomen var åben. Maven blev blotlagt, 0,1 ml af tumorceller (5 x 10 10 hætteglas celler /L) blev injiceret i det submukøse lag af maven (figur 1), gennem serosalag og muskellag, injektionsstedet var presset i 1 min for at holde de injicerede tumorceller på plads, og abdomen blev lukket med et dobbelt lag 3-O Vicryl afbrudt sutur. Gruppe B af tumorvæv implantation: The indsnit var den samme som i gruppe A. Når maven blev blotlagt, en lille stykke frisk tumorvæv ca. 1,0 mm 3 blev implanteret i større omentum umiddelbart under gastrisk antrum, og såret blev lukket. Gruppe C af perkutan injektion af tumorceller: Efter fremstilling hud, 0,1 ml af tumorceller (5 x 10 10 hætteglas celler /L) blev injiceret direkte ind i den øvre bughulen, og injektionsstedet blev presset i 1 min. Efter tumorindpodning penicillin G i en dosis på 100.000 IU /d blev intramuskulært injiceret til hvert dyr i 3 dage. Alle dyr var giver intravenøs væske rehydrering med 100 ml 0,9% fysiologisk saltvand. Figur 1 Konstruktion af kanin peritoneal carcinomatose model fra mavekræft. Når maven kanin blev blotlagt under generel anæstesi, blev en 16 G nål indsat gennem serøse og muskellag i det submukøse lag af maven, og 0,1 ml af tumorceller (5 × 1010 hætteglas celler /L) blev injiceret, og injektion site blev presset i 1 min for at holde tumorcellerne på plads (se teksten for detaljeret beskrivelse).
Animal observation og patologiske undersøgelser
efter operationen blev daglig observation af hvert enkelt kanin til at kontrollere fødeindtagelse, aktiviteter, og eventuelle abnormiteter såsom diarré og dehydrering. Kroppen vægt blev målt hver 3. dag og den naturlige historie af sygdommen progression blev registreret. For at opnå en detaljeret beskrivelse af den gradvise udvikling af gastrisk cancer PC, blev eutanasi udført på 3 kaniner i gruppe A i slutningen af ​​uge 1, 2, 3 og 4, af overdosis injektion af 3% pentobarbital natrium gennem ørevene . For dyr i gruppe B og C, blev eutanasi også udføres, når dyrene viste tydelige tegn på angst og affald i overensstemmelse med UKCCCR retningslinjer for dyrevelfærd i eksperimentel neoplasi [13]. Obduktion patologiske undersøgelser omfattede brutto patologi såsom tumor størrelse og distributioner; lokale tumor træk ved gastrisk cancer, herunder sårdannelse, obstruktion og perforation; særlige træk ved peritoneal carcinomatose såsom blodige ascites, diskrete eller sammenflydende tumor knuder på bughinden, kræft ændringer i større omentum og tarm forhindringer; metastaser til vigtige organer, såsom leveren, binyrerne, bugspytkirtlen og lungerne. Alle formodede orgel væv blev udtaget til rutinemæssig histopatologisk undersøgelse med snit farvet med hæmatoxylin og eosin (HE plet).
