Plos ONE: Chitinase mRNA s kvantitativno PCR Uporaba enotnega standarda DNK: Kisla sesalcev Chitinase Je Major prepis v Mouse Stomach

Povzetek

Chitinases hidrolizira β-1-4 glikozidnih vezi hitina, a glavna strukturna komponenta gliv, rakov in žuželk. Čeprav sesalci ne proizvajajo hitin ali njegovo sintazo, izražajo dve zdravilni chitinases, hitotriozidaze (Chit1) in kisla chitinase sesalci (AMCase). Te chitinases sesalcev je pritegnilo veliko pozornosti zaradi njihove povečane ekspresije pri posameznikih z več bolezenskih stanj, vključno z Gaucherjevo bolezen, Alzheimerjeva bolezen in astmo. Vendar pa je prispevek teh encimov v patofiziologijo teh bolezni je treba določiti. Količinska ravni Chit1 in AMCase mRNA in primerjava teh ravni z ravnmi znanih referenčnih genov lahko ustvarjajo uporabne in biomedicinsko pomembne informacije. Na začetku smo vzpostavili kvantitativno PCR v realnem času sistem, ki uporablja standardni DNK, ki ga ligiranjem cDNA fragmenti ciljnih genov. Ta sistem nam je omogočilo, da se količinsko in primerjavo stopenj izraz chitinases in referenčnih genov v enakem obsegu. Ugotovili smo, da je AMCase mRNA sintetizira na izjemno visoki ravni v želodcu miške. Raven tega mRNA v želodcu miške je 7- do 10-krat višje od ravneh oskrbniška genov in bila primerljiva s tisto raven mRNA za pepsinogen C (progastricsin), ki je glavna sestavina želodčne sluznice. Tako AMCase mRNA je glavni prepis v miške želodcu, kar kaže, da AMCase funkcije kot prebavni encim, ki razgrajuje polimernega hitin in kot del obrambe gostiteljice pred patogeni, ki vsebujejo citin v želodčne vsebine. Naša metodologija se uporablja za kvantifikacijo mRNA za več genov v več osebkov, ki uporabljajo isto lestvico

Navedba. Ohno M, Tsuda K, Sakaguchi M, Sugahara Y, Oyama F (2012) Chitinase mRNA s kvantitativnimi PCR Uporaba enotnega standarda DNK: Kisla sesalcev Chitinase Je Major prepis v želodec Mouse. PLoS One 7 (11): e50381. doi: 10,1371 /journal.pone.0050381

Editor: Dominik Hartl, Univerza v Tübingenu, Nemčija

Prejeto: 6. avgust 2012; Sprejeto: 19. oktober 2012; Objavljeno: 21. november 2012

Copyright: © 2012 Ohno et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprla raziskovalni projekt z nepovratnimi sredstvi iz raziskovalnega inštituta za znanost in tehnologijo, Kogakuin University. Blagajnami imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Hitin, linearni polimer ß-1-4-povezan N
acetil-D-glukozamin, je drugi najpogostejši polisaharid najdemo v naravi. Deluje kot glavna strukturna komponenta gliv, rakov in žuželk, vendar ne najdemo pri sesalcih [1]. Chitinases hidrolizo z β-1-4 glikozidnih vezi polimera hitin. Čeprav sesalci ne proizvajajo hitin ali njegovo sintazo, izražajo dve zdravilni chitinases, hitotriozidaze (Chit1) in kisla chitinase sesalci (AMCase) [2], [3].

Raven Chit1 je izrazito zvišanih v plazmi bolnikov z Gaucherjevo boleznijo, avtosomno recesivna bolezen za shranjevanje lizosomalne [4]. Chit1 bil prvi sesalca chitinase se očistimo in kloniramo [5] [6]. Recesivno dedna pomanjkljivost v Chit1 aktivnosti pogosto opazili pri belcih [7]. AMCase odkrili zaradi svoje kompenzacijskega vloge in je bil imenovan po kislem pH optimum [8]. Te chitinases sesalcev se šteje kot del obrambnega mehanizma gostiteljice pred patogeni in paraziti, ki vsebujejo citin [3], [9].

