Oprichting en identificatie van een konijn model van peritonitis carcinomatosa uit de maag cancer

oprichting en de identificatie van een konijn model van peritonitis carcinomatosa van maagkanker
Abstracte achtergrond
Maagkanker peritoneale metastasen is een veel voorkomend klinisch probleem, maar er zijn geen geschikte grote diermodellen om dit probleem te bestuderen. Deze studie was een stabiele konijn peritoneale carcinomatose model van maagkanker vastgesteld middels VX2 tumor, en analyseren van de klinische en pathologische kenmerken
Methods
VX2 tumor werd in 36 Nederlandse konijnen geïmplanteerd door 3 methoden. Laparotomische orthotope injectie kanker cellen in de submucosa van de maag (groep A), laparotomische implantatie van tumorweefsel in het omentum majus direct onder de maag antrum (groep B) en percutane injectie van tumorcellen direct in de peritoneale holte (groep C), 12 konijnen in elke groep. De dieren werden nauwkeurig geobserveerd en gedetailleerd clinico-pathologische studies werden uitgevoerd.
Resultaten
De slagingspercentages van peritoneale carcinomatosa formatie waren 100% (12/12), 91,7% (11/12) en 58,3% (7 /12), respectievelijk voor groepen A, B en C (P = 0,019, A versus C; P = 0,077, B versus C; P = 0,500, A versus B, Fisher's exact test). Twee weken na submucosale kankercellen injectie in Groep A, colitis maagkanker met peritoneale carcinomatosa toonde typische VX2 tumor pathologie, met wijdverspreide intraperitoneale metastatische knobbeltjes, bloederige ascites en doorzichtig pulmonale metastasen. De clinico-pathologische progressie patroon was zeer vergelijkbaar met patiënten van gevorderde maagkanker met peritoneale carcinomatosa. Groepen B en C vertoonden vergelijkbaar patroon van de progressie van kanker, maar minder agressief.
Conclusies
Eerste grote diermodel van peritonitis carcinomatosa van maagkanker is opgericht door laparotomische orthotope injectie van VX2 kankercellen in de submucosale laag van de maag , het verstrekken van een meer geschikte model voor chirurgische interventie-onderzoek. De klinische en pathologische kenmerken van dit model lijken op menselijke peritoneale carcinomatose. Achtergrond
de locoregionale progressie van gastro-intestinale en gynaecologische kankers vaak tot peritoneale metastasen (PC), die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van tumoren van verschillende grootte, aantal en de verdeling over het peritoneale oppervlak, met een zeer slechte prognose en een mediane overleving van minder dan 6 maanden [1, 2]. Huidige behandelingen voor dergelijke PC zijn systemische chemotherapie, beste ondersteuning zorg en palliatieve therapie, zonder hoop op genezing. Om dit probleem aan te pakken, een nieuwe behandeling modaliteit genaamd cytoreductieve chirurgie (CRS) plus hyperthermische intraperitoneale chemotherapie (HIPEC) is ontwikkeld in de afgelopen twee decennia, waarbij de voordelen van een operatie om zichtbare tumor last, en regionale hypertherme chemotherapie om micrometastasen te roeien verminderen [3-6].
Hoewel uit klinische studies vooruitgang hebben gemaakt, hebben sommige proefdier pc-modellen ook ontwikkeld, waaronder muizen modellen en rat modellen om de werkzaamheid en de negatieve effecten van de experimentele HIPEC protocollen [7-10] te evalueren. Hoewel dergelijke kleine diermodellen zijn bruikbaar bij experimenteel onderzoek, is het technisch moeilijk om bewerkingen op kleine dieren vanwege de kleine lichaamsgrootte en delicate hemodynamische condities. Grote dieren zoals varkens is ook gebruikt om de farmacokinetiek van HIPEC testen, maar de gebruikte dieren waren gezonde varkens dan varkens met PC [11]. Daarom is een groot dier computermodel geschikter voor chirurgische interventie die wenselijk. Hier doen we verslag van een konijn pc-model van maagkanker, met clinico-pathologische kenmerken na te bootsen patiënten met gevorderde maagkanker.