Statistisk analyse
kropsvægt og tumor vægt blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse (M ± SD). De intraabdominale metastaser og blodige ascites blev registreret som intervaller og medianer. Den SPSS statistisk programpakke version 10.0 (SPSS Inc., Chicago Il, USA) blev anvendt til analyse, med to-sidet test, og P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Resultater
Succes af pc-model byggeri
på 36 dyr, der anvendes til pc-model byggeri, operationen var en succes i 33 kaniner og 3 dyr døde 3 dage efter operationen. Af de 3 dødsfald, 1 kanin i gruppe C døde af diffunderede peritonitis på dag 3, fordi den perkutane injektion var fejlagtigt i tyndtarmen; og en kanin hver i gruppe B og C døde af hjertesvigt på dag 2 på grund af hurtig væske rehydrering. Yderligere 3 kaniner i gruppe C ikke udviklede PC af ukendte årsager. De succesrater var 100% (12/12) i gruppe A, 91,7% (11/12) i gruppe B og 58,3% (7/12) i gruppe C (P = 0,019, A versus C; P = 0,077, B versus C. P = 0,500, A versus B, Fishers eksakte test)
tumor vækst og dens indvirkning på dyret
Efter kræftceller injektion i gastriske submucosa i gruppe A, tumoren viste accelereret vækst. Tumoren størrelser var (0,028 ± 0,012) cm 3, (1,183 ± 0,148) cm 3 og (7,706 ± 1,629) cm 3, henholdsvis i slutningen af ​​uge 1, 2, og 3 . dyrene viste progressive fald i kropsvægt, fra (2,48 ± 0,21) kg før operation (2,45 ± 0,21) kg på uge 1, (2,24 ± 0,19) kg på uge 2, (2,02 ± 0,18) kg på uge 3 og (1,81 ± 0,1) kg på uge 4. Sammen med kroppens vægt ændringer, fodring og generelle sundhedstilstand dyrenes forværret gradvist.
vækst karakteristika af peritoneal carcinomatose i dyremodel
Tumor karakteristika i gruppe A blev omhyggeligt registreret . En uge efter submucosa injektion af cancerceller, begyndte mange små, hårde og gennemsigtige knuder at udvikle sig på større omentum og antrum i maven. Nr ascites blev observeret. To uger senere, knuder på større omentum begyndte at flette ind sammenflydende masserne uden mærkbar afgrænsninger med maven. Massen på mavevæggen voksede sig større og rager ind i maven hulrum til dannelse typiske ulcerativ cancer (figur 2). Der var ca. 5 ml af blodige ascites i bughulen. Tre uger senere, begyndte mange knuder til at danne i mesenterium og retroperitoneum. Det sammenflydende masse på det større omentum begyndte at invadere leveren og omslutte mave (figur 3). Ofte maven masse og større omentum masse samlet i én stor tumor blok. Bloody ascites kunne nå så meget som 100 ml. Der var også nogle væskeophobning i hjertesækken. Mange knuder blev set på bugvæggen. Ingen knuder blev observeret i lungerne. Fire uger senere blev adskillige tumor knuder observeret i lungerne, leveren, binyrerne, tyndtarm, tværgående tyktarm og blære. Bugvæggen blev totalt invaderet af tumoren. Tumorer i gruppe B og C viste lignende vækstkarakteristika. Figur 2 Kanin mavekræft i gruppe A. To uger efter submukøs podning af VX2 tumorceller, patologisk undersøgelse efter dyr eutanasi viser typisk ulcerøs mavekræft (pil) i New Zealand kanin.
Figur 3 Kanin pc-model af gastrisk oprindelse fra gruppen A. Tre uger efter VX2 carcinomaceller blev injiceret i submukøse lag af maven, sammenflydende tumormasse på det større omentum indkapslet mavevæggen (sort pil) og leveren (gul pil). Salg Histopatologiske karakteristika VX2 kanin PC
Alle undersøgte tumor prøver viste omfattende invasiv vækst og ødelagt væv. Tumorerne, om større krumning af gastrisk antrum, gennemtrænges den mucosale lag til dannelse sår. Mikroskopisk billede kunne finde kræft reder gennemtrænger hele mavevæggen, med typiske invasion ind i musklen lag og det gastriske kirtler (figur 4A). Tumorcellerne er runde, ovale eller atypisk morfologi med mange patologiske mitotiske figurer (figur 4B). Der var også iøjnefaldende lymfocytter, plasmaceller og andre inflammatoriske celler infiltration. Figur 4 Histopatologi af kaninmodel mavekræft med PC, blev 2 uger efter VX2 carcinom celler injiceret i submukøse lag af maven i Group A. VX2 tumorceller invaderede hele mavevæggen (4A, × 100, HE-farve) og viste mange patologiske mitotiske tal (4B, × 200, HE plet).