Tako Chit1 in AMCase se izločajo beljakovine z molekulsko maso približno 50 kDa. Oba proteini vsebujejo N-terminalno katalitično domeno, regijo zapaha, in C-terminalni hitin-vezavna domena [6], [8]. Mouse AMCase kaže sekvenčno homologijo do Chit1, z identiteto 52% in podobnosti 60% [10]. Kljub tem strukturne podobnosti, ti encimi bistveno razlikujejo glede na njihovo encimsko vedenja pri kislem pH. AMCase kaže opazno pH optimum pri pH 2 in manj očitno optimum pri pH 4-7 [8], medtem ko Chit1 prikazuje le širok pH optimum na približno pH 5 [5], [11].

sesalcev chitinases je pritegnilo veliko pozornosti zaradi njihove povečane ekspresije pri osebah z različnimi patološkimi stanji. Chit1 je pri posameznikih z boleznijo Gaucherjevo [4], kronična obstruktivna pljučna bolezen (KOPB) [12] povečal, in Alzheimerjeve bolezni [13] in pri kadilcih [14]. AMCase izražanja in dejavnost sta molekul tudi pri alergijskih odzivov dihalnih poti v modelih miško astme [15]. Poleg tega, polimerni hitin povzroča AMCase izražanja in zaposlovanje imunskih celic, povezane z alergijo in astmo [16]. Ti rezultati nakazujejo, da chitinolytic encimi imajo pomembno vlogo v številnih patofizioloških razmerah. Vendar pa je prispevek teh encimov v patofiziologijo teh bolezni je treba določiti.

Količinska ravni Chit1 in AMCase mRNA in primerjava teh ravni z ravnmi znanih referenčnih genov so pomembni koraki v pridobivanje vpogleda v in vivo
urejanja chitinases sesalcev. Nedavno realnem času RT-PCR je bila uporabljena za kvantifikacijo ravni mRNA v številnih študijah genske ekspresije [17] - [20], ker je ta metoda je dovolj občutljiv, da zazna mRNA iz ene same celice. PCR v realnem času običajno vključuje normalizacijo ravni ekspresije gena interesa s tistimi od oskrbniška genov, ki so mislili, da se dosledno izražena v vseh vzorcih. Vendar pa ta metoda količinsko ne da primerjati ravni različnih genskih prepisov v enakem obsegu.

V tej preiskavi, smo razvili kvantitativno realnem času RT-PCR sistem, ki uporablja standardni DNK, ki ga ligiranjem cDNA delci ciljnih genov. Ta sistem nam je omogočilo, da se količinsko in primerjavo stopenj izraz chitinases in referenčnih genov v enakem obsegu. Naši rezultati kažejo, da je AMCase velik transkript v želodcu miške, kar kaže, da je ustrezna deluje proteinske kot prebavnega encima, ki razgrajuje živila vsebujejo hitina in kot del obrambe gostiteljice pred patogeni, ki vsebujejo citin v želodčne vsebine.

materiali in metode

RNA, RNA Isolation in cDNA Priprava

Mouse Total RNA Master Panel (Clontech Laboratories) je bil uporabljen, da preuči razdelitev tkiva prepisov. Analizirali smo štiri različne embrionalne faze in osem odraslih tkiv. Poleg tega je bila RNA izolirana iz pljuč in želodcev za 3-mesečno starih samcih. C57BL /6J miši (CLEAR Japonska) so redili na instrumentu RIKEN Brain Science Institute živali. Vsi poskusi na živalih so bile izvedene v skladu s smernicami ustanove. Protokol je odobril Odbor za etiko o poskusih na živalih v RIKEN Brain Science Institute (Odobritev št H19-2B013). Vse operacija je bila izvedena s pomočjo dietil eter kot anestetik, in si je prizadevala za zmanjšanje trpljenja. Ti robčki za pripravo mRNA so posredovali Drs. Miyazaki in Nukina na RIKEN Brain Science Institute. Skupno RNK smo pripravili iz pljuč in želodcev uporabo TRIzola Reagent (Invitrogen) v skladu z navodili proizvajalca. Za odstranitev sledov kontaminira genomske DNA, skupno vzorce RNA zdravijo z RQ1 RNase prosti DNazo (Promega) glede na priporočeno protokolu proizvajalca. Koncentracije nukleinskih kislin smo določili z merjenjem absorbance pri 260 nm ob uporabi BioPhotometer Plus (Eppendorf). Vsaka od vseh vzorcev RNA (3 ug) je bila podvržena reverzno transkripcijo z naključnimi heksamerov kot primerji. Reakcijsko zmes (15 ul) je vseboval encimsko blažilnik [50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCI, in 3 mM MgCl _{2], 100 ng naključnih heksamerov, 10 mM ditiotreitola in 0,5 mM deoksinukleotid trifosfati (dNTP). Po segrevanju raztopine na 60 ° C 5 min in inkubiranje zmesi pri 37 ° C 5 min, 200 U rekombinantnega virusa mišje levkemije reverzne transkriptaze (Invitrogen) dodamo in zmes inkubiramo pri 37 ° C za 45 minut . Na hrbtni prepis je bila zaključena s segrevanjem do 95 ° C za 5 min.}