Methods
Dieren
Zesendertig New Zealand witte konijnen, 18 mannen en 18 vrouwen, het lichaamsgewicht tussen 2,5 ~ 3,0 kg, werden verkregen uit dierlijke Biosafety Level 3 Laboratory van de Animal Experimenteel Centrum van Wuhan University (Animal studiebewijs SCXK 2003-0004). De dieren werden individueel gehuisvest en vrije toegang tot standaard laboratorium voedsel en water, alsmede 12 uur van licht en donker cyclus per dag. De studie dier protocol werd goedgekeurd door de Animal Welfare Committee van het Centrum.
Tumor stam en tumorcel voorbereiding
Konijn VX2 carcinoma werd gebruikt om maagkanker te leggen met de PC in deze studie. De VX2 tumor is een transplanteerbare konijn plaveiselcelcarcinoom, gekenmerkt door snelle tumorgroei en metastase begin, van een virus-geïnduceerde papilloma vastgesteld Rous en medewerkers [12]. De tumor werd gehandhaafd achtereenvolgens in vivo
transplantatie in de achterpoot van 2 carrier konijnen gebruikt voor elk gedeelte.
Wanneer de VX2 tumor gegroeid tot ongeveer 1 cm in diameter op de drager konijn werd het dier geanesthetiseerd gehoor veneuze injectie van 3% natrium pentobarbital (30 mg /kg). Na huidpreparaat en ontsmetting werd de tumor uitgesneden uit de drager konijn en geplaatst in ijskoude 0,9% natriumchlorideoplossing. Tumorweefsel werd gehakt tot ongeveer 1,0 ~ 2,0 mm 3 fragmenten en gesuspendeerd in 2 ml normale zoutoplossing, vervolgens getrokken in een 2 ml injector. Andere tumorweefsels ongeveer 3,0 ~ 5,0 mm 3 werden in de homogenisator ingebed in een ijsbad, waaraan 3 ml ijskoude fysiologische zoutoplossing werd toegevoegd en de tumorcellen suspensie werd gemaakt met de tumorcellen concentratie ingesteld op 5 × 10 10 flacon cellen /l.
Bouw van maagkanker met PC Leer Alle konijnen hadden 's nachts vasten voor experiment, maar het water was gegeven ad libitum
. Na randomisatie werden de dieren geanesthetiseerd gehoor veneuze injectie van 3% natrium pentobarbital (30 mg /kg). De buikhuid werd gereinigd en ontsmet. Drie benaderingen werden genomen om konijn modellen van PC te bouwen, 12 dieren voor elke groep. Een groep van submucusweefsel tumorcelinoculatie: Een incisie van 3 cm gemaakt beginnend 2 cm onder de xyphoid de bovenbuik open was. De maag werd blootgesteld, 0,1 ml tumorcellen (5 x 10 10 flacon cellen /L) werd geïnjecteerd in de submucosa van de maag (figuur 1) via de serosale laag en de spierlaag, de injectieplaats was ingedrukt 1 min de geïnjecteerde tumorcellen zijn plaats te houden, en het abdomen werd afgesloten met een dubbele laag 3-O vicryl onderbroken hechtingen. Groep B tumorweefsel implantatie: De incisie was hetzelfde als in groep A. Wanneer de maag werd blootgesteld, een klein stuk van vers tumorweefsel ongeveer 1,0 mm 3 werd geïmplanteerd in het omentum majus direct onder de maag antrum en de wond werd gesloten. Groep C van percutane injectie van tumorcellen: Na huidpreparaat, 0,1 ml tumorcellen (5 x 10 10 flacon cellen /L) werd rechtstreeks geïnjecteerd in de bovenste buikholte en de injectieplaats werd gedurende 1 min gedrukt. Tumor-inoculatie, penicilline G een dosis van 100.000 IU /d werd intramusculair geïnjecteerd in elk dier gedurende 3 dagen. Alle dieren waren geven infuusvloeistof rehydratie met 100 ml 0,9% fysiologische zoutoplossing. Figuur 1 Constructie van konijn peritoneale carcinomatosa model van maagkanker. Wanneer de maag konijn onder narcose werd blootgesteld, werd een 16 G naald ingebracht door de serosale en spierlagen in de submucosa van de maag, en 0,1 ml van tumorcellen (5 x 1010 flacon cellen /L) werden geïnjecteerd en injection site is ingedrukt gedurende 1 minuut aan de tumorcellen zijn plaats te houden (zie de tekst voor een gedetailleerde beschrijving).
