Mise en place et l'identification d'un modèle de lapin de carcinose péritonéale de cancer gastrique

Mise en place et l'identification d'un modèle de lapin de carcinose péritonéale d'un cancer gastrique
cancer gastrique carcinose péritonéale Résumé de l'arrière-plan est un problème clinique commun, mais il n'y a pas de modèles animaux grands appropriés pour étudier ce problème. Cette étude était d'établir un lapin stable modèle de carcinose péritonéale du cancer gastrique en utilisant VX2 tumeur, et d'analyser les caractéristiques clinico-pathologiques
Méthodes de VX2 la tumeur a été implanté dans 36 lapins New Zealand par 3 méthodes:. Injection orthotopique laparotomie de les cellules cancéreuses dans la couche sous-muqueuse de l'estomac (groupe A), l'implantation laparotomie du tissu tumoral dans le grand epiploon immédiatement au-dessous de l'antre gastrique (groupe B), et l'injection percutanée de cellules tumorales directement dans la cavité péritonéale (groupe C), 12 lapins dans chaque groupe. Les résultats des animaux ont été observés de près et des études clinico-pathologiques détaillées ont été menées.
Les taux de formation de carcinose péritonéale de succès ont été de 100% (12/12), 91,7% (11/12) et 58,3% (7 /12), respectivement, pour les groupes A, B et C (P = 0,019, A contre C; P = 0,077, B contre C; P = 0,500, A contre B, test exact de Fisher). Deux semaines après l'injection des cellules cancéreuses du muqueux dans le groupe A, le cancer gastrique ulcéreuse avec carcinose péritonéale ont montré une pathologie typique VX2 de la tumeur, avec des nodules métastatiques généralisées intrapéritonéale, ascite sanglantes et des métastases pulmonaires perspicaces. Le schéma de progression clinico-pathologique était très semblable à des patients de cancer gastrique avancé avec carcinose péritonéale. Groupes B et C ont montré modèle similaire de la progression du cancer, mais d'abord modèle animal grande de Conclusions de moins agressive. De carcinose péritonéale d'un cancer gastrique a été établi par injection orthotopique laparotomique des cellules cancéreuses de VX2 dans la couche sous-muqueuse de l'estomac , fournissant un modèle plus approprié pour les études interventionnelles chirurgicales. Les caractéristiques clinico-pathologiques de ce modèle ressemblent carcinose péritonéale humain.
Contexte
La progression loco-régionale des cancers gastro-intestinaux et gynécologiques se traduit souvent par carcinose péritonéale (PC), qui se caractérise par la présence de nodules tumoraux de divers la taille, le nombre et la distribution sur la surface péritonéale, avec de très mauvais pronostic et une survie médiane de moins de 6 mois [1, 2]. Les traitements actuels de tels PC sont la chimiothérapie systémique, meilleurs soins de soutien et un traitement palliatif, sans espoir de guérison. Pour faire face à ce problème, une nouvelle modalité de traitement appelée chirurgie cytoreductive (CRS) plus chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale (CHIP) a été développé au cours des deux dernières décennies, en prenant les avantages de la chirurgie pour réduire le fardeau de la tumeur visible, et la chimiothérapie hyperthermique régionale pour éradiquer micrométastases [3-6].
Bien que des études cliniques ont fait progrès, certains modèles animaux expérimentaux de PC ont également été mis au point, y compris des modèles de souris et des modèles de rats pour évaluer l'efficacité et les effets indésirables des protocoles expérimentaux CHIP [7-10]. Bien que ces petits modèles animaux sont utiles dans des études expérimentales, il est techniquement difficile d'effectuer des opérations sur les petits animaux en raison de la petite taille du corps et les conditions hémodynamiques délicates. Grand animal tel porc a également été utilisé pour tester la pharmacocinétique de CHIP, mais les animaux utilisés étaient des porcs sains plutôt que des porcs avec des PC [11]. Par conséquent, un grand modèle de PC animal plus approprié pour les études interventionnelles chirurgicales est souhaitable. Nous rapportons ici un modèle de lapin de PC de cancer de l'estomac, avec des caractéristiques clinico-pathologiques imitent les patients atteints de cancer gastrique avancé.