Real-time PCR

premazi za realnem času RT-PCR so bili oblikovani na podlagi Primer Express Programska oprema (Applied Biosystems) in sintetiziramo komercialno (Sigma-Genosys, Sigma-Aldrich). Reakcije PCR smo izvedli v končnem volumnu 13 ul vsebujejo 2 × SYBR Green Master Mix (Brilliant II SYBR Green qPCR Master Mix, Agilent), 2,7 ng cDNA miške ali ustreznih razredčitev zunanjih standardov (glej spodaj), in ustrezne koncentracije primerji za chitinases, pepsinogen C, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) ali P-aktina. smo uporabili standardne PCR v realnem času pogoje za sistem (Mx3005P, Agilent): začetna denaturacija in polimerazo aktiviranje korak 10 minut pri 95 ° C, čemur sledi 40 ciklov denaturacijo pri 95 ° C 1 min, 55 ° C 30 sekund in 72 ° C 1 min. Taljenje krivulje so bili ustvarjeni po pomnoževanju. PCR produkt so elektroforezo na 10% poliakrilamidni gel in analizirali s pomočjo svetlečih Image Analyzer (ImageQuant LAS 4000, GE Healthcare). Rešitev PCR smo obdelali z ExoSAP-IT (USB Izdelki) v skladu z navodili proizvajalca za odpravo neregistrirana začetnih oligonukleotidov in dNTP, in izdelki so bili zaporedje z ABI PRISM Big-Dye Terminator V3.1 cikla sekvenciranje in 3130 Genetic Analyzer ( Applied Biosystems). Nukleotidna zaporedja primerji izbranih za PCR v realnem času so prikazani v tabeli S1.

Gradnja standardna DNA

standardni cDNA predlogo (913 podlage) za kvantifikacijo ravni prepis z realnem času PCR konstruirana kot sledi. CDNA fragmenti, ki zajemajo PCR ciljno regijo plus 9-120 osnove spremljajoče regijah AMCase, Chit1, pepsinogen C GAPDH, in beta-aktina smo pomnožili s cDNA miško na želodcu s PCR z uporabo KOD Plus DNA polimerazo (Toyobo) in oligonukleotidov premaz, ki vsebuje restrikcijska mesta za Bgl
II, Xho
sem, Pst
I, ali Ne
I (na 5 'in 3' - konča) v skladu s protokolom proizvajalca. Za naprej in povratne primerji so navedene v tabeli S2. PCR produkt smo očistili s pomočjo čarovnika SV Gel in PCR Clean-Up System (Promega) in nato razgradili z ustreznimi restrikcijskih encimov. Fragmente DNA smo očistili s pomočjo elektroforezo na agaroznem gelu in Clean-Up sistem in nato ligiramo skupaj z ligazo T4 DNK (Toyobo). Ligirani fragmente smo pomnožili z uporabo naprej premaza 5'-GTGGATTCTGTGCCGACAAAGCAGATGGCC-3 'in povratne premaz 5'-TGGGTACATGGTGGTACCACCAGACAGCAC-3' s polimerazo KOD plus DNA. 3'-dA dodamo pomnožene DNA s pomočjo Takara Taq HS (Takara Bio) in produkt čistimo z gelsko elektroforezo, kot je opisano zgoraj. Nastalo DNA smo klonirali v pGEM-T enostaven vektor (Promega) s kloniranjem TA, v skladu z navodili proizvajalca. Nukleotidna sekvenca nastalega plazmida smo potrdili s sekvenciranjem. Lineariziran vsebuje multigene fragment DNA smo pripravili po reamplification iz plazmida DNK z istimi primerji s PCR z uporabo KOD plus DNA polimerazo. Fragmente smo očistili in količinsko, kot je opisano zgoraj, in se uporablja kot standardni DNK.