Vigtige funktioner for denne kanin model af pc fra mavekræft kan sammenfattes i tabel 1.Table 1 Tumor karakteristika tre forskellige podning tilgange

Gruppe A
Gruppe B
Gruppe C
Teknisk funktion
Laparotomic ortotopisk
tumorceller injektion i den gastriske submucosa
Laparotomic ortotopisk
tumorvæv podning under gastriske antrum
Perkutan tumorceller injektion i bughinden
Succesrate
100% (12/12)
91,7% (11/12)
58,3% (7/12)
Større patologiske begivenheder
Hurtig tumorprogression resulterer i respiratory distress syndrome, diffust peritonitis grund perforering af gastrisk tumor, tarmobstruktion, nyresvigt
Hurtig tumorprogression resulterer i tarmobstruktion, nyresvigt
Hurtig tumorprogression resulterer i tarm vedhæftning en forhindring, nyresvigt
Gross patologi
Colitis mavekræft med PC, ascites
Colitis mavekræft med PC, ascites
PC uden mavesår, ascites
Histopatologi
Gennemtrængende vækst af cancercellelinjer reder invaderer omgivende strukturer, tumor nekrose i den centrale zone af tumormassen
Fordele
fleste ligner klinisk mavekræft med PC
Teknisk mindre vanskelig
Teknisk let
Ulemper
Teknisk vanskeligt
Ikke ligefrem efterligner mavekræft med PC
Mistaken injektion i tarmene
diskussion
PC udgør en alvorlig klinisk udfordrer i behandlingen af ​​gastrointestinale og gynækologisk cancer. I gastrisk cancer, PC er en hyppig begivenhed med 15% til 50% eller flere patienter med PC ved kirurgisk undersøgelse, især når der er serøse involvering af tumoren [14-16]. Selv efter kurativ resektion af mavekræft, PC fortsat et stort problem af postoperativ gentagelse. En koreansk undersøgelse i 500 mavecancerpatienter behandlet ved hjælp af standardiseret radikal gastrektomi og lymphadectomy, fandt, at inden for 5 år sende gastrektomi, PC er den hyppigste mønster (51,7%) af cancertilbagefald [17]. En anden randomiseret prospektiv undersøgelse i Japan fandt også peritoneal gentagelse er den hyppigste hændelse (15,8%) ved 3 år i 530 patienter behandlet med meget standardiseret helbredende gastrektomi [18]. En prospektiv italiensk undersøgelse i 200 patienter fandt, at der på den gennemsnitlige opfølgning af 42,3 måneder, PC udgjorde 32,9% af recidiv [19]. En anden italiensk undersøgelse med 441 mavecancerpatienter viste 17% PC tilbagefald ved median opfølgning på 48 måneder [20]. Derfor synkron og metachronous PC er det vigtigste problem af gastrisk cancer tilbagefald og metastaser. En sådan gastrisk PC er forbundet med dårlig prognose med median overlevelse spænder fra 1-1.6 måneder [21, 22] til 3,1-9 måneder [1, 15]. Som det med rette anført, er risikoen for peritoneal fornyet mavekræft er særlig høj hos patienter med diffuse-blandet tumorer og infiltration af serosa, mod hvilken kirurgi alene, uanset hvor radikal, kan tilbyde ringe mulighed for en kur [20]. Derfor er nye omfattende behandlingsstrategier påkrævet.
Kliniske undersøgelser tyder på, at CRS plus HIPEC kunne opnå god effekt hos udvalgte patienter med PC. Så vidt vi ved er der 4 institutionelle undersøgelser af CRS plus HIPEC hos patienter med gastrisk cancer, 2 retrospektiv (42 og 26 patienter) [3, 23], 1 prospektive (49 patienter) [4] og 1 sammenlignende ikke-randomiseret ( 34 patienter) undersøgelser [24]. Den mediane overlevelse varierede fra 6,6 måneder [24], 8 måneder [23] til 10-11 måneder [3, 4], og 5-års overlevelsen varierede fra 6% [3, 25] til 16% [4]. Disse kliniske undersøgelser er baseret på ikke-homogene og ikke-standardiserede grupper af patienter. For at mere objektivt vurdere en sådan behandling, er det nødvendigt at studere denne behandlingsmetode under eksperimentelle betingelser.