Animal observatie en pathologische studies
Na de operatie, werd dagelijks waarneming op elk konijn voedselinname te controleren, activiteiten, en afwijkingen zoals diarree en uitdroging. Het lichaamsgewicht werd elke 3 dagen gemeten en de natuurlijke historie van de progressie van de ziekte werd opgenomen. Om een ​​gedetailleerde beschrijving van de geleidelijke ontwikkeling van maagkanker PC te verkrijgen werd euthanasie uitgevoerd op 3 konijnen van groep A aan het einde van week 1, 2, 3 en 4, door overdosis injectie van 3% natriumpentobarbital via oorader . Voor dieren in de groepen B en C, werd euthanasie ook uitgevoerd wanneer de dieren vertoonden duidelijke tekenen van nood en afval, in overeenstemming met UKCCCR richtlijnen voor het welzijn van dieren in de experimentele neoplasie [13]. Post Mortem pathologisch onderzoek opgenomen bruto pathologie zoals tumorgrootte en uitkeringen; lokale tumor kenmerken van maagkanker waaronder zweervorming, obstructie en perforatie; bijzondere kenmerken van peritoneale carcinomatosa zoals bloederige ascites, discreet of confluent tumor knobbeltjes op het buikvlies, kwaadaardige veranderingen in de grotere omentum en intestinale obstructies; uitzaaiingen belangrijke organen zoals de lever, bijnieren, alvleesklier en de longen. Alle verdachte orgel weefsels werden bemonsterd voor routinematige histopathologie studie met secties gekleurd met hematoxyline en eosine (HE vlek) Statistische analyse
lichaamsgewicht en tumorgewicht.
Werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (M ± SD). Het intra-abdominale metastasen en bloederige ascites werden geregistreerd als marges en middelgrote. SPSS statistische softwarepakket versie 10.0 (SPSS Inc., Chicago IL, USA) werd gebruikt voor analyse met tweezijdige test, en P < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
Succes van de bouw pc-model
Van 36 dieren die voor pc-model bouw, de operatie succesvol in 33 konijnen en 3 dieren was stierf 3 dagen na de operatie. Van de 3 doden, 1 konijnen in groep C stierf diffuus peritonitis op dag 3 omdat de percutane injectie was per ongeluk in de dunne darm; en 1 konijn elk van de groepen B en C stierf aan hartfalen op dag 2 vanwege snelle vloeistof rehydratie. Nog eens 3 konijnen in groep C niet ontwikkelen PC om onbekende redenen. Het succes tarieven waren 100% (12/12) in groep A, 91,7% (11/12) in groep B en 58,3% (7/12) in groep C (P = 0,019, A versus C; P = 0,077, B versus C. P = 0,500, A versus B, Fisher's exact test) groei
tumor en de impact ervan op het dier
Na kankercellen injectie in de maag submucosa in groep A, de tumor aangetoond versnelde groei. De tumor maten waren (0,028 ± 0,012) cm 3, (1,183 ± 0,148) cm 3 en (7,706 ± 1,629) cm 3, respectievelijk, aan het einde van week 1, 2 en 3 . De dieren vertoonden progressieve afname in lichaamsgewicht, van (2,48 ± 0,21) kg voor de operatie aan (2,45 ± 0,21) kg in week 1, (2,24 ± 0,19) kg in week 2, (2,02 ± 0,18) kg in week 3 en (1,81 ± 0,1) kg in week 4. Naast veranderingen in het lichaamsgewicht, de voeding en de algemene gezondheidstoestand van de dieren achteruit geleidelijk.