Méthodes
Trente-six lapins néo-zélandais blancs
Animaux, 18 hommes et 18 femmes, le poids corporel entre 2,5 ~ 3,0 kg, ont été obtenus à partir de la biosécurité animale Niveau 3 Laboratoire au Centre expérimental des animaux de l'Université de Wuhan (étude animale certificat SCXK de 2.003 à 0.004). Les animaux ont été logés individuellement et ont permis l'accès libre à la nourriture de laboratoire standard et de l'eau ainsi que 12 h de lumière et de cycle d'obscurité par jour. Le protocole d'étude des animaux a été approuvé par le Comité de protection des animaux du Centre.
Souche tumorale et la préparation des cellules tumorales
carcinome Rabbit VX2 a été utilisé pour établir le cancer gastrique avec PC dans cette étude. La tumeur VX2 est un carcinome à cellules squameuses de lapin transplantables, caractérisé par la croissance rapide de la tumeur et des métastases précoce, établie à partir d'un papillome induit par le virus de Rous et ses collaborateurs [12]. La tumeur a été maintenue par une transplantation in vivo
successive dans la patte arrière de 2 lapins porteuses utilisées pour chaque passage.
Lorsque la tumeur VX2 est passé à environ 1 cm de diamètre sur le lapin de support, l'animal a été anesthésié à l'oreille injection dans la veine de 3% du pentobarbital sodique (30 mg /kg). Après préparation de la peau et la désinfection, la tumeur a été excisée du lapin de support et placé dans une solution glacée de chlorure de sodium à 0,9%. Le tissu tumoral a été réduit en environ 1,0 ~ 2,0 mm 3 fragments et mis en suspension dans 2 ml de solution saline normale, alors aspiré dans un injecteur 2 mL. D'autres tissus tumoraux environ 3,0 ~ 5,0 mm 3 ont été placés dans l'homogénéiseur incorporé dans un bain de glace, auquel on a ajouté 3 ml de froid glacé une solution saline normale, et la suspension de cellules tumorales a été faite, avec la concentration des cellules tumorales ajustée à 5 × 10 10 cellules du flacon /L.
de construction du cancer gastrique avec PC
Tous les lapins avaient à jeun avant l'expérience, mais l'eau a été donné ad libitum
. Après la randomisation, les animaux ont été anesthésiés par injection dans la veine de l'oreille de 3% du pentobarbital sodique (30 mg /kg). La peau abdominale a été nettoyée et désinfectée. Trois approches ont été adoptées pour construire des modèles de lapin de PC, 12 animaux pour chaque groupe. Groupe A de sous-muqueux des cellules tumorales inoculation: Une incision médiane de 3 cm de long a été faite à partir de 2 cm en dessous de la xiphoïde et l'abdomen supérieur était ouvert. L'estomac a été exposé, 0,1 ml de cellules tumorales (5 x 10 10 cellules du flacon /L) a été injecté dans la couche sous-muqueuse de l'estomac (figure 1), à travers la couche séreuse et la couche musculaire, le site d'injection était enfoncée pendant 1 min pour maintenir les cellules tumorales injectées en place, et l'abdomen a été fermé avec une double couche de 3 O vicryl interrompu suture. Le groupe B de l'implantation de tissu tumoral: L'incision est le même que dans le groupe A. Quand l'estomac a été exposé, un petit morceau de tissu tumoral frais d'environ 1,0 mm 3 a été implantée dans le grand epiploon immédiatement au-dessous de l'antre gastrique et la plaie a été fermée. Le groupe C de l'injection percutanée de cellules tumorales: Après préparation de la peau, 0,1 ml de cellules tumorales (5 x 10 10 cellules du flacon /L) a été injecté directement dans la cavité abdominale supérieure, et le site d'injection a été pressé pendant 1 min. Après l'inoculation de la tumeur, de la pénicilline G à la dose de 100 000 UI /j a été injectée par voie intramusculaire à chaque animal pendant 3 jours. Tous les animaux ont été donner une réhydratation liquide par voie intraveineuse avec 100 ml de solution à 0,9% de solution saline normale. Figure 1: Construction du lapin péritonéale modèle carcinose d'un cancer gastrique. Quand l'estomac de lapin a été exposée sous anesthésie générale, une aiguille G 16 a été insérée à travers les séreux et de muscle couches dans la couche sous-muqueuse de l'estomac, et de 0,1 ml de cellules tumorales (5 x 1010 flacon de cellules /L) ont été injectés, et l'injection site a été pressé pendant 1 min pour maintenir les cellules tumorales en place (voir le texte pour une description détaillée). observation
des animaux et des études pathologiques
Après l'opération, l'observation quotidienne a été faite sur chaque lapin pour vérifier l'apport alimentaire, les activités, et des anomalies telles que la diarrhée et la déshydratation. Le poids corporel a été mesuré tous les 3 jours et l'histoire naturelle de la progression de la maladie a été enregistrée. Pour obtenir une description détaillée du développement progressif du cancer gastrique PC, l'euthanasie a été réalisée sur 3 lapins du groupe A à la fin de semaines 1, 2, 3 et 4, par injection overdose de 3% du pentobarbital de sodium à travers la veine de l'oreille . Pour les animaux dans les groupes B et C, l'euthanasie a également été effectuée lorsque les animaux ont montré des signes évidents de détresse et des déchets, conformément aux lignes directrices UKCCCR pour le bien-être des animaux dans la néoplasie expérimentale [13]. Post mortem des examens pathologiques inclus pathologie comme la taille de la tumeur et des distributions; caractéristiques tumorales locales de cancer gastrique, y compris la formation d'ulcères, l'obstruction et la perforation; caractéristiques particulières de carcinose péritonéale tels que ascite sanglantes, nodules tumoraux discrètes ou confluentes sur le péritoine, les changements cancéreuses dans le grand épiploon et obstructions intestinales; métastases principaux organes tels que le foie, les glandes surrénales, le pancréas et les poumons. Tous les tissus suspectés d'organes ont été prélevés pour l'étude histopathologique de routine avec des sections colorées par hématoxyline et éosine (HE tache) Analyse statistique de.
Le poids du poids corporel et de la tumeur ont été exprimées en moyenne ± écart-type (M ± SD). Les métastases intra-abdominales et ascite sanglants ont été enregistrés sous forme de fourchettes et médianes. La version de logiciel statistique SPSS 10.0 (SPSS Inc., Chicago Il, États-Unis) a été utilisé pour l'analyse, avec le test à deux côtés, et P < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
Résultats de la réussite du modèle de PC construction
de 36 animaux utilisés pour la construction du modèle de PC, l'opération a réussi dans 33 lapins et 3 animaux morts 3 jours après l'opération. Sur les 3 décès, 1 lapin dans le groupe C est mort de péritonite diffusés le jour 3, car l'injection percutanée était par erreur dans l'intestin grêle; et 1 lapin chacun dans les groupes B et C est mort d'une insuffisance cardiaque congestive, le jour 2 en raison de réhydratation fluide rapide. Un autre 3 lapins du groupe C ne développent pas PC pour des raisons inconnues. Les taux de réussite de 100% (12/12) dans le groupe A, 91,7% (11/12) dans le groupe B et 58,3% (7/12) dans le groupe C (P = 0,019, A contre C; P = 0,077, B contre C;. P = 0,500, A contre B, test exact de Fisher) croissance
tumorale et son impact sur l'animal
Après l'injection de cellules cancéreuses dans la sous-muqueuse gastrique dans le groupe A, la tumeur a montré une croissance accélérée. Les tailles des tumeurs ont été (0,028 ± 0,012) cm 3, (1.183 ± 0,148) cm 3 et (7.706 ± 1.629) cm 3, respectivement, à la fin de semaines 1, 2 et 3 . Les animaux ont montré une diminution progressive du poids corporel, de (2,48 ± 0,21) kg avant l'opération de (2,45 ± 0,21) kg sur la semaine 1, (2,24 ± 0,19) kg sur la semaine 2, (2,02 ± 0,18) kg sur la semaine 3 et (1,81 ± 0,1) kg sur la semaine 4. en plus des changements de poids corporel, l'état de l'alimentation et la santé générale des animaux se sont détériorées progressivement.