Små dyremodeller for PC er blevet etableret, herunder nøgne mus modeller og rotte-modeller [26-29]. I de fleste af disse dyremodeller, er kræftceller injiceres direkte i peritoneum, hvilket vil resultere i udbredt PC rettidigt [25, 30-32]. Alle disse små dyremodeller er kun egnet til HIPEC alene fordi den lille kropsstørrelse og begrænset blodforsyning ikke kan stå større kirurgiske indgreb. Etableringen af ​​store dyremodel af pc fra mavekræft er nødvendig for eksperimentel CRS studier test og HIPEC.
VX2 carcinom er en kanin tumor af epitelial oprindelse, etableret fra en virus-induceret papilloma af Rous og kolleger [12]. Kendetegnet ved hurtig vækst tumor og tidlig metastase, denne tumor er yderst ondartet og kan allogeneously transplanteres næsten overalt i kaniner. Selvom VX2 er et pladecellecarcinom model, som kan være forskellige fra adenocarcinom, er det blevet anvendt i mange eksperimentelle undersøgelser af hoved- og halscancer [33-36], lungecancer [37], esophageal cancer [38, 39], bryst cancer [40], gastrisk cancer [41, 42], levercancer [43, 44], tyktarmskræft [45, 46], nyrecancer [47-49], blærecancer [50], knogle tumor [51] og enkel peritoneal carcinomatose [52]. I denne undersøgelse konstrueret vi en kaninmodel af mavekræft med PC. Vores resultater viste, at ortotopisk inokulation af tumorceller i maven er den mest hensigtsmæssige metode, hvilket resulterer i typisk ulcerativ gastrisk cancer og progressiv PC, alle funktioner ligner den klinisk-patologiske progression af mavecancerpatienter. Til sammenligning kunne perkutan injektion af cancerceller i bughulen medføre intestinal skade ved en fejltagelse. Ingen ulcerativ mavekræft kunne induceres, og tumoren take er lav. Disse resultater understøtter den opfattelse, at ortotopisk tumormodel foretrækkes til studiet af tumor biologiske adfærd og interventioner [53]. Den naturlige historie af denne model er ca 4 uger, herunder en subklinisk stadie i den første uge, klinisk fase i den anden uge, accelereret PC etape i den tredje uge og terminal fase i den fjerde uge. Typiske PC funktioner er peritoneale kræft knuder i forskellige størrelser i hele hele bughulen, "omentum kage", tarmobstruktion og blodige ascites. Udgangen af ​​den første uge kunne betragtes som den tidlige pc, medens udgangen af ​​den anden uge som avanceret PC. Derfor kunne specifikke behandlingsmetoder være konstrueret til at målrette enten tidlig PC eller avanceret PC.
Konklusioner
En kanin model af mavekræft med pc er blevet etableret ved at indsprøjte VX2 kræftceller i submukøse lag af maven. Modellen er kendetegnet ved typiske ulcerøs mavekræft med progressiv PC, hvilket gør den mere egnet til kirurgiske interventionelle undersøgelser for at evaluere CRS og HIPEC mod gastrisk PC.
Noter
Lie-Jun Mei, Xiao-Jun Yang bidraget ligeligt til dette . arbejde
erklæringer
Tak
Dette arbejde blev støttet Institut til Forfatter af National Excellent doktorafhandling Kina (Ingen FANEDD-200464); Science fond for Creative Research Grupper af National Natural Science Foundation of China (nr 20.621.502, 20.921.062).
Forfattere 'oprindelige indsendt filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 12885_2009_1923_MOESM1_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 1 12885_2009_1923_MOESM2_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 2 12885_2009_1923_MOESM3_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 3 12885_2009_1923_MOESM4_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 4 12885_2009_1923_MOESM5_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 6 konkurrerende interesser
forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

• Dosisafhængig hæmning af gastrisk skade ved brint i alkalisk elektrolyserede drikkeri water
• Undersøgelse af heste kirtel mave læsioner for bakterier, herunder Helicobacter spp ved fluorescens in situ hybridisation