Groeikarakteristieken van peritoneale metastasen in diermodel
Tumor kenmerken in groep A werden zorgvuldig geregistreerd . Een week na submucosa injectie van kankercellen, veel kleine, harde en transparante knobbeltjes begon te ontwikkelen op het omentum majus en het antrum van de maag. Geen ascites waargenomen. Twee weken later, knobbeltjes op het omentum majus begon te fuseren tot confluente massa zonder waarneembare afscheidingen van de maag. De massa op de maagwand werd steeds vooruitgestoken in de buikholte typische ulceratieve kanker (figuur 2) te vormen. Er was ongeveer 5 ml bloedige ascites in de buikholte. Drie weken later, veel knobbeltjes begon te vormen in het mesenterium en retroperitoneum. De samenvloeiing massa op het omentum majus begon de lever binnenvallen en omsluiten de maag (figuur 3). Vaak zijn de maag massa en de grotere omentum massa samengevoegd tot één grote tumor blok. Bloedige ascites kon bereiken zo veel als 100 ml. Er was ook enige vochtophoping in het hartzakje. Veel knobbeltjes werden gezien op de buikwand. Nr knobbeltjes waargenomen in de longen. Vier weken later werden talrijke tumoren waargenomen in de longen, de lever, bijnieren, dunne darm, colon transversum en de blaas. De buikwand werd volledig binnengevallen door de tumor. Tumoren van de groepen B en C vertoonden vergelijkbare groeikenmerken. Figuur 2 Rabbit maagkanker in groep A. Twee weken na submucosale inenting van VX2 tumorcellen, pathologisch onderzoek na euthanasie van dieren toont typische ulceratieve maagkanker (pijl) in Nieuw-Zeeland konijn.
Figuur 3 Rabbit pc-model van de maag oorsprong uit groep A. Drie weken na VX2 carcinoomcellen werden geïnjecteerd in de submucosa van de maag, confluente tumormassa op de grotere omentum ingekapseld buikwand (zwarte pijl) en de lever (gele pijl).
Histopathologisch kenmerken van VX2 konijn PC
Alle onderzochte tumor specimens toonde uitgebreide invasieve groei en weefsel. De tumoren op de grotere kromming van de maag antrum drongen de mucosale laag om zweren te vormen. Microscopisch beeld kan kanker nesten penetreren van de gehele maagwand, met typische invasie in de spierlaag en de maagklieren (figuur 4A) vinden. De tumorcellen zijn rond, ovaal of atypische morfologie met vele pathologische mitotische figuren (figuur 4B). Er waren ook opvallend lymfocyten, plasmacellen en andere ontstekingscellen infiltratie. Figuur 4 Histopathologie van konijn model maagkanker met PC, 2 weken na VX2 carcinoma cellen werden geïnjecteerd in de submucosa van de maag in groep A. VX2 tumorcellen binnengedrongen het gehele maagwand (4A, × 100, HE vlekken) en toonde veel pathologische mitotische figuren (4B, × 200, HE kleuring)
. Belangrijkste kenmerken van dit konijn model van PC van maagkanker kan worden samengevat in tabel 1 1.Table Tumor kenmerken van drie verschillende inenting komt

Groep A
Groep B
Groep C
Technical feature
laparotomische orthotope
tumorcel injectie in de maag submucosa
laparotomische orthotope
tumorweefsel inenting onder de maag antrum
percutane tumorcel injectie in het buikvlies
Slagingspercentage
100% (12/12)
91,7% (11/12)
58,3% (7/12)
Major pathologische gebeurtenissen
snelle progressie van de tumor als gevolg respiratory distress syndrome, diffuus peritonitis als gevolg van perforatie van de maag tumor, intestinale obstructie, nierfalen
Rapid tumor progressie resulteert in intestinale obstructie, nierfalen
snelle progressie van de tumor resulteert in intestinale hechting een obstructie, nierfalen
