PLoS One: kitináz mRNS-szint kvantitatív PCR használata Single Standard DNS: Savas Emlős kitináz jelentős átirata az egér Gyomor

absztrakt katalógusa

kitinázoknak hidrolizál a β-1-4 glikozidos kötések kitin, egy fő szerkezeti összetevője gombák, rákok és rovarok. Bár az emlősök nem termelnek kitin vagy szintáz, kifejezik két aktív kitinázoknak, kitotriozidáz enzim szintjét (Chit1) és savas emlős kitináz (AMCase). Ezek emlős kitinázok felkeltette jelentős figyelmet miatt megnövekedett expresszió egyének számos patológiás állapotok, beleértve a Gaucher-kór, Alzheimer-kór és az asztma. Azonban a hozzájárulás ezen enzimek a patofiziológiájában az ilyen betegségek még meg kell határozni. Mennyiségi meghatározására Chit1 és AMCase mRNS-szintek, és az összehasonlítást az említett szinteket a szintek jól ismert referencia gének generálhat hasznos és biomedically vonatkozó információkat. Kezdetben, létrehoztunk egy kvantitatív valós idejű PCR-rendszer, amely standard DNS által termelt ligálásával a cDNS-fragmentumokat a megcélzott gének. Ez a rendszer lehetővé tette számunkra, hogy számszerűsíteni, és hasonlítsa össze az expressziós szintek a kitinázok és a referencia gén ugyanazon a skálán. Azt találtuk, hogy AMCase mRNS szintetizálódik a rendkívül magas az egér gyomorban. A szint ezen mRNS az egér gyomorban volt 7- és 10-szer magasabb, mint a szinten a háztartási gének, és hasonló volt a szint az mRNS pepszinogén C (progastricsin), a fő komponense a gyomor nyálkahártyáját. Így AMCase mRNS egyik fő átirat egér gyomorban, ami arra utal, hogy a AMCase működik, mint egy emésztő enzim, amely lebontja a polimer a kitin és részeként a befogadó védekezés ellen kitin-tartalmú kórokozók a gyomortartalom. A módszer alkalmazható a számszerűsítésére mRNS több gén több példányok ig terjedő skála segítségével. Katalógusa

Citation: Ohno M, Cuda K, Sakaguchi M, Y Sugahara, Oyama F (2012) kitináz mRNS szintek Quantitative PCR a Single standard DNS: Savas emlős kitináz jelentős átirata az egér gyomor. PLoS One 7 (11): e50381. doi: 10,1371 /journal.pone.0050381 katalógusa

Szerkesztő: Dominik Hartl, Tübingeni Egyetem, Németország katalógusa

Beérkezett: augusztus 6, 2012; Elfogadva: október 19, 2012; Megjelent: november 21, 2012 katalógusa

Copyright: © 2012 Ohno et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatta a projekt kutatási támogatásával a Kutatási Institute of Science and Technology, Kogakuin Egyetemen. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

kitin, egy lineáris polimer β-1-4-kapcsolt N
-acetil-D-glükózamin, a második leggyakoribb poliszacharid a természetben található. Úgy működik, mint egy jelentős strukturális komponense gombák, rákok, rovarok és de nem találtam az emlősökben [1]. Kitinázok hidrolizáljuk a β-1-4 glikozidos kötések a kitin polimer. Bár emlősök nem termelnek kitin vagy szintáz, kifejezik két aktív kitinázok, kitotriozidáz enzim szintjét (Chit1) és savas emlős kitináz (AMCase) [2], [3].

A Chit1 szint jelentősen emelkedett a plazmában betegek Gaucher-betegség, egy autoszomális recesszív lizoszomális tárolási betegség [4]. Chit1 volt az első emlős kitináz tisztítandó és klónozták [5], [6]. A recesszív módon öröklődő hiány Chit1 tevékenység gyakran megfigyelhető a kaukázusi [7]. AMCase fedezték miatt kompenzáló szerepét, és nevezték annak savas pH optimum [8]. Ezek emlős kitinázok tekintik része a gazda ellen irányuló védekezési mechanizmusa kitin-kórokozókat tartalmazó és paraziták [3], [9].

Mind Chit1 és AMCase szekretálódnak fehérjék molekulasúlya körülbelül 50 kDa. Mindkét fehérje tartalmaz egy N-terminális katalitikus dómén, egy csukló-régió, és egy C-terminális kitin-kötő domént [6], [8]. Egér AMCase mutat szekvencia homológiát Chit1, egy azonossága 52% és a hasonlóság 60% [10]. Annak ellenére, hogy ezek a szerkezeti hasonlóságok, ezek az enzimek jelentősen különböznek egymástól azok enzimatikus viselkedésének savas pH. AMCase mutat nagymértékben pH-optimum pH = 2 és kevésbé nyilvánvaló, az optimális pH-n, 4-7 [8], míg Chit1 mutatja, csak egy széles pH-optimum körülbelül pH = 5 [5], [11].