Priprava Pet cDNA, ki pokrivajo celotno kodiranje Regija

Za potrditev naše absolutno realnem času PCR metodo smo pripravili polno kodiranje cDNA s PCR z uporabo nizov začetnih oligonukleotidov, navedenih v tabeli S3. Pet cDNA, ki pokrivajo celotno kodiranja regije dveh chitinases (Chit1 in AMCase) in referenčnih genov (GAPDH, beta-aktinskih in pepsinogen C) smo pomnožili s PCR iz cDNA miško na želodcu, ki uporabljajo KOD Plus DNA polimerazo in subkloniramo v pGEM-T enostaven vektor po kloniranju TA, kot je opisano zgoraj. Sekvence iz cDNA smo preverili sekvenciranje, kot je opisano na sliki S1. Je subklonirali fragmente smo ponovno pomnožili iz plazmida DNK z enakimi primerji in jih nato uporabimo kot celotno kodirajo regije cDNAs.

standardne krivulje

molarna koncentracija standarda DNA v vsebuje multigene smo izračunali ki temelji na koncentracijo in molekulsko maso. Serijske razredčitve smo pripravili začenši s standardno koncentracijo predlogo, ki je prinesla CT približno 13 (CT = delno mejne vrednosti cikla). Standard DNK smo podvrgli do 10-krat serijske razredčitve, ki sega od 10 ^{0 do 10 7 molekul, in alikvote vzdržujemo zamrznemo pri -20 ° C do uporabe.}

Količinska mRNA Real-time PCR z uporabo standardne krivulje z ali ΔΔ Ct Metoda

vsak vzorec smo pomnožili v treh izvodih, in vsak poskus smo ponovili vsaj dvakrat. S standardno krivuljo, so bile številke Chit1, AMCase, GAPDH, P-aktin in pepsinogen C mRNA molekul samodejno ekstrapolirati z različico MxPro qPCR Software 4.10 (Agilent). Vse vrednosti so izražene kot molekul na 10 ng celotne RNK. V nekaterih primerih so bile vrednosti normalizirajo proti ravneh GAPDH ali beta-aktina mRNA.

Za ocenjevanje naše sedanje metodologije, smo uporabili tudi metodo ΔΔ Ct [21], ki zahteva merjenje praga cikla (Ct) ciljnih genov. Vrednosti Ct so ga izračuna MxPro qPCR programske opreme z uporabo GAPDH ali beta-aktina kot Normalizer.

Rezultati

Vzpostavitev Real-time PCR

z vzpostavitvijo zanesljiva metoda za merjenje izražanja chitinase transkriptov je pomemben korak pri preiskovanju pomen chitinases miš. Real-time RT-PCR je trenutno najbolj občutljiva kvantitativna metoda za odkrivanje tako nizko številčnost mRNA in bogatimi prepise. Najprej smo primerjali vrednosti genske ekspresije genov Chit1 in AMCase (glej sliko 1). Za ovrednotenje ravni chitinase, smo uporabili dva higienski genov, GAPDH in beta-aktina, referenčnih genov, ker so konstitutivno izražen na visoki ravni v večini tkiv in celic [22]. Poleg tega smo se odločili pepsinogen C (znan tudi kot progastricsin) kot referenčno gena v želodcu. Pepsinogen C je aspartinska proteaza, ki deluje kot prebavni encim, ki je proizveden v želodcu. Ta encim predstavlja bistven del želodčne sluznice [23]. Z uporabo teh tri referenčne gene, smo ocenili gensko izražanje Chit1 in AMCase v tkivih miško (slika 1).

Najprej smo zgradil več sklopov primerji za kvantitativno PCR in oceniti njihovo ustreznost based o tem, ali je posamezna živila kot en sam tališčem (TM) in enim trakom na 10% poliakrilamidnem gelu kaže. Nukleotidna zaporedja produktov smo preverili tako. Da bi preučili specifičnosti primerji je bil vsak od produktov PCR pomnožili pod PCR v realnem času pogojih s pomočjo cDNA zmesi z miško tkivo, sestavljeno iz tkiva štirih fazi zarodka in osem odraslih tkiv in preizkusimo v kombinaciji z različnimi metodami. Kot je prikazano na sliki 2A-E, le en vrh pojavil v disociacije krivulje za Chit1 (Tm = 79,7 ° C), AMCase (Tm = 79,1 ° C), GAPDH (Tm = 81,4 ° C), β-aktin (Tm = 82,0 ° C) in pepsinogen C (Tm = 81,4 ° C). Na koncu PCR smo analizirali izdelke na 10% poliakrilamidnem gelu. Gel elektroforeza pokazali jasne posamezne trakove pri pričakovanih velikosti Chit1 (69 bp), AMCase (81 bp), GAPDH (77 bp), β-aktin (71 bp) in pepsinogen C (82 bp) (slika 2F). Nukleotidna zaporedja izdelkov PCR smo določili neposredno, kot je opisano v poglavju Materiali in metode. Potrdili smo, da so proizvodi PCR pomnožili iz ciljnih cDNA (glej sliko 3B). Ti rezultati kažejo, da so PCR produkti posebne amplikoni iz ciljnih cDNA in da mispriming je zanemarljiva v danih razmerah.

Gradnja DNK standardne predloge za Količinska in primerjava izražanja genov med pet genov

smo želeli primerjati raven izražanja dveh chitinases in treh referenčnih genov na isti lestvici (slika 1). V ta namen smo postavili kvantitativni PCR v realnem času sistem, ki je bil potreben za natančno kvantifikacijo (slika 3A) standardno predlogo. zgrajeni smo standardno predlogo DNK za PCR v realnem času z ligiranjem petih ciljnih fragmente v razmerju ena proti ena, nato pa je bila ta ligiramo fragment DNA kloniran v plazmidni vektor, kot je opisano v Materiali in metode oddelku (slika 3a) . The 913-nukleotidov dolg predlogo DNA vsebuje pet cDNA fragmentov, ki zajemajo PCR ciljno regijo plus 9-120 osnove spremljajoče regij in bodo vsebovale restrikcijska mesta za Bgl
II, Xho
I Pst
I in Ne
I (glej podrobnosti v sliki 3B).

Validacija standardne krivulje in Quantitative Real-time PCR sistem

količinska obeh chitinases in referenčnih mRNA temelji na standardnih krivulj. Serijske razredčitve standardne matrične DNA smo uporabili za izdelavo standardne krivulje za primerjavo in oceno realnem času RT-PCR količinsko strategije, ki so bile uporabljene za analizo pet mRNK. Vsak standardna krivulja je bila ustvarjena s pomočjo 10-krat serijske razredčitve standardnega DNK in petih različnih primarnih parov (Slika 4A-E, levo). Eksponentna pomnoževanje smo vzdrževali v širokem razponu ciklov, pri čemer dobimo dinamični razpon sedmih redov (Slika 4A-E, levo). Z uporabo standardne predloge DNK, ki vsebuje pet cDNA fragmentov, lahko enake količine dodeli vseh pet genov v uporabi vsak redčenje za izgradnjo standardne krivulje (slika 4A-E, desno).

Če želite preizkusiti popolno enakost krivulj, je znano koncentracijo celotnega kodira cDNA pomnožili in nato analizirali kot neznani vzorec. Ta test je bil izveden, da se preveri, da je povzročilo testirali redčenje v pričakovani količini. Kot je prikazano na sliki 4A-E, desno, za vsakega testiranega razredčenju uporabljene za sestavo standardno krivuljo so opazili enake količine (glej sliko S2). Količinska nizko številčnost transkriptov in bogate transkriptov nam omogoča, da bi preverili občutljivost in zanesljivost PCR v realnem času, kar pomeni, da je naša PCR v realnem času metoda ponuja širok dinamični razpon kvantifikacije, visoko natančnost in visoko občutljivost (Slika 4a- E, desno). Tako je naša PCR v realnem času metoda zagotavlja zanesljive vrednosti za dve chitinase genov in referenčnih genov na isti lestvici.

Izražanje Chit1 in AMCase v Mouse tkiva

Za študij vivo
regulacijo Chit1 in AMCase izražanju genov, skupno število vzorcev RNA pridobljeni iz štirih fazi zarodka in iz različnih odraslih tkiv, smo analizirali s kvantitativno PCR v realnem času testom z uporabo enotnega standarda DNA (slika 3). Rezultate smo izrazili kot molekul na 10 ng celotne RNK (slika 5 in slika 6). Tako Chit1 in AMCase mRNA so pogosto izražene v tkivih miško (slika 5a in 5b). Jasno posebnosti tkiva so v vzorcev izražanja obeh chitinase mRNA opazili. Visoke stopnje Chit1 mRNA bili odkriti v želodcu miške (slika 5A, zgornji plošči), sledijo oči in pljuč. Chit1 mRNA so odkrili pri nizkih, vendar zlahka zaznavne, ravneh v drugih tkivih (slika 5A, spodnji plošči). AMCase mRNA je pretežno odkrita v želodcu, ki mu sledi submaksilarne žlezi (slika 5B, zgornja plošča), vendar je bila prisotna tudi v drugih tkivih (slika 5B, spodnji plošči). Prav tako

Nato smo primerjali razmerja AMCase da Chit1. Številka kopije vsakega mRNA je bila določena z uporabo enake standardne raztopine. Ugotovili smo, da želodec in submaksilarne žleze pretežno izražena AMCase mRNA (slika 5C, zgornja plošča). Drugi tkiva obravnavane v tej študiji, ki bolj AMCase kot Chit1 in Chit1 je razširjena le v očeh (slika 5C, spodnji plošči).

Naslednja preučiti relativno kvantifikacijo v prvotnih podatkov, predstavljenih na sliki 5, ki je bila izražena kot molekul na 10 ng celotne RNK, z uporabo higienski genov, kot je opisano v materialih in metodah. Rezultati so bili prikazani kot dodatne informacije na sliki S3 (podatki, je normaliziralo do GAPDH) in Slika S4 (za beta-aktina normalizirajo). Nato smo analizirali podatke, prikazane na sliki 5, z metodo ΔΔ Ct [21] in prikazane kot dodatne informacije v sliki S5 (s GAPDH normalizirane) in Slika S6 (za beta-aktina normalizirane). Če primerjamo relativne izraz s temi absolutnih in relativnih metod kvantifikacijo odkriti, ni bilo bistvene razlike med podatki, razen za Chit1 mRNA izražanja, ki je bila najbolj bogato, izraženih v očeh, ko normaliziralo do beta-aktin (glej sliko 5, slika S3 in Slika S4). Podobne rezultate smo dobili tudi relativno kvantifikacijo metodi ΔΔ Ct [21] (glej sliko 5, slika S5 in slika S6). Vendar pa ni bilo mogoče neposredno ovrednotiti medsebojne raven izražanja Chit1 in AMCase pri analizi po metodi ΔΔ Ct.

Analiza Chit1, AMCase, Pepsinogen C, GAPDH, in beta-aktina v Lung in želodcu tkiv

Številne študije so bile izvedene na patofiziologijo chitinases sesalcev v pljučnih tkivih. V tej študiji smo pokazali, da je AMCase mRNA pretežno izražena v miši želodčne tkivih (slika 5). Primerjali smo tudi raven izražanja chitinases in referenčnih genov z uporabo cDNA, pripravljene iz pljuč in želodca tkiva 3-mesečno starih miših (n = 5). Kvantitativni podatki so prikazani na sliki 6. Ko so nivoji Chit1 nastavljen na 1,0, so relativni ekspresijski nivoji cDNAs AMCase, 14; GAPDH, 196; in β-aktin, 681 pri miših pljučnega tkiva (slika 6A). Ta rezultat kaže, da je pljučni tkiva iztisne več AMCase kot Chit1, čeprav je bila stopnja AMCase izraz nižja od dveh oskrbniška genov.

V želodcu tkiva, ko je bila stopnja Chit1 določena na 1,0, relativnih stopnjah izražanja so AMCase, 721; pepsinogen C, 2261; GAPDH, 61; in β-aktin, 127 (slika 6B). Oba GAPDH in beta-aktin geni so dobro znani higienski gene in so konstitutivno izražen na visoki ravni v večini tkiv in celic. Pepsinogen C (progastricsin) je asparaginska proteaza, ki deluje kot prebavnega encima, ki se proizvaja v želodcu. Ta encim je glavna sestavina želodčne sluznice [23]. Stopnja izraz AMCase precej višji od tistih GAPDH in beta-aktina in je primerljiva s stopnjo pepsinogen C. Ti rezultati kažejo, da je želodec AMCase glavni prepis v želodčni sluznici in kažejo, da je verjetno, da igrajo pomembno je to encim fiziološke vloge v želodcu.

prav tako smo ponovno preučiti relativno izražanje Chit1, AMCase in pepsinogen C prikazano na sliki 6, ob uporabi higienski gene s to metodo, kot je opisano zgoraj. Rezultati so bili prikazani kot dodatne informacije na sliki S7 (za GAPDH normalizirane) in slika S8 (za beta-aktina normalizirane). Ni bilo bistvene razlike med sliki 6, Slika S7 in slika S8.

Pogovor

Tako Chit1 in AMCase so mislili, da pomaga pri obrambi gostiteljici pred patogeni, ki vsebujejo citin [3], [ ,,,0],9]. Poleg tega AMCase je efektor molekula v alergijskega vnetja. Te chitinolytic encimi igrajo pomembno vlogo pri patofiziologiji alergijskih odzivov dihalnih poti v modelih miši astme. Relativno malo je znano, pa je o vivo
ravni medsebojnega izražanjem Chit1 in AMCase. Količinska mRNA lahko ustvarjajo uporabne in biomedicinsko pomembne informacije. V tej študiji smo ugotovili, kvantitativno PCR v realnem času sistem, ki lahko določanje količine mRNA dveh chitinases sesalcev in za primerjavo teh vrednosti s tistimi referenčnih genov z isto lestvico. Naši rezultati kažejo, da je AMCase pretežno izražena v želodcu miško.

Kvantitativna realnem času RT-PCR predstavlja pomemben napredek v količinskem mRNA in omogoča detekcijo ekspresije določenega gena interesa na molekularnem nivoju . Obstaja veliko poročil o odkritju izjemno nizke ravni mRNA uporabo te tehnologije. Vendar pa je v realnem času RT-PCR ni veliko uporablja, ker ima še vedno omejitve v količinskem več mRNK z isto lestvico. Zgradili smo standardno predlogo DNA, ki obsega pet cDNA fragmentov (vsaka ~200 baz). Ti delčki so delci dve chitinases, enega označevalca in dva oskrbniška genov in so bile združene v eno-to-one razmerjih (slika 3A). GAPDH in β-aktin, najpogosteje uporabljene gospodinjstva geni, so bili vključeni kot notranjih kontrol in referenc za PCR. Poleg tega smo uporabili pepsinogen C kot markerskega gena, ker je izdelan na visoki ravni v želodcu [23]. Ta metoda je omogočilo popolno kvantifikacijo števila Chit1 in AMCase mRNA molekule, kot tudi številne reference mRNA molekule, po 10 ng celotne RNK (mol /10 ng) (slika 5 in slika 6). Poleg tega bi se lahko preučila relativno kvantifikacijo ravni Chit1 in AMCase mRNA z uporabo dveh higienski genov, GAPDH in β-aktin (dodatne informacije Slika S3 in Slika S4).

Relativna kvantifikacija je lažje izvesti kot absolutni količinsko, ker Kalibracijska krivulja ni potrebno. V relativno kvantifikacijo, so nivoji mRNA gena obresti v primerjavi s tistimi iz oskrbniška genov [21]. Vendar pa ta metoda količinsko ne primerjavo ravni različnih genskih transkriptov v enakem obsegu. Čeprav je naša metoda zahteva več korakov, povezanih z gradnjo standardni DNA in s procesi validacije, lahko ta metoda zagotavlja izražanje genov podatke, ki so neposredno primerljive med geni (sliki 5 in slika 6). Naš PCR v realnem času zagotovili velik dinamični razpon kvantifikacije in visoko občutljivostjo in količinsko nizko številčnost transkriptov nam je omogočilo, da bi preverili občutljivost in zanesljivost naše metode (slika 4). Ta tehnika je zelo primerna za količinsko in primerjavo mRNA v več genov, ki uporabljajo isto lestvico. Naša sedanja metoda se uporablja za biomedicinske tehnike, kot tudi s kliničnimi in praktične uporabe.

V tej preiskavi, smo ugotovili, da je AMCase mRNA sintetizira na izjemno visoki ravni v miš želodcu glede na ravni oskrbniška genov (slika 5 in slika 6). Stopnja AMCase mRNA je primerljiv tistemu pepsinogen C (progastricsin) mRNA, ki je glavna sestavina želodčne sluznice v želodcu (slika 6B). Poleg želodcu, je bilo ugotovljeno tudi submaksilarne žleze za izražanje velike količine AMCase (slika 5). Kot je za sintezo chitinase mRNK sesalcih, sta želodec in submaksilarne žleze šteti pomembnih tkiv za izdelavo ogromno AMCase v miško.

klorovodikova kislina se izloča v želodcu, ki ustvarja kislih pogojih za prebavo beljakovin, ki ga pepsina pri približno pH 2 [23], [24]. Mouse AMCase kaže stabilnost globoko kisline in je najbolj aktiven pri pH 2,0, ki se razlikuje od drugih encimov miško [8]. Nenavadno pH stabilnost in odvisnost AMCase miške na kislih pogojih omogočajo učinkovito prebavo chitinous materialov pod kislimi pogoji. Pripomba, da je AMCase izraženi predvsem v želodcu kaže na njeno morebitno funkcijo pri predelavi hrane. Divje miši jedo živila, ki vsebujejo hitina, kot so žuželke, medtem ko miši hranijo v laboratoriju jesti umetne prehrane, ki vsebujejo kvas, Posušeni pivski ", ki vsebuje tudi hitin v celični steni. Tako lahko AMCase deluje kot prebavni encim, ki razgrajuje polimerno hitin v želodčne vsebine.

Najvišjo stopnjo Chit1 je bila izražena tudi v želodcu miške. Vendar je bila raven Chit1 izraz v želodcu 1/721 da raven AMCase izražanja in je bila nižja od ravni ekspresije dveh oskrbniška genov, GAPDH in β-aktina (slika 6A). Poleg tega Chit1 nima nobene chitinolytic aktivnost pri pH želodca sokov, ki je približno pH [5] 2, [11]. Dokazano je, da je Chit1 proizveden na mestih skoraj nevtralnim pH, kot ne-žleznega dela želodca in tankega črevesa [25]. Tako Chit1 ne prispeva k chitinase aktivnost v želodcu miške.

Čeprav je AMCase izraženo pretežno v želodcu in submaksilarnih žlez, vsa druga tkiva, obravnavane v tej študiji je izrazil nizke, vendar zaznavne, raven Chit1 in AMCase . Ravni izraz za Chit1 in AMCase so bile nižje od cen oskrbniška genov v teh tkivih. Chit1 prikazuje širok pH optimum pri približno pH 5 [5], medtem ko je primarni optimalni pH AMCase je pH 2, in sekundarna pH optimum je pri pH 4-7, pri čemer AMCase ohrani manj kot 30% svoje aktivnosti pri pH 2, to območje pH [8]. Oba Chit1 in AMCase prebavo naravni hitin in hitozan preko endo-chitinase dejavnosti in proizvodnjo chitobiose [8], [26]. Čeprav AMCase prevladuje nad Chit1 v mnogih tkivih miško, da ne sme biti nobenih pomembnih razlik v njihovi chitinolytic dejavnosti v mišjih tkivih.

Več AMCase mRNA kot Chit1 mRNK je bilo opaziti v večini tkiv z miško, razen za oči. Naši rezultati kažejo tudi, da se genski izraz Chit1 lahko razvojno urejeno, kar pomeni, da igra vlogo v zorenjem. Študij ureditev izražanju chitinases sesalcev lahko dal vpogled v fizioloških vlog teh encimov. Podrobna opredelitev promotorja regijah Chit1 in AMCase genov, kot tudi identifikacija cis
- in bodo trans
-acting dejavnike je potrebno razumeti selektivno izražanje teh encimov <. br>

Čeprav sesalci ne proizvajajo hitina ali hitina sintazo, so nenehno izpostavljeni tega polimera z izpostavljanjem parazitov in patogenov, ki vsebujejo citin. Substrat za chitinases sesalcev predvidoma okolja hitina, kot je ugotovljeno v gliv ali parazitskih nematode. V pljučih, lahko oba encimi deluje kot del obrambnega mehanizma gostiteljice proti patogenom, ki vsebujejo citin, kot so okoljsko plesni in pršic, ki povzročajo dihalnih poti alergije.

• Plos ONE: Analiza želodec in črevesje Microbiomes vzhodnega ostrige (Crassostrea virginica) iz obalnih Louisiana, ZDA
• Plos ONE: Fibroblastni Growth Factor 10-Fibroblastni Growth Factor Receptor 2b posredovana signalizacija ni potrebna za odrasle žleznega trebuhu Homeostazo