Gross pathologie
Colitis maagkanker met PC, ascites
Colitis maagkanker met PC, ascites
pc zonder maagzweer, ascites
Histopathologie
Indringende groei van kankercellen nesten invasie van omliggende structuren, tumor necrose in de centrale zone van de tumor massa
Voordelen
meeste lijken klinische maagkanker met PC
technisch minder moeilijk
technisch eenvoudig
Nadelen
technisch moeilijk
niet precies na te bootsen maagkanker met PC
Mistaken injectie in de darmen
Discussion
PC is een ernstige klinische uitdaging bij de behandeling van gastro-intestinale en gynaecologische kankers. Bij maagkanker, PC is een frequente gebeurtenis met 15% tot 50% of meer patiënten met pc het chirurgisch onderzoek, vooral wanneer er sereuze betrokkenheid van de tumor [14-16]. Zelfs na curatieve resectie van maagkanker, PC blijft een groot probleem postoperatieve herhaling. Een Koreaanse studie bij 500 maagkanker patiënten behandeld met gestandaardiseerde radicale gastrectomy en lymphadectomy, vond dat binnen 5 jaar te posten gastrectomy, PC is de meest voorkomende patroon (51,7%) dat de kanker terugkeert [17]. Een andere gerandomiseerde prospectieve studie in Japan vond ook peritoneale herhaling is de meest voorkomende gebeurtenis (15,8%) na 3 jaar bij 530 patiënten behandeld met sterk gestandaardiseerde curatieve gastrectomy [18]. Een prospectieve Italiaanse studie bij 200 patiënten bleek dat bij de gemiddelde follow-up van 42,3 maanden, PC goed voor 32,9% van de herhaling [19]. Een andere Italiaanse studie met 441 patiënten met maagkanker bleek 17% PC herhaling bij de mediane follow-up van 48 maanden [20]. Daarom synchrone metachrone PC is het belangrijkste probleem van maagkanker recidief en metastase. Dergelijke maag PC wordt geassocieerd met een slechte prognose met een mediane overleving variërend 1-1,6 maanden [21, 22] tot 3,1-9 maanden [1, 15]. Zoals terecht vermeld, het risico van peritoneale herhaling van maagkanker is bijzonder hoog bij patiënten met diffuse gemengde tumoren en infiltratie van de serosa, waartegen chirurgie alleen, hoe radicaal, kan weinig kans op genezing [20] bieden. Daarom zijn nieuwe uitgebreide behandeling strategieën nodig.
Klinische studies suggereren dat CRS plus HIPEC goede werkzaamheid zou kunnen bereiken in geselecteerde patiënten met een PC. Voor zover wij weten zijn er 4 institutionele studies op CRS plus HIPEC bij patiënten met maagkanker, 2 retrospectieve (42 en 26 patiënten) [3, 23], 1 prospectieve (49 patiënten) [4] en 1 vergelijkende niet gerandomiseerde ( 34 patiënten) studies [24]. De mediane overleving varieerden van 6,6 maanden [24], 8 maanden [23] tot 10-11 maanden [3, 4], en de 5-jaars overleving varieerde van 6% [3, 25] tot 16% [4]. Deze klinische studies zijn gebaseerd op niet-homogeen en niet gestandaardiseerde patiëntengroepen. Om dergelijke behandeling objectiever te evalueren, is het nodig deze behandelingsvorm onder experimentele condities.
Kleine diermodellen van PC zijn vastgesteld, waaronder naakt muismodellen en ratmodellen [26-29]. In de meeste diermodellen worden kankercellen direct geïnjecteerd in het peritoneum, die tot wijdverspreide PC tijdig [25, 30-32]. Al deze kleine diermodellen zijn alleen geschikt voor HIPEC alleen omdat de kleine lichaamsgrootte en bloedtoevoer beperkte geen grote chirurgische ingrepen kan staan. De oprichting van grote diermodel van PC van maagkanker is om experimentele studies testen CRS en HIPEC.