caractéristiques de croissance de carcinose péritonéale dans le modèle animal
caractéristiques tumorales du groupe A ont été soigneusement enregistrées . Une semaine après l'injection sous-muqueuse de cellules cancéreuses, de nombreux petits nodules durs et transparents ont commencé à se développer sur le grand epiploon et l'antre de l'estomac. N ° ascite a été observée. Deux semaines plus tard, des nodules sur le grand épiploon ont commencé à se fondre dans les masses confluentes sans démarcations discernables avec l'estomac. La masse sur la paroi gastrique devenait de plus en saillie dans la cavité de l'estomac pour former le cancer ulcéreuse typique (Figure 2). Il y avait environ 5 ml de sang de l'ascite dans la cavité abdominale. Trois semaines plus tard, de nombreux nodules ont commencé à se former dans le mésentère et le rétropéritoine. La masse agglomérée sur le grand epiploon a commencé à envahir le foie et l'estomac envelopper (figure 3). Souvent, la masse de l'estomac et le grand épiploon masse fusionnés en un seul bloc grand de la tumeur. ascite sanglantes pourraient atteindre jusqu'à 100 ml. Il y avait aussi une certaine accumulation de liquide dans le péricarde. De nombreux nodules ont été observés sur la paroi abdominale. Aucun nodule n'a été observée dans les poumons. Quatre semaines plus tard, de nombreux nodules de tumeur ont été observées dans les poumons, le foie, les glandes surrénales, l'intestin grêle, le côlon transverse et de la vessie. La paroi abdominale a été totalement envahi par la tumeur. Tumeurs dans les groupes B et C ont montré des caractéristiques de croissance similaires. Figure 2 Lapin cancer gastrique dans le groupe A. Deux semaines après muqueux inoculation des cellules tumorales VX2, étude pathologique après l'euthanasie des animaux montre un cancer gastrique ulcéreuse typique (flèche) en Nouvelle-Zélande lapin.
Figure 3 Lapin modèle de PC d'origine gastrique du groupe A. Trois semaines après que les cellules de carcinome VX2 ont été injectés dans la couche sous-muqueuse de l'estomac, la masse tumorale confluente sur la paroi de l'estomac plus épiploon enfermé (flèche noire) et le foie (flèche jaune).
caractéristiques histopathologiques de VX2 lapin PC
Tous les échantillons étudiés ont montré des tumeurs invasives croissance extensive et la destruction des tissus. Les tumeurs de la grande courbure de l'antre gastrique, pénètrent la couche muqueuse pour former des ulcères. Vue microscopique pouvait trouver des nids de cancer pénétrant dans la paroi de l'estomac entier, avec l'invasion typique dans la couche musculaire et les glandes gastriques (Figure 4A). Les cellules tumorales sont rondes, ovales ou de la morphologie atypique avec beaucoup de figures de mitose pathologiques (figure 4B). Il y avait aussi des lymphocytes visibles, les cellules plasmatiques et d'autres cellules inflammatoires infiltration. La figure 4 histopathologie du cancer gastrique modèle de lapin avec un PC, de 2 semaines après que les cellules de carcinome VX2 ont été injectés dans la couche sous-muqueuse de l'estomac dans les cellules tumorales A. VX2 groupe envahi la paroi de l'estomac entier (4A, x100, SE tache) et montrait beaucoup figures de mitose pathologiques (4B, × 200, HE tache)
. les principales caractéristiques de ce modèle de lapin de PC de cancer de l'estomac peuvent être résumées dans le tableau 1 1.Table caractéristiques tumorales de trois inoculation différentes approches

Groupe A
Groupe B
Groupe C
Fiche technique
laparotomie
orthotopique cellules tumorales injection dans la sous-muqueuse gastrique
laparotomie orthotopique
tumeur inoculation de tissu sous l'antre gastrique
injection de cellules tumorales percutanée dans le péritoine
taux de réussite
100% (12/12)
91,7% (11/12)
58,3% (7/12)
événements pathologiques majeurs
progression tumorale rapide conduisant à un syndrome de détresse respiratoire, une péritonite diffuse due à la perforation de tumeur gastrique, l'obstruction intestinale, insuffisance rénale
la progression tumorale rapide entraînant une occlusion intestinale, la progression tumorale rapide de l'insuffisance rénale résultant de l'adhérence intestinale une obstruction, une insuffisance rénale
pathologie brute
cancer gastrique ulcéreuse avec PC, ulcéreuse cancer gastrique
ascite avec PC, ascite
PC sans ulcère gastrique, la croissance de pénétrant ascite de histopathologie des nids de cellules cancéreuses qui envahissent les structures environnantes, la nécrose de la tumeur dans la zone centrale des avantages de la tumeur de masse
la plupart ressemblent à un cancer gastrique clinique PC
techniquement moins difficile techniquement facile

Inconvénients
techniquement difficile
Pas exactement mimique du cancer gastrique avec PC
injection Mistaken dans le rapport de l'intestin
PC représente une grave clinique défi dans le traitement des cancers gastro-intestinaux et gynécologiques. Dans le cancer gastrique, PC est un événement fréquent avec 15% à 50% ou plus de patients ayant PC à l'exploration chirurgicale, surtout quand il y a l'implication séreuse par la tumeur [14-16]. Même après résection curative du cancer gastrique, PC reste un problème majeur de récidive postopératoire. Une étude coréenne dans 500 patients atteints de cancer gastrique traités par gastrectomie radicale normalisée et lymphadectomy, a constaté que dans les 5 ans après le gastrectomie, PC est le motif le plus fréquent (51,7%) de cancer récidive [17]. Une autre étude prospective randomisée au Japon a également constaté la récurrence péritonéale est l'événement le plus fréquent (15,8%) à 3 ans de 530 patients traités par gastrectomie curative très standardisés [18]. Une étude italienne prospective chez 200 patients a révélé que, à la moyenne de suivi de 42,3 mois, PC représentaient 32,9% de récidive [19]. Une autre étude italienne avec 441 patients atteints de cancer gastrique a montré 17% PC récidive au suivi médian de 48 mois [20]. Par conséquent, PC synchrone et métachrone est le problème le plus important de récidive du cancer de l'estomac et les métastases. Ce PC gastrique est associée à un mauvais pronostic avec une survie médiane allant de 1-1,6 mois [21, 22] à 3.1-9 mois [1, 15]. Comme on le dit à juste titre, le risque de récidive péritonéale du cancer gastrique est particulièrement élevée chez les patients atteints de tumeurs et de l'infiltration de la séreuse diffus-mélangé, contre laquelle la chirurgie seule, peu importe la façon radicale, peut offrir peu de possibilité d'une guérison [20]. Par conséquent, de nouvelles stratégies de traitement complètes sont nécessaires.
Études cliniques suggèrent que CRS, plus CHIP pourrait obtenir une bonne efficacité chez les patients sélectionnés avec PC. À notre connaissance, il y a 4 études institutionnelles sur CRS, plus CHIP chez les patients atteints de cancer gastrique, 2 rétrospective (42 et 26 patients, respectivement) [3, 23], 1 prospectives (49 patients) [4] et 1 comparatif (non-randomisée 34 patients) des études [24]. La médiane de survie variait de 6,6 mois [24], 8 mois [23] à 10-11 mois [3, 4], et de la survie à 5 ans varie de 6% [3, 25] à 16% [4]. Ces études cliniques sont basées sur des groupes non homogènes et non normalisés des patients. Afin d'évaluer plus objectivement un tel traitement, il est nécessaire d'étudier cette modalité de traitement dans des conditions expérimentales.
Petits modèles animaux de PC ont été mis en place, y compris des modèles de souris nude et des modèles de rats [26-29]. Dans la plupart de ces modèles animaux, les cellules cancéreuses sont injectés directement dans le péritoine, ce qui se traduira par ordinateur très répandu en raison du temps [25, 30-32]. Tous ces petits modèles animaux ne conviennent que pour CHIP seul parce que la petite taille du corps et de l'approvisionnement en sang limitée ne peuvent pas supporter des interventions chirurgicales majeures. La mise en place d'un grand modèle animal de PC d'un cancer gastrique est nécessaire à des fins expérimentales CRS de tests d'études et de carcinome VX2 CHIP. De est une tumeur de lapin d'origine épithéliale, établie à partir d'un papillome virus induite par Rous et ses collaborateurs [12]. Caractérisé par la croissance rapide de la tumeur et des métastases au début, cette tumeur est extrêmement maligne et peut être allogeneously transplanté chez des lapins presque partout. Bien que VX2 est un modèle de carcinome à cellules squameuses, qui peut être différente de celle adénocarcinomes, il a été utilisé dans de nombreuses études expérimentales sur la tête et du cou [33-36], le cancer du poumon [37], le cancer de l'œsophage [38, 39], du sein le cancer [40], le cancer gastrique [41, 42], le cancer du foie [43, 44], le cancer du côlon [45, 46], le cancer du rein [47-49], le cancer de la vessie [50], une tumeur osseuse [51] et simple carcinose péritonéale [52]. Dans cette étude, nous avons construit un modèle de lapin de cancer gastrique avec le PC. Nos résultats ont démontré que l'inoculation orthotopique de cellules tumorales dans l'estomac est la méthode la plus appropriée, résultant dans le cancer gastrique ulcéreuse typique et PC progressive, toutes les fonctionnalités similaires à la progression clinico-pathologique des patients atteints de cancer gastrique. A titre de comparaison, une injection percutanée de cellules cancéreuses dans la cavité abdominale peut entraîner des lésions intestinales par erreur. Pas de cancer gastrique ulcéreuse peut être induite, et le taux d'utilisation de la tumeur est faible. Ces résultats étayent l'idée selon laquelle le modèle de tumeur orthotopique est préférée pour l'étude des comportements et des interventions tumorales [53] biologiques. L'histoire naturelle de ce modèle est d'environ 4 semaines, y compris un stade infraclinique dans la première semaine, le stade clinique de la deuxième semaine, le stade de PC accéléré dans la troisième semaine et le stade terminal de la quatrième semaine. caractéristiques de PC typiques sont des nodules de cancer péritonéal de différentes tailles à travers l'ensemble de la cavité abdominale, "gâteau épiploon", obstruction intestinale et une ascite sanglante. La fin de la première semaine peut être considéré comme le début de PC, alors que la fin de la deuxième semaine pendant que le PC avancé. Par conséquent, les approches thérapeutiques spécifiques pourraient être conçus pour cibler soit PC précoce ou PC avancé. De Conclusions
Un modèle de lapin de cancer gastrique avec le PC a été mis en place par l'injection de cellules de cancer du VX2 dans la couche sous-muqueuse de l'estomac. Le modèle se caractérise par un cancer gastrique ulcéreuse typique avec PC progressive, rendant plus adapté pour les études interventionnelles chirurgicales pour évaluer CRS et CHIP contre PC gastrique.
Remarques
Lie-Jun Mei, Xiao-Jun Yang a contribué également à ce . Remerciements Déclarations de travail
Ce travail a été soutenu Fondation pour l'auteur de national Excellente thèse de doctorat de Chine (No FANEDD-200464); le Fonds des sciences pour les groupes de recherche Creative de la National Natural Science Foundation de Chine (n ° 20621502, 20921062).
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Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts.

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