Emlős kitinázok vonzott jelentős figyelmet miatt megnövekedett expresszió egyének különböző patológiás körülmények között. Chit1 fokozott egyének Gaucher-kór [4], a krónikus obstruktív tüdőbetegség (COPD), [12] és az Alzheimer-kór [13] és a dohányosok [14]. AMCase expressziója és aktivitása is fokozódik során allergiás légúti reakciók egér modellekben az asztma [15]. Ezen túlmenően, a polimer a kitin indukál AMCase kifejezés és az immunsejtek kapcsolatos allergia és az asztma. [16] Ezek az eredmények határozottan arra utalnak, hogy chitinolytic enzimek fontos szerepet játszanak számos patofiziológiás állapotokban. Azonban a hozzájárulás ezen enzimek a patofiziológiájában az ilyen betegségek még meg kell határozni.

mennyiségi meghatározására Chit1 és AMCase mRNS-szintek, és az összehasonlítást az említett szinteket a szintek jól ismert referencia gének fontos lépéseit való betekintést in vivo katalógusa szabályozásában emlős fehérjéket. Nemrégiben, a valós idejű RT-PCR-óta használják számszerűsítésére mRNS mennyiségére számos gén expressziós vizsgálatok [17] - [20], mert ez a módszer megfelelően érzékeny származó mRNS akár egyetlen sejt. Real-time PCR általában magában foglalja a normalizálására expressziós szintjének a számunkra érdekes gén azokkal a háztartási gének, amelyek úgy gondolják, hogy következetesen kifejezett összes minta. Azonban ez a módszer nem számszerűsítése mennyiségek összehasonlítására a különböző géntranszkripciók azonos skálán. Katalógusa

A jelenlegi vizsgálatban, kifejlesztettünk egy kvantitatív valós idejű RT-PCR rendszer, amely a szabványos DNS mennyisége ligálásával cDNS-fragmentumokat a megcélzott gének. Ez a rendszer lehetővé tette számunkra, hogy számszerűsíteni, és hasonlítsa össze az expressziós szintek a kitinázok és a referencia gén ugyanazon a skálán. Eredményeink azt mutatják, hogy AMCase egyik fő átirat az egér gyomorban, ami arra utal, hogy a megfelelő fehérje működik, mint egy emésztő enzim, amely lebontja kitin-tartalmú ételek és részeként a befogadó védekezés ellen kitin-tartalmú kórokozók a gyomortartalom.

anyagok és módszerek

RNS, RNS-izolálás és cDNS előállítása

az egér teljes RNS mester panel (Clontech Laboratories) alkalmaztunk, hogy megvizsgálja a szöveti eloszlása ​​transzkriptumok. Elemeztük négy különböző embrionális fázisok és nyolc felnőtt szövetekben. Ezen túlmenően, RNS-t izoláltunk a tüdő és a gyomor 3 hónapos hím egerekben. C57BL /6J egerek (CLEAR Japán) tenyésztették a RIKEN Brain Science Institute Animal Facility. A kísérleteket végeztünk megfelel az intézményi előírásoknak. A protokoll hagyta jóvá a Bizottság Etikai Állatkísérletek a RIKEN Brain Science Institute (Jóváhagyás száma H19-2B013). Minden műtétet végeztünk a dietil-éter, mint egy érzéstelenítő, és minden erőfeszítést tettek arra, hogy minimálisra csökkentsék a szenvedést. Azok a szövetek mRNS preparátumot által nyújtott dr. Miyazaki és Nukina a RIKEN Brain Science Institute. Teljes RNS-t állítunk elő a tüdő és a gyomor TRIzol reagens (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Eltávolításához a nyomokban a szennyező genom DNS-t, a teljes RNS-mintát kezeltünk RQ1 RNase-Free DNase (Promega), a gyártó által ajánlott protokollt. A koncentrációk a nukleinsavakat mérésével határozzuk meg 260 nm-en egy BioPhotometer Plus (Eppendorf). Mind a teljes RNS minták (3 ng) vetettük alá, a reverz transzkripció random hexamerek primerként. A reakcióelegyet (15 ul) az enzim puffer [50 mM Tris-HCl (pH = 8,3), 75 mM KCl-t, és 3 mM MgCI _{2], 100 ng random hexamerek, 10 mM ditiotreitolt és 0,5 mM dezoxinukleotid -trifoszfát (dNTP). Melegítés után az oldatot 60 ° C-on 5 percig, és inkubáljuk a keveréket 37 ° C-on 5 percig, 200 U rekombináns egér leukémia vírus reverz transzkriptáz (Invitrogen) adtunk hozzá, és az elegyet inkubáljuk 37 ° C-on 45 percig . A reverz transzkripciós melegítéssel leállítottuk 95 ° C-on 5 percig.}

Real-time PCR

alapozók A real-time RT-PCR alapján terveztük Primer Express szoftver (Applied Biosystems) és szintetizáljuk kereskedelmileg (Sigma-Genosys, Sigma-Aldrich). A PCR-reakciókat hajtottunk végre egy végső térfogata 13 ul, amely 2 × SYBR Green Master Mix (Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix, Agilent), 2,7 ng egér cDNS-t vagy megfelelő hígításait a külső szabványok (lásd alább), valamint a megfelelő koncentrációi a primerek a kitinázok, pepszinogén C, gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH), illetve β-aktin. Szabványos valós idejű PCR-körülmények a rendszer (Mx3005P, Agilent) alkalmaztunk: egy kezdeti denaturáció és polimeráz aktiválási lépés 10 percig 95 ° C hőmérsékleten, majd 40 ciklus követett denaturálással 95 ° C-on 1 percig, 55 ° C-on 30 másodperc, és 72 ° C-on 1 percig. Olvadás görbéket erősítés után. A PCR-termékeket elektroforézisnek 10% -os poliakrilamid gélen, és analizáltuk a lumineszcens képanalizátorral (ImageQuant LAS 4000, GE Healthcare). A PCR-oldatot ExoSAP-IT (USB-termékek) alkalmazásával a gyártó utasításai kiküszöbölésére nem épült primerek és dNTP-k, és a termékeket szekvenáltuk az ABI PRISM Big-Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit és egy 3130 Genetic Analyzer ( Applied Biosystems). A nukleotid szekvenciái primerek kiválasztott valós idejű PCR táblázat S1. Katalógusa

Építőipari szabvány szerinti DNS katalógusa

A szokásos sablon cDNS (913 bázis) számszerûsíthetõk transzkripciós szint real-time PCR-t a következő módon. A cDNS-fragmenseket, amely a PCR-célterület plusz 9-120 bázisok a szegélyező régiók AMCase, Chit1, pepszinogén C, GAPDH, és β-aktin amplifikáljuk egér gyomor cDNS-t PCR alkalmazásával KOD Plus DNS-polimeráz (Toyobo) és oligonukleotidok primer tartalmazó restrikciós helyei Bgl katalógusa II XhoI katalógusa I, Pst katalógusa I, vagy a Nem
I (az 5'-3 ' - vége), a gyártó protokollja szerint. Az előre és hátra primerek táblázatban vannak felsorolva az S2. A PCR-termékeket tisztítottuk a Wizard SV Gel és PCR Clean-up rendszer (Promega), és azután megemésztettük a megfelelő restrikciós enzimekkel. A DNS-fragmenseket tisztítottuk agaróz gél elektroforézissel és a tisztítási rendszer, majd ligáljuk T4 DNS-ligázzal (Toyobo). A ligált-fragmenst amplifikáltunk a forward primer 5'-GTGGATTCTGTGCCGACAAAGCAGATGGCC-3 'és a reverz primer 5'-TGGGTACATGGTGGTACCACCAGACAGCAC-3' a KOD Plus DNS-polimeráz. 3'-da adunk az amplifikált DNS-t Takara Taq HS (Takara Bio), és a terméket gél-elektroforézissel tisztítjuk a fent leírtak szerint. A kapott DNS-t pGEM-T Easy vektorba (Promega) keresztül a TA klónozó szerint a gyártó utasításai szerint. A nukleotid-szekvenciáját A kapott plazmidot szekvenálással igazoljuk. A linearizált multigén-DNS-t tartalmazó fragmentumot úgy állítottuk elő, reamplifikációs a plazmid DNS-t az azonos primerekkel PCR-rel KOD Plus DNS-polimeráz. A fragmenseket tisztítjuk és mennyiségileg a fent leírtak szerint, és ezt használjuk a standard DNS-t.

előállítása Öt cDNS-ek, amely az egész kódolórégiót

validálása abszolút valós idejű PCR-módszer, készítettünk teljes kódoló cDNS-eket PCR-rel a primer szettek táblázatban felsorolt ​​S3. Öt cDNS, amely az egész kódoló régióit két kitinázok (Chit1 és AMCase) és a referencia gén (GAPDH, β-aktin és pepszinogén C) PCR-rel amplifikáltuk az egér gyomor cDNS KOD Plus DNS-polimeráz, és szubklónoztuk a pGEM-T Easy vektorba keresztül TA klónozó, a fent leírtak szerint. A szekvenciákat a cDNS-eket, szekvenálással ellenőriztünk, ábrán bemutatott S1. A szubklónozott fragmenseket amplifikáltuk a plazmid DNS-t az azonos primereket és ezután használjuk, mint az egész kódolórégiót cDNS-eket.

standard görbék

az a moláris koncentrációja a multigén-DNS-t tartalmazó szabványos számítottuk koncentrációján alapul, és a molekulatömeget. Sorozathígításait állítottuk elő, kezdve a szabványos sablon koncentráció, amely engedett egy Ct-mintegy 13 (Ct = frakcionált küszöb ciklus érték). A standard DNS vetettük alá 10-szeres hígítási sorozatokból, kezdve a 10 ^{0-10 7-molekulák, és az adagokat fagyasztva tartottuk -20 ° C-on tároltuk felhasználásig.}

számszerűsítése mRNS real-time PCR-rel a standard görbék vagy a ΔΔ Ct módszer

minden egyes mintát amplifikáljuk három párhuzamosban, és minden egyes kísérletet megismételjük legalább két alkalommal. A standard görbe, a számok az Chit1, AMCase, GAPDH, β-aktin, és pepszinogén C-mRNS-molekulák extrapoláltuk automatikusan segítségével a MxPro QPCR Software 4.10 verzió (Agilent). Minden értéket fejeztük molekulák per 10 ng teljes RNS. Bizonyos esetekben, az értékeket normalizáltuk ellen szintje GAPDH vagy β-aktin mRNS-t.

értékeli a jelenlegi módszertan, mi is alkalmazzuk a ΔΔ Ct módszer [21], amely előírja a mérési ciklus küszöbérték (Ct) a megcélzott gének. Ct értékeket számoltuk MxPro QPCR szoftver segítségével GAPDH vagy β-aktin, mint egy normalizáló. Katalógusa

Eredmények katalógusa

létrehozása a Real-time PCR vizsgálat katalógusa

A létesítmény egy megbízható módszer a mérési expressziójának kitináz transzkriptumok egy fontos lépés a vizsgáló jelentősége egér kitinázok. Real-time RT-PCR, jelenleg legérzékenyebb kvantitatív módszert kimutatására egyaránt alacsony bőség mRNS és bőséges átiratokat. Először összehasonlítottuk a gén expressziós szintjét a Chit1 és AMCase gének (lásd 1. ábra). Ahhoz, hogy értékelje a kitináz szintek, használtuk két háztartási gének, GAPDH és β-aktin, mint referencia gének mert konstitutívan magas szinten expresszálódnak a legtöbb szövetben és sejtekben [22]. Ezen kívül, úgy döntöttünk, pepszinogén C (más néven progastricsin), mint a referencia gén a gyomorban. Pepszinogén A C-aszparaginsav-proteáz, amely működik, mint egy emésztő enzim és termelődik a gyomorban. Ez az enzim képezi jelentős komponense a gyomornyálkahártya [23]. Ezekkel a három referencia gén értékeltük a gén kifejeződését Chit1 és AMCase egér szövetekben (1. ábra). Katalógusa

Először tervezett több láncindító kvantitatív PCR és értékelték azok alkalmasságát az alapján, hogy adtak az egyes termékek , amint azt az egyetlen olvadási hőmérséklet (Tm), és egyetlen csíkot egy 10% -os poliakrilamid gélen. A nukleotid szekvenciákat a termékek is ellenőrizhető. Ahhoz, hogy megvizsgálja a specificitását a primerek, mind a PCR-termékek amplifikáltuk alatt valós idejű PCR-körülmények használatával egy egér szöveti cDNS keverékben, amely szövetek négy embrionális szakaszában, és nyolc felnőtt szövetekben és mértük kombinálva különböző módszerekkel. Amint az ábrán a 2A-E, csak egy csúcs jelenik meg a disszociációs görbék Chit1 (Tm = 79,7 ° C), AMCase (Tm = 79,1 ° C), a GAPDH (Tm = 81,4 ° C), β-aktin (Tm = 82,0 ° C), és pepszinogén C (TM = 81,4 ° C). Végén a PCR, elemeztük a termékek egy 10% -os poliakrilamid gélen. Gél-elektroforézis világosan megmutatta, hogy az egyes csíkok a várt méretű Chit1 (69 bp), AMCase (81 bp), GAPDH (77 bp), β-aktin (71 bp) és a pepszinogén C (82 bp) (ábra 2F). A nukleotid szekvenciákat a PCR termékeket közvetlenül határozzuk meg, ahogy az a Anyagok és módszerek részben. Igazoltuk, hogy a PCR-termékeket amplifikáltuk a cél-cDNS-ek (lásd a 3B, ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a PCR-termékeket specifikus amplikont a megcélzott cDNS, és hogy mispriming elhanyagolható kísérleti körülményeink.

Építőipari a szabvány DNS-templátként a számszerűsítése és összehasonlítása Gene Expression közül öt gén katalógusa

kívánta összehasonlítani expressziós szintjét két fehérjéket, és három referencia gén azonos (1. ábra). Erre a célra létrehoztunk egy kvantitatív valós idejű PCR-rendszer, amely egy szabványos sablon szükséges volt pontos mennyiségi meghatározására (3A ábra). Mi épített egy szabványos templát DNS valós idejű PCR-rel történő ligálásával az öt cél fragmenseket egy egy-az-egy tényezőt, majd ezt ligáit DNS-fragmenst kiónoztuk a plazmidvektorba leírt Anyagok és módszerek fejezetében (3A ábra) . A 913-nukleotid hosszúságú DNS templát öt, cDNS fragmentumokat lefedő PCR-célterület plusz 9-120 bázisok a szegélyező régiók és tartalmazta a restrikciós helyei Bgl katalógusa II Xho katalógusa I Pst katalógusa I és Nem
I (a részleteket lásd 3B). katalógusa

érvényesítése a kalibrációs görbe a kvantitatív valós idejű PCR System katalógusa

a számszerűsítése mind a fehérjéket, és a referencia-mRNS támaszkodik standard görbék. Sorozathígításait a szokásos sablon DNS-t használtuk fel standard görbét összehasonlítani és értékelni a valós idejű RT-PCR technika stratégiák segítségével elemeztük az öt mRNS. Minden standard görbét generáltunk, 10-szeres sorozathígításait a standard DNS-t és az öt különböző primerpárokat (4a ábra-E, bal). Exponenciális amplifikáció alatt fennmaradt széles ciklusok, így kapunk egy dinamikus tartománya hét nagyságrenddel (ábra a 4A-E, bal). Segítségével a szabványos sablon tartalmazó DNS öt cDNS fragmentumokat, egyenlő mennyiségű hozzárendelhető mind az öt gén minden hígítási használat megépíteni a standard görbék (4A-E, jobbra). Katalógusa

A teszt az abszolút egyenlőség a görbék, ismert koncentrációban, a teljes kódoló cDNS-t amplifikáltunk, és ezt követően analizáltuk, mint egy ismeretlen mintában. Ezt a vizsgálatot azért végeztük, hogy ellenőrizze, hogy minden egyes vizsgált hígítás eredményezte a várt mennyiségben. Amint a 4A ábrán látható-E, jobbra, egyenlő mennyiségű észleltek minden vizsgált hígítás megalkotásához használt standard görbe (lásd az ábrát S2). Számszerűsítésére alacsony bőség átiratok és bőséges átiratok lehetővé teszi számunkra, hogy érvényesítse a érzékenységét és megbízhatóságát real-time PCR, jelezve, hogy a real-time PCR módszerrel egy nagy dinamikatartományt számszerűsítés, nagy pontosságú és nagy érzékenységű (ábra 4a- E, jobbra). Így a valós idejű PCR-módszer megbízható értékeket két kitináz gén és referencia gén azonos skálán. Katalógusa

kifejezése Chit1 és AMCase Egér szövetek katalógusa

A tanulmány a in vivo
szabályozásában Chit1 és AMCase génexpressziót, a teljes RNS-mintákat kivont négy embrionális szakaszában, és a különböző felnőtt szövetekben, elemeztük kvantitatív valós idejű PCR-assay alkalmazásával a Single Standard DNS-t (3. ábra). Az eredményeket fejeztük molekulák per 10 ng teljes RNS-t (5. ábra és 6. ábra). Mind a Chit1 és AMCase mRNS széles körben kifejezve egér szövetekben (5A és 5B). Tiszta szöveti sajátosságok volt megfigyelhető expressziós mintázata mindkét kitináz mRNS-ek. Magas Chit1 mRNS kimutatható volt az egér gyomorban (5A ábra, felső panel), majd a szemet és a tüdőt. Chit1 mRNS-t detektáltunk alacsony, de könnyen kimutatható, a szintek más szövetekben (5A ábra, alsó panel). AMCase mRNS-t túlnyomórészt kimutatható a gyomorban, majd a állkapocs alatti mirigyet (5B, ábra, felső panel), de szintén jelen volt egyéb szövetekben (5B, ábra, alsó panel).

ezután összehasonlítjuk az arányai AMCase a Chit1. Kópiaszámának minden egyes mRNS alkalmazásával határoztuk meg ugyanannak a standard hígításokat. Azt találtuk, hogy a gyomor és a állkapocs alatti mirigyet túlnyomórészt kifejezve AMCase mRNS (5C, felső panel). A másik vizsgált szövetben ebben a vizsgálatban készített több AMCase mint Chit1, és Chit1 volt elterjedt csak a szemek (5C, alsó panel).

következő vizsgált relatív mennyiségi meghatározására az eredeti adatokat 5. ábrán mutatjuk be, amely fejeztük molekulák per 10 ng teljes RNS felhasználásával háztartási gének leírt anyagok és módszerek. Az eredményeket a megalapozó információként ábra S3 (adatokat normalizáltuk GAPDH) és ábra S4 (normalizált által β-aktin). Ezután elemeztük adatokat az 5. ábrán látható a ΔΔ Ct módszer [21], és kimutatták, a kiegészítő információkat ábrán S5 (normalizált által GAPDH) és ábra S6 (normalizált által β-aktin). Ha összehasonlítjuk a viszonylagos expressziós által észlelt a jelen abszolút és relatív mennyiségi meghatározási módszerek, nem volt szignifikáns különbség az adatok között, kivéve a Chit1 mRNS expressziója, melyet a legtöbb bőségesen fejezik ki a szemét, amikor normalizáltuk β-aktin (lásd 5. ábra, ábra S3 ábra S4). Hasonló eredményeket kaptak a relatív koncentrációk alapján a ΔΔ Ct módszer [21] (lásd az 5. ábrát, ábra S5 és ábra S6). Azonban nem tudtunk közvetlenül értékelni kölcsönös expressziós szintjét Chit1 és AMCase amikor elemezzük a ΔΔ Ct módszer.

Elemzés Chit1, AMCase, Pepszinogén C, GAPDH, és β-aktin a tüdő- és gyomorrák A szöveteket

Számos tanulmány végeztek kórélettanáért emlős kitinázok a tüdő szöveteiben. Ebben a vizsgálatban kimutattuk, hogy AMCase mRNS túlnyomórészt kifejezve egér gyomor szövetekben (5. ábra). Is összehasonlítottuk az expressziós szintek a kitinázok és a referencia gén felhasználásával a cDNS-eket készítünk a tüdő és a gyomor szöveteinek 3 hónapos egereket (n = 5). A kvantitatív adatokat a 6. ábrán mutatjuk be Amikor a Chit1 szinteket beállítva 1,0, a relatív expressziós szintjének cDNS-eket AMCase, 14; GAPDH, 196; és β-aktin, 681 az egér tüdőszövetben (6a ábra). Ez az eredmény azt jelzi, hogy a tüdő szöveteiben expressz több AMCase mint Chit1, bár a AMCase expressziós szintje alacsonyabb volt, mint a két háztartási gének.

gyomor szövetekben, amikor a Chit1 szint állítottuk be 1,0, a relatív expressziós szintek voltak AMCase, 721; pepszinogén C, 2261; GAPDH, 61; és β-aktin, 127 (6B). Mind a GAPDH és β-aktin gén jól ismert háztartási gének és konstitutívan magas szinten expresszálódnak a legtöbb szövetben és sejtekben. Pepszinogén C (progastricsin) egy aszparaginsav-proteáz, amely működik, mint egy emésztő enzim és termelődik a gyomorban. Ez az enzim az egyik fő komponense a gyomornyálkahártya [23]. Az expressziós szintjének AMCase sokkal magasabb volt, mint a GAPDH és β-aktin és összevethető volt az a szint, pepszinogén C. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a gyomor AMCase egyik fő transzkriptum a gyomornyálkahártya és azt sugallják, hogy ez az enzim valószínűleg játszanak fontos fiziológiai szerepeket a gyomorban.

Mi is újra megvizsgálta relatív expresszióját Chit1, AMCase és pepszinogén C 6. ábrán látható használatával háztartási gének által találmány a fentiekben leírt eljárás. Az eredményeket a megalapozó információként ábrán S7 (normalizált által GAPDH) és ábra S8 (normalizált által β-aktin). Nem volt szignifikáns különbség a 6. ábra, ábra S7 és S8 ábra. Katalógusa

Vita katalógusa

Az Chit1 és AMCase úgy gondolják, hogy segítse a gazda elleni védekezés kitin-kórokozókat tartalmazó [3], [ ,,,0],9]. Ezen túlmenően, AMCase egy effektor molekula allergiás gyulladás. Ezek chitinolytic enzimek fontos szerepet játszanak a patofiziológiájában allergiás légúti reakciók egér modellekben az asztma. Viszonylag keveset tudunk, de a in vivo katalógusa kölcsönös expressziós szintje Chit1 és AMCase. A mennyiségi meghatározás mRNS generálhat hasznos és biomedically vonatkozó információkat. Ebben a vizsgálatban, létrehoztunk egy kvantitatív valós idejű PCR-rendszer meghatározására alkalmas mRNS szintek két emlős kitinázok és összehasonlításának ezeket a szinteket azokkal a referencia gének ig terjedő skála segítségével. Eredményeink azt mutatják, hogy AMCase van túlnyomórészt az egér gyomorban.

kvantitatív valós idejű RT-PCR egy fontos előrelépést számszerűsítése mRNS, és lehetővé teszi a kimutatását a kifejezés egy adott gén érdekes molekuláris szinten . Sok jelentések kimutatására rendkívül alacsony mRNS segítségével ezt a technológiát. Azonban, a valós idejű RT-PCR nem egy széles körben használt, mert még mindig vannak korlátai számszerűsítése többszörös mRNS ig terjedő skála segítségével. Építettünk egy szabványos sablon tartalmazó DNS öt cDNS fragmentumokat (mindegyik körülbelül 200 bázispár hosszúságú). Ezeket a fragmentumokat tartalmazza fragmensek két kitinázok, egy marker és két háztartási gének és egyesítjük egy-egy arányok (3A ábra). GAPDH és β-aktin, a leggyakrabban használt háztartási gének, vontunk belső kontrollként és hivatkozásait PCR-amplifikáció. Ezen kívül, mi használt pepszinogén C, mint egy marker gént, mivel ez a termék magas szinten a gyomorban [23]. Ez a módszer lehetővé tette az abszolút mennyiségi meghatározására számos Chit1 és AMCase mRNS-molekulák, valamint a számú referencia mRNS-molekulák, egy 10 ng teljes RNS-t (mol /10 ng) (5. ábra és 6. ábra). Továbbá tudtuk vizsgálni relatív számszerűsítését Chit1 és AMCase mRNS szintek két háztartási gének, GAPDH és β-aktin (Támogató Információs ábra S3 és S4). Katalógusa

A relatív mennyiségi meghatározása könnyebb elvégezni, mint abszolút mennyiségi, mert egy kalibrációs görbe nem szükséges. A relatív mennyiségi, mRNS-szinten a gént összehasonlítjuk eltérnek a háztartási gének [21]. Azonban ez a mennyiségi meghatározási módszer nem összehasonlítani a szinteket a különböző gén-transzkriptumok ugyanazon a skálán. Bár a módszer megköveteli, több lépésben kapcsolódó építési a szabványos DNS-t és az érvényesítési folyamatok, ez a módszer nyújthat génexpressziós adatok, amelyek közvetlenül összehasonlíthatók a gének közötti (5. ábra és 6. ábra). A real-time PCR biztosított széles dinamikus tartományban a mennyiségi és magas érzékenység, és a mennyiségi meghatározás alacsony bőség átiratok lehetővé tette számunkra, hogy érvényesítse az érzékenysége és megbízhatósága módszer (4. ábra). Ez a technika nagyon jól illeszkedik a számszerűsítése és összehasonlítása mRNS szintek több gén ig terjedő skála segítségével. A találmány szerinti eljárás alkalmazható az orvosbiológiai mérnöki, valamint a klinikai és gyakorlati célokra. Katalógusa

A jelenlegi vizsgálat során azt találtuk, hogy AMCase mRNS szintetizálódik a rendkívül magas az egér gyomor viszonyított szintje háztartási gének (5. ábra és 6. ábra). A szint AMCase mRNS összehasonlítható a pepszinogén C (progastricsin) mRNS egyik fő komponense a gyomornyálkahártya a gyomorban (6B). Amellett, hogy a gyomor, az állkapocs alatti mirigyek is találtak, hogy kifejezze a nagy mennyiségű AMCase (5. ábra). Ami a szintetizáló emlős kitináz mRNS, mind a gyomor-és állkapocs alatti mirigyek tekintik figyelemre méltó szövetek előállítására hatalmas mennyiségű AMCase egér.

Sósav kiválasztódik a gyomorban, ami savas körülmények között a fehérjék emésztését pepszinnel körülbelül pH = 2 [23], [24]. Egér AMCase mutatja mély savstabilitás és legaktívabb pH = 2,0, ami megkülönbözteti a többi egér enzimek [8]. A szokatlan pH-stabilitás és a függőség, az egér AMCase savas körülmények lehetővé teszik a hatékony emésztését chitinous anyagok savas körülmények között. Az a megfigyelés, hogy a AMCase túlnyomórészt kifejezve a gyomorban hivatkozik a lehetséges funkciója az élelmiszer-feldolgozás. Vad egerek eszik kitin-tartalmú élelmiszerek, mint például a rovarok, mivel az egerek tartják a laboratóriumban enni mesterséges tartalmazó étrend szárított sörélesztő, amely szintén tartalmaz kitin a sejtfalban. Így AMCase működhet, mint egy emésztő enzim, amely lebontja a polimer kitin a gyomortartalom. Katalógusa

A legmagasabb szintű Chit1 is kifejezve az egér gyomorban. Azonban a Chit1 expressziós szintje a gyomorban volt 1/721 hogy a AMCase expressziós szintet és alacsonyabb volt, mint az expressziós szintek két háztartási gének, GAPDH és β-aktin (6a ábra). Ezen túlmenően, Chit1 nem rendelkezik semmilyen chitinolytic tevékenység a pH gyomornedvek, ami mintegy pH = 2 [5], [11]. Kimutatták, hogy a Chit1 keletkezik helyszínek közel semleges pH, mint például a nem mirigyes részének a gyomorban és a vékonybélben [25]. Így Chit1 nem járul hozzá a kitináz aktivitás az egér gyomorban.

Bár AMCase expresszálódik túlnyomórészt a gyomorban és állkapocs alatti mirigyek, az összes többi vizsgált szövetben ebben a vizsgálatban kifejezett alacsony, de kimutatható, szintjeit Chit1 és AMCase . Az expressziós szintek Chit1 és AMCase alacsonyabbak voltak, mint a háztartási gének ezekben a szövetekben. Chit1 ábra egy széles pH-optimum körülbelül pH = 5 [5], mivel az elsődleges optimális pH-AMCase pH 2, és a másodlagos pH-optimum pH = 4-7, és AMCase megtartása kevesebb, mint 30% -át aktivitása pH 2 Ebben a pH tartományban [8]. Mindkét Chit1 és AMCase megemészteni természetes kitin és kitozán keresztül endo-kitináz aktivitás és termelnek chitobiose [8], [26]. Bár AMCase domináns a Chit1 sok egér szövetben, ott nem lehet szignifikáns különbséget a chitinolytic aktivitást egér szövetben. Katalógusa

További AMCase mRNS mint Chit1 mRNS figyelhető meg a legtöbb egér szövetben, kivéve a szemét. Eredményeink azt sugallják, hogy a génexpressziót a Chit1 lehet egyedfejlődésileg szabályozott, ami arra utal, hogy ez szerepet játszik a egyedfejlődés. Vizsgálva a szabályozása a kifejezés az emlős kitinázok adhatna betekintést fiziológiai szerepének ezen enzimek. Egy részletes jellemzése a promoter régiók Chit1 és AMCase gének, valamint a azonosítása cisz
- és transz
-SZABÁLYOZÓ tényezőket lesz szükség, hogy megértsék a szelektív expresszióját ezen enzimek.

Bár az emlősök nem termelnek kitin vagy kitin szintáz, azokat folyamatosan ki vannak téve ennek a polimert kitettség kitin tartalmú paraziták és a kórokozók. A szubsztrát emlős kitinázok feltehetően környezeti kitin, mint amely megtalálható gombák vagy parazita fonalférgek. A tüdőben, a mindkét enzim működhet része a gazda ellen irányuló védekezési mechanizmusa kitin-kórokozókat tartalmazó, mint például a környezeti penész és az atkák, hogy indukálják a légúti allergia.

• PLoS One: Elemzés a gyomrot és a beleket Microbiomes a keleti Oyster (Crassostrea virginica) a part menti Louisiana, USA
• PLoS One: fibroblaszt növekedési faktor 10-fibroblaszt növekedési faktor receptor 2b közvetített jelátviteli nem szükséges a felnőtt mirigyes gyomor Homeostasis