VX2 carcinoom is een konijn tumor van epitheliale oorsprong, van een virus-geïnduceerde papilloma vastgesteld Rous en medewerkers [12]. Gekenmerkt door snelle tumorgroei en metastase begin, deze tumor is zeer kwaadaardig en kunnen allogeneously worden getransplanteerd bijna overal in konijnen. Hoewel VX2 een plaveiselcelcarcinoom model, die verschillen van adenocarcinoom kan zijn, is het gebruikt in veel experimenteel onderzoek van hoofd en nekkanker [33-36], longkanker [37], slokdarmkanker [38, 39], borst kanker [40], maagkanker [41, 42], leverkanker [43, 44], darmkanker [45, 46], nierkanker [47-49], blaaskanker [50], bottumor [51] en simpele peritoneale carcinomatosa [52]. In deze studie geconstrueerd we een konijnenmodel van maagkanker met PC. Onze resultaten toonden dat de orthotope inoculatie van tumorcellen in de maag is de meest geschikte methode, waardoor typische ulceratieve maagkanker en progressieve PC, alle functies vergelijkbaar met de klinische en pathologische progressie van maagkanker patiënten. In vergelijking zou percutane injectie van kankercellen in de buikholte leiden darmschade per ongeluk. Geen ulceratieve maagkanker kan worden opgewekt, en de tumor nemen koers laag is. Deze resultaten ondersteunen het idee dat orthotope tumormodel voorkeur voor de studie van biologische effecten en tumor interventies [53]. De biologie van dit model is ongeveer 4 weken, met een subklinische fase in de eerste week, klinische fase van de tweede week, versnelde PC fase in de derde week en terminale fase van de vierde week. Typische PC functies zijn buikvlieskanker knobbeltjes van verschillende grootte in de hele buikholte, "omentum cake", intestinale obstructie en bloedige ascites. Het einde van de eerste week kan worden beschouwd als het begin van PC, terwijl het einde van de tweede week de geavanceerde PC. Daarom kan een specifieke behandeling benaderingen zijn ontworpen om ofwel vroeg PC of geavanceerde PC richten.
Conclusies
Een konijn model van maagkanker met PC is vastgesteld door het injecteren van VX2 kankercellen in de submucosale laag van de maag. Het model wordt gekenmerkt door de typische ulceratieve maagkanker met progressieve PC, waardoor het meer geschikt is voor chirurgische interventie-onderzoek naar CRS en HIPEC tegen maag PC te evalueren.
Notes
Lie-Jun Mei, Xiao-Jun Yang eveneens bijgedragen aan dit work.
verklaringen
Dankwoord
Dit werk werd ondersteund Stichting de auteur van de Nationale Excellent Doctoral Dissertation van China (No FANEDD-200464); het Science Fund for Creative Onderzoeksgroepen van de National Natural Science Foundation of China (nr 20621502, 20921062).
Authors 'originele ingediende dossiers voor afbeeldingen
Hieronder staan ​​de links naar de auteurs oorspronkelijke ingediende dossiers voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 12885_2009_1923_MOESM2_ESM.jpeg Authors' 12885_2009_1923_MOESM1_ESM.jpeg Auteurs originele bestand voor figuur 2 12885_2009_1923_MOESM3_ESM.jpeg Authors 'originele bestand voor figuur 3 12885_2009_1923_MOESM4_ESM.jpeg Authors' originele bestand voor figuur 4 originele bestand 12885_2009_1923_MOESM5_ESM.pdf Authors 'voor figuur 6 tegenstrijdige belangen Ondernemingen De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen.

• Dosis-afhankelijke remming van de maag letsel door waterstof in alkalisch geëlektrolyseerd drinkwater
• Onderzoek van paarden voormaag laesies voor bacteriën, waaronder Helicobacter spp met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie