PLoS ONE: Хитиназная мРНК уровни с помощью количественной ПЦР с использованием стандартной ДНК Single: Кислотные млекопитающим Хитиназная является основным транскрипцию в Mouse Stomach

Абстрактный
<р> хитиназы гидролизовать β-1-4 гликозидные связи хитина, основным структурным компонентом грибов, ракообразных и насекомых. Хотя млекопитающие не производят хитина или его синтазу, они выражают два активных хитиназы хитотриозидазы (Chit1) и кислой хитиназы млекопитающих (AMCase). Эти хитиназы млекопитающих привлекли значительное внимание из-за их повышенной экспрессии у лиц с рядом патологических состояний, включая болезнь Гоше, болезнь Альцгеймера и астмы. Тем не менее, вклад этих ферментов в патофизиологии этих заболеваний еще предстоит определить. Количественное уровней Chit1 и мРНК AMCase и сравнение этих уровней с уровнями известных эталонных генов может генерировать полезную и биомедицины соответствующую информацию. В начале, мы установили количественное в режиме реального времени система PCR, которая использует стандартную ДНК, полученную путем лигирования фрагментов кДНК генов-мишеней. Эта система позволила нам количественно оценить и сравнить уровни экспрессии хитиназы и эталонных генов в том же масштабе. Мы обнаружили, что мРНК AMCase синтезируется при чрезвычайно высоких уровнях в желудке мыши. Уровень мРНК этого в желудке мыши был от 7 до 10 раз выше, чем уровни генов домашнего хозяйства и была сравнима с, что уровень мРНК для пепсиногена C (progastricsin), одним из основных компонентов слизистой оболочки желудка. Таким образом, AMCase мРНК является одним из основных транскрипт в желудке мыши, предполагая, что функции AMCase как пищеварительный фермент, который расщепляет полимерный хитин и как часть защиты хозяина против хитин-содержащих патогенов в желудочном содержимом. Наша методология применима к количественной оценке мРНК для нескольких генов на нескольких образцах, используя один и тот же масштаб

Citation:. Ohno M, Цуда K, Сакагучи M, Sugahara Y, Ояма F (2012) Хитиназная мРНК Уровни количественными ПЦР с использованием стандартной ДНК Single: Кислотные млекопитающим Хитиназная является основной транскрипт в желудке мышей. PLoS One 7 (11): e50381. DOI: 10.1371 /journal.pone.0050381
<р> Редактор: Dominik Хартл, Университет Тюбингена, Германия
<р> Поступило: 6 августа 2012 года; Принято: 19 октября 2012 года; Опубликовано: 21 ноября, 2012
<р> Copyright: © 2012 Ohno и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке исследовательского гранта проекта из научно-исследовательского института науки и техники, Kogakuin университета. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> хитин, линейный полимер бета-1-4-сшитый N
ацетил--D-глюкозамина, является вторым наиболее распространенным полисахарид в природе. Он функционирует в качестве основного структурного компонента грибов, ракообразных и насекомых, но не обнаружен у млекопитающих [1]. Хитиназы гидролизовать β-1-4 гликозидные связи хитина полимера. Хотя млекопитающие не производят хитина или его синтазу, они выражают два активных хитиназы хитотриозидазы (Chit1) и кислой хитиназы млекопитающих (AMCase) [2], [3].
<Р> Уровень Chit1 заметно повышается в плазме пациентов с болезнью Гоше, аутосомно-рецессивный расстройство хранения лизосомальная [4]. Chit1 был первым хитиназы млекопитающим который должен быть очищен и клонирован [5], [6]. Рецессивно унаследовал дефицит активности Chit1 обычно наблюдается у кавказцев [7]. AMCase был обнаружен из-за его роли компенсационного и был назван в его кислой оптимум рН [8]. Эти хитиназы млекопитающих рассматриваются как часть механизма защиты хозяина против хитин-содержащих патогенов и паразитов [3], [9].
<Р> Оба Chit1 и AMCase секретируемые белки с молекулярной массой около 50 кДа. Оба белка содержат N-концевой каталитический домен, шарнирный участок и С-терминальный хитин-связывающего домена [6], [8]. Мышь AMCase показывает последовательность, гомологичную Chit1, с идентичностью 52% и схожесть 60% [10]. Несмотря на эти структурные сходства, эти ферменты существенно различаются по отношению к их ферментативной поведению при кислом рН. AMCase показывает заметное оптимум рН при рН 2 и менее очевидной оптимум при рН 4-7 [8], в то время как Chit1 показывает только широкий оптимум рН при рН около 5 [5], [11].
<Р> млекопитающим хитиназы привлекли значительное внимание из-за их повышенной экспрессии у лиц с различными патологическими состояниями. Chit1 увеличивается у пациентов с болезнью Гоше [4], хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) [12], и болезнь Альцгеймера [13] и у курильщиков [14]. AMCase выражение и активность также повышалась во время аллергических реакций в дыхательных путях в мышиных моделях астмы [15]. Кроме того, полимерные хитин индуцирует экспрессию AMCase и набор иммунных клеток, связанных с аллергией и астмой [16]. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что хитинолитических ферменты играют важную роль во многих патофизиологических условиях. Тем не менее, вклад этих ферментов в патофизиологии этих заболеваний еще предстоит определить.
<Р> Количественное уровней Chit1 и мРНК AMCase и сравнение этих уровней с уровнями известных эталонных генов являются важными шаги в получении представление о в естественных условиях
регуляции хитиназы млекопитающих. В последнее время, в режиме реального времени RT-PCR использовалась для количественного определения уровней мРНК во многих исследованиях по экспрессии генов [17] - [20], так как этот метод является достаточно чувствительным, чтобы обнаружить мРНК из даже одной клетки. ПЦР в реальном времени, обычно включает в себя нормализацию уровней экспрессии представляющего интерес гена с теми из генов домашнего хозяйства, которые, как считается, последовательно выражены во всех образцах. Однако этот метод количественного определения не может сравнивать уровни различных транскриптов генов в том же масштабе.
<Р> В настоящем исследовании мы разработали количественное в режиме реального времени система RT-PCR, которая использует стандартную ДНК, полученную путем лигирования фрагменты кДНК генов-мишеней. Эта система позволила нам количественно оценить и сравнить уровни экспрессии хитиназы и эталонных генов в том же масштабе. Наши результаты указывают на то, что AMCase является одним из основных транскрипта в желудке мыши, предполагая, что соответствующие функции белка как пищеварительный фермент, который разрушает хитин-содержащих продуктов и как часть принимающей защиты против хитин-содержащих патогенные организмы, в желудочном содержимом.

материалы и методы

РНК, Выделение РНК и кДНК Получение
<р> Мышь Total RNA Master Panel (Clontech Laboratories) использовали для изучения тканевое распределение транскриптов. Мы проанализировали четыре различные эмбриональные этапы и восемь взрослых тканей. Кроме того, РНК выделяли из легких и желудков 3-месячных мышей-самцов. C57BL /6J (CLEAR Япония) были выведены в RIKEN Brain Science Institute вивария. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с ведомственным руководящим принципам. Протокол был одобрен Комитетом по этике экспериментов на животных в RIKEN Brain Science Institute (утверждение № H19-2B013) путем. Все операции проводили с использованием диэтилового эфира в качестве анестезирующего средства, и все усилия были сделаны, чтобы свести к минимуму страдания. Эти ткани для получения мРНК были представлены Drs. Миядзаки и Nukina в RIKEN Brain Science Institute. Общую РНК получали из легких и желудков с использованием TRIzol реагента (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Для удаления следовых количеств загрязняя геномную ДНК, общие образцы РНК обрабатывали RQ1 РНКазы ДНКазы (Promega) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Концентрации нуклеиновых кислот определяли путем измерения оптической плотности при 260 нм с использованием Биофотометре Plus (Eppendorf). Каждый из общего количества образцов РНК (3 мкг) подвергали обратной транскрипции со случайными гексамерах в качестве праймеров. Реакционную смесь (15 мкл) содержала буфер фермента [50 мМ Трис-HCl (рН 8,3), 75 мМ КСl, и 3 мМ MgCl <суб> 2], 100 нг случайных гексамеров, 10 мМ дитиотреитола и 0,5 мМ дезоксинуклеотид трифосфатов (дНТФ). После нагревания раствора до 60 ° С в течение 5 мин и выдерживание смеси при температуре 37 ° С в течение 5 мин, 200 ед рекомбинантного вируса мышиного лейкоза обратной транскриптазы (Invitrogen) добавляли, и смесь инкубировали при 37 ° С в течение 45 мин , Обратной транскрипции была прекращена путем нагревания до 95 ° С в течение 5 мин.

ПЦР в реальном времени
<р> Грунтовки в режиме реального времени RT-PCR были разработаны на основе Primer Express, программное обеспечение (Applied Biosystems) и были синтезированы на коммерческой основе (Sigma-Genosys, Sigma-Aldrich). Реакции ПЦР проводили в конечном объеме 13 мкл, содержащем 2 × SYBR Green Master Mix (Brilliant II SYBR Green КПЦР Master Mix, компания Agilent Technologies), 2,7 нг кДНК мыши или соответствующих разведений внешних стандартов (смотри ниже), и соответствующие концентрации праймеров для хитиназы пепсиногена C, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) или бета-актина. Использовались стандартные в режиме реального времени условия ПЦР для системы (Mx3005P, компания Agilent): начальная денатурация и полимеразной стадии активации в течение 10 мин при 95 ° С, а затем 40 циклов денатурации при 95 ° С в течение 1 мин, 55 ° С в течение 30 сек и 72 ° С в течение 1 мин. Кривые плавления были получены после амплификации. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу на геле 10% -ном полиакриламидном и анализировали с использованием люминесцентного изображени анализатора (ImageQuant ЛАС 4000, GE Healthcare). Раствор ПЦР обрабатывали ExoSAP-IT (USB Products) в соответствии с инструкциями изготовителя по устранению некорпоративные праймеров и дНТФ, и продукты секвенировали с использованием v3.1 Cycle Sequencing Kit ABI PRISM Big-Dye Terminator и генетический анализатор 3130 ( Applied Biosystems). Нуклеотидные последовательности праймеров, выбранных для ПЦР в реальном времени показаны в таблице S1.

Строительство стандартной ДНК

стандартной кДНК шаблона (913 оснований) для количественной оценки уровней транскриптов с помощью ПЦР в реальном времени была построена следующим образом. Фрагменты кДНК, охватывающие ПЦР-область-мишень плюс 9-120 основы фланговых областей AMCase, Chit1, пепсиногена С, GAPDH, и бета-актина амплифицировали из кДНК желудка мыши с помощью ПЦР с использованием KOD Плюс ДНК-полимеразы (Тоёбо) и олигонуклеотиды праймер, содержащий сайты рестрикции Bgl
II, Xho
I, Pst
I, или Не
I (в 5'- и 3 ' - заканчивается) в соответствии с протоколом производителя. Прямого и обратного праймеров приведены в таблице S2. Продукты ПЦР очищали с помощью мастера SV геля и PCR очистки системы (Promega), а затем переваривают соответствующими ферментами рестрикции. Фрагменты ДНК очищали с использованием электрофореза в агарозном геле и очистки системы, а затем лигируют вместе с Т4 ДНК-лигазы (Toyobo). Лигированные фрагменты амплифицировали с использованием прямого праймера 5'-GTGGATTCTGTGCCGACAAAGCAGATGGCC-3 'и обратный праймер 5'-TGGGTACATGGTGGTACCACCAGACAGCAC-3' с KOD Плюс ДНК-полимеразы. 3'-дА был добавлен в амплифицированной ДНК с использованием Takara Taq HS (Takara Bio), и продукт очищали с помощью гель-электрофореза, как описано выше. Полученную ДНК клонировали в pGEM-T Easy вектор (Promega) путем клонирования ТА, в соответствии с инструкциями изготовителя. Нуклеотидную последовательность полученной плазмиды была подтверждена секвенированием. Фрагмент ДНК, линеаризованный MultiGene-содержащий получали путем повторной амплификации из плазмидной ДНК с помощью тех же самых праймеров методом ПЦР с использованием KOD-полимеразы плюс ДНК. Фрагменты были очищены и количественно, как описано выше, и использовали в качестве стандартной ДНК.

Получение пяти кДНК, охватывающих всю область кодирования

Для того, чтобы проверить нашу абсолютную реальном времени методом ПЦР, мы подготовили полный кодирование кДНК методом ПЦР с использованием наборы праймеров, перечисленных в таблице S3. Пять кДНК, охватывающих весь кодирующие области двух хитиназы (Chit1 и AMCase) и опорным генов (GAPDH, b-актин и пепсиногена С), амплифицировали с помощью ПЦР из кДНК желудка мышей с использованием KOD Плюс ДНК-полимеразы и субклонируют в pGEM-T Легкий вектор путем клонирования ТА, как описано выше. Последовательности кДНК, были проверены с помощью секвенирования, как описано на рисунке S1. Субклонированный фрагменты повторно амплифицируют из плазмиды ДНК с теми же праймерами, а затем использовали в качестве всей кодирующей области кДНК.

Стандартные кривые
<р> Молярная концентрация стандартной ДНК в мультигенного содержащих рассчитывалась на основании концентрации и молекулярной массы. Серийные разведения были получены, начиная со стандартной концентрации матрицы, которая давала Ct приблизительно 13 (Ct = дробное значение порогового цикла). Стандартная ДНК подвергали 10-кратных серийных разведений, начиная от 10 0 до 10 7 молекул, и аликвоты хранились в замороженном состоянии при -20 ° С до использования.

Количественный анализ мРНК с помощью ПЦР в реальном времени с использованием стандартных кривых или им ΔΔ Ct Метод
<р> каждый образец был усилен в трех экземплярах, и каждый эксперимент повторяли по меньшей мере, в два раза. С помощью стандартной кривой, число Chit1, AMCase, GAPDH, b-актин, и пепсиногена молекул С мРНК были экстраполированы автоматически с помощью версии MxPro QPCR Software 4.10 (Agilent). Все значения были выражены в виде молекул в 10 нг общей РНК. В некоторых случаях значения были нормализованы против уровней GAPDH или бета-актина мРНК.
<Р> Для оценки нашей нынешней методологии, мы также использовали метод ΔΔ Ct [21], которая требует измерения порогового цикла (Ct) генов-мишеней. Значения Ct были рассчитаны с помощью MxPro QPCR программного обеспечения с использованием GAPDH или бета-актина в качестве нормализатора.

Результаты

Создание ПЦР в реальном времени Анализ
<р> о создании надежный способ для измерения экспрессии хитиназе транскриптов является важным шагом в исследовании значение хитиназы мыши. В режиме реального времени RT-ПЦР, в настоящее время, наиболее чувствительный количественный метод для обнаружения как с низким уровнем численности и обильными мРНК транскриптов. первый Мы сравнили уровни экспрессии генов генов Chit1 и AMCase (см рисунок 1). Для того, чтобы оценить уровни хитиназы, мы использовали два гена домашнего хозяйства, GAPDH и бета-актина, в качестве эталонных генов, поскольку они конститутивно экспрессируется на высоких уровнях в большинстве тканей и клеток [22]. Кроме того, мы выбрали пепсиногена C (также известный как progastricsin) в качестве эталонного гена в желудке. Пепсиноген С является аспарагиновой протеазы, который функционирует как пищеварительный фермент и вырабатывается в желудке. Этот фермент является одним из основных компонентов слизистой оболочки желудка [23]. С помощью этих трех опорных генов, мы оценивали экспрессию генов Chit1 и AMCase в тканях мыши (рисунок 1).
<Р> Сначала мы разработали несколько наборов праймеров для количественной ПЦР и оценивали их пригодность на основе дали ли они одиночные продукты , как это отражено единственной температурой плавления (Tm) и одной полосы на полиакриламидном геле 10%. Нуклеотидные последовательности продуктов были также проверены. Для изучения специфичности праймеров, каждый из продуктов ПЦР амплифицировали при реальном времени условий ПЦР с использованием кДНК, смесь мыши ткань, состоящая из тканей из четырех эмбриональной стадии и восемь взрослых тканей и анализировали в сочетании с различными методами. Как показано на рисунке 2А-E, только один пик появился в кривых диссоциации для Chit1 (Tm = 79,7 ° C), AMCase (Tm = 79,1 ° C), GAPDH (Tm = 81,4 ° C), β-актина (Tm = 82,0 ° С) и пепсиногена С (Tm = 81,4 ° C). В конце ПЦР, мы проанализировали продукты на полиакриламидном геле 10%. Гель-электрофорез показал четкие одиночные полосы при ожидаемых размеров Chit1 (69 б.п.), AMCase (81 б.п.), GAPDH (77 б.п.), β-актина (71 б.п.) и пепсиногена C (82 б.п.) (рис 2F). Нуклеотидные последовательности продуктов ПЦР определяли непосредственно, как описано в разделе Материалы и методы. Мы подтвердили, что ПЦР-продукты были амплифицированы из целевых кДНК (см Фигура 3В). Эти результаты указывают на то, что продукты ПЦР являются специфическими ампликонов из целевых кДНК и ошибочного праймирования пренебрежимо мало в наших экспериментальных условиях.

Строительство ДНК стандартного шаблона для количественной оценки и сравнения экспрессии гена Среди пяти генов
<р> Мы стремились сравнить уровни экспрессии двух хитиназы и трех контрольных генов в том же масштабе (рисунок 1). Для этой цели мы создали количественную в реальном масштабе времени система PCR для которой стандартный шаблон был необходим для точной количественной оценки (рис 3A). Мы построили стандартную матричной ДНК для ПЦР в реальном времени путем лигирования пять целевых фрагментов в соотношении один к одному, а затем этот лигировали фрагмент ДНК клонировали в плазмидный вектор, как описано в Материалы и методы секции (рис 3А) , 913 нуклеотидов длиной матричной ДНК содержала пять фрагментов кДНК, охватывающих ПЦР-область-мишень плюс 9-120 основы фланговых областей и содержали сайты рестрикции Bgl
II, Xho I
, Pst
I и Не
I (подробности см на фигуре 3В).

Проверка стандартной кривой и количественный ПЦР в реальном времени системы
<р> количественное обоих хитиназы и ссылочных мРНК зависит от стандартных кривых. Серийные разведения стандартной матричной ДНК были использованы для построения стандартной кривой для сравнения и оценки в режиме реального времени стратегии RT-PCR количественной оценки, которые были использованы для анализа пяти мРНК. Каждая стандартная кривая была сгенерирована с использованием 10-кратных серийных разведений стандартной ДНК и пяти различных пар праймеров (рис 4A-E, слева). Экспоненциальное усиление поддерживалась в широком диапазоне циклов, что дает динамический диапазон семь порядков (рис 4A-E, слева). При использовании стандартной матричной ДНК, содержащий пять фрагментов кДНК, равные количества могут быть назначены для всех пяти генов в каждом разведении построить стандартные кривые (рис 4A-E, справа).
<Р> Чтобы проверить абсолютное равенство кривых, известной концентрации полной кДНК, кодирующей усиливался и затем анализировали в качестве неизвестного образца. Этот анализ проводили с целью проверки того, что в каждой из испытуемых разбавление привела к ожидаемому количеству. Как показано на рисунке 4A-E, справа, наблюдались равные количества для каждой тестируемой разбавления для построения калибровочной кривой (рис S2). Количественное низкого обилия транскриптов и обильными транскриптов позволяет проверить чувствительность и надежность ПЦР в реальном времени, что свидетельствует о том, что наша в режиме реального времени методом ПЦР предлагает большой динамический диапазон количественной оценки, высокая точность и высокая чувствительность (рис 4A- E, справа). Таким образом, наше в реальном времени методом ПЦР обеспечивает надежные значения для двух генов хитиназы и эталонных генов на той же шкале.

Выражение Chit1 и AMCase в Mouse Тканей
<р> Для изучения в естественных условиях
регуляции экспрессии генов Chit1 и AMCase, общие образцы РНК, выделенной из четырех эмбриональной стадии и из различных тканей взрослого, были проанализированы с помощью количественной ПЦР в реальном времени анализа с использованием единого стандарта ДНК (рисунок 3). Результаты выражали в виде молекул в 10 нг общей РНК (фиг.5 и 6). Оба Chit1 и AMCase мРНК широко экспрессируется в тканях мышей (рис 5А и 5В). Четкие особенности ткани наблюдались в паттернов экспрессии обоих хитиназе мРНК. Высокие уровни мРНК Chit1 были обнаружены в желудке мыши (рис 5A, верхняя панель), а затем глаз и легких. мРНК Chit1 был обнаружен при низких, но легко обнаружить, уровни в других тканях (рис 5А, нижняя панель). AMCase мРНК преимущественно обнаруживается в желудке, а затем подчелюстной железы (Фиг.5В, верхняя панель), но также и в других тканях (Фиг.5В, нижняя панель).
<Р> Затем мы сравнили соотношение AMCase к Chit1. Число копий каждой мРНК определяли с использованием тех же стандартных разведений. Мы обнаружили, что желудок и подчелюстной преимущественно экспрессируется AMCase мРНК (рис 5C, верхняя панель). Другие исследованных тканей в этом исследовании произвел больше, чем AMCase Chit1, и Chit1 была распространена только в глазах (5С, нижняя панель).
<Р> Затем мы осматривали относительную квантификации в исходных данных, представленных на рисунке 5, которая была выражена в виде молекул в 10 нг тотальной РНК, с использованием генов домашнего хозяйства, как описано в разделе Материалы и методы. Результаты представлены качестве подтверждающей информации, на рисунке S3 (данные нормализовали по GAPDH) и рис S4 (нормированная бета-актина). Затем мы проанализировали данные, как показано на рисунке 5 методом ΔΔ Ct [21] и показаны в качестве дополнительной информации на рисунке S5 (нормированная GAPDH) и рис (S6, нормированная бета-актина). При сравнении относительной экспрессии, обнаруженную настоящих абсолютных и относительных методов количественной оценки, не было никаких существенных различий среди данных, за исключением для экспрессии Chit1 мРНК, которая была наиболее обильно выраженные в глазах, когда нормализуется бета-актина (рис 5, рис S3 и фиг S4). Аналогичные результаты были получены также при относительной количественной оценки с использованием метода ΔΔ Ct [21] (см Рисунок 5, Рисунок S5 и S6 Рисунок). Тем не менее, мы не могли непосредственно оценить взаимные уровни экспрессии Chit1 и AMCase при анализе методом ΔΔ Ct.

Анализ Chit1, AMCase, пепсиногена С, GAPDH, и бета-актина в легких и желудка ТКАНЕЙ <бр>

Многие исследования были проведены на патофизиологии хитиназы млекопитающих в тканях легких. В этом исследовании мы показали, что AMCase мРНК преимущественно экспрессируется в тканях желудка мыши (рисунок 5). Мы также сравнили уровни экспрессии хитиназы и эталонных генов с использованием кДНК, полученные из легких и желудка ткани 3-месячных мышей (п = 5). Количественные данные представлены на рисунке 6. Когда уровни Chit1 были установлены на уровне 1,0, относительные уровни экспрессии кДНК были AMCase, 14; GAPDH, 196; и β-актина, 681 в ткани мыши легкого (6А). Этот результат указывает на то, что ткани легкого выразить больше, чем AMCase Chit1, хотя уровень экспрессии AMCase был ниже, чем у двух генов домашнего хозяйства.
<Р> В тканях желудка, когда уровень Chit1 был установлен на уровне 1,0, относительные уровни экспрессии были AMCase, 721; пепсиногена C, 2261; GAPDH, 61; и β-актина, 127 (фиг.6В). Оба GAPDH, и бета-актина гены хорошо известны генов домашнего хозяйства и экспрессирован на высоком уровне в большинстве тканей и клеток. Пепсиноген С (progastricsin) является аспарагиновой протеазы, который функционирует как пищеварительный фермент и вырабатывается в желудке. Этот фермент является одним из основных компонентов слизистой оболочки желудка [23]. Уровень экспрессии AMCase был значительно выше, чем у GAPDH и бета-актина и был сопоставим с уровнем пепсиногена C. Эти результаты указывают на то, что желудок AMCase является одним из основных транскрипта в слизистой оболочке желудка и позволяют предположить, что этот фермент может играть важную физиологические роли в желудке.
<р> Мы также повторно исследовали относительную экспрессию Chit1, AMCase и пепсиногена с, как показано на рисунке 6, с использованием генов домашнего хозяйства по данному способу, как описано выше. Результаты были показаны как вспомогательная информация на рисунке S7 (нормированная GAPDH) и рис (S8, нормированная бета-актина). Там не было никаких существенных различий между Рисунок 6, Рисунок S7 и S8 Рис.

Обсуждение
<р> Оба Chit1 и AMCase, как полагают, чтобы помочь в защите хозяина против хитин-содержащих патогенов [3], [ ,,,0],9]. Кроме того, AMCase является эффекторной молекулой при аллергическом воспалении. Эти хитинолитических ферменты играют важную роль в патофизиологии аллергических реакций в дыхательных путях в мышиных моделях астмы. Относительно мало известно, однако, о в естественных условиях
уровней взаимной экспрессии Chit1 и AMCase. Количественное мРНК может генерировать полезную и биомедицины соответствующую информацию. В данном исследовании мы установили количественное в режиме реального времени система PCR способна определять уровни мРНК двух хитиназы млекопитающих и сравнения этих уровней с теми эталонных генов с использованием той же шкалы. Наши результаты указывают на то, что AMCase преимущественно экспрессируется в желудке мыши.
<Р> Количественный в реальном времени ОТ-ПЦР представляет собой важный шаг вперед в количественной оценке мРНК и позволяет детектировать экспрессию конкретного интересующего гена на молекулярном уровне , Есть много сообщений о выявлении крайне низких уровней мРНК с использованием этой технологии. Тем не менее, в режиме реального времени ОТ-ПЦР не является широко используется, так как он все еще имеет ограничения в количественной оценке нескольких мРНК, используя один и тот же масштаб. Мы построили стандартный шаблон ДНК, состоящий из пяти фрагментов кДНК (каждый ~ 200 баз в длину). Эти фрагменты включены фрагменты двух хитиназы, один маркер и два генов домашнего хозяйства и были объединены в один-к-одному соотношений (рис 3А). GAPDH и β-актина, наиболее часто используемые гены домашнего хозяйства, были включены в качестве внутреннего контроля и ссылки для ПЦР-амплификации. Кроме того, мы использовали пепсиногена С в качестве гена-маркера, так как он производится на высоком уровне в желудке [23]. Этот метод позволил абсолютный количественный анализ числа Chit1 и мРНК AMCase молекул, а также число молекул мРНК ссылка, за 10 нг общей РНК (моль /10 нг) (фиг.5 и 6). Кроме того, мы могли бы рассмотреть относительную количественную оценку уровней Chit1 и AMCase мРНК с использованием двух генов домашнего хозяйства, GAPDH и β-актина (подтверждающей информации, рис S3 и S4 Рисунок).
<Р> Относительная Количественное легче выполнить, чем абсолютной количественной оценки, так как калибровочная кривая не является необходимым. В относительном количественному, уровни мРНК представляющего интерес гена, сравниваются с теми из домашнего хозяйства генов [21]. Тем не менее, этот метод не может Количественное сравнение уровней различных транскриптов генов в том же масштабе. Хотя наш метод требует несколько шагов, связанных со строительством стандартной ДНК и с процессами валидации, этот метод может предоставить данные экспрессии генов, которые непосредственно сопоставимы между генами (рисунок 5 и рисунок 6). Наш ПЦР в реальном времени при условии, большой динамический диапазон количественной оценки и высокой чувствительностью, а также количественное определение низкого обилия транскриптов позволило нам проверить чувствительность и надежность нашего метода (Рисунок 4). Этот метод очень хорошо подходит для количественного определения и сравнения уровней мРНК на нескольких генов, используя один и тот же масштаб. Наш нынешний метод применим к биомедицинской инженерии, а также клинических и практических применений.
<Р> В настоящем исследовании мы обнаружили, что мРНК AMCase синтезируется на чрезвычайно высоких уровнях в желудке мыши относительно уровней генов домашнего хозяйства (Рисунок 5 и Рисунок 6). Уровень мРНК AMCase сравнима с пепсиногена C (progastricsin) мРНК, одним из основных компонентов слизистой оболочки желудка в желудке (рис 6В). В дополнение к животу, также были обнаружены подчелюстной железы, чтобы выразить большое количество AMCase (рисунок 5). Что же касается синтеза млекопитающих хитиназе мРНК, как желудок и подчелюстные железы считаются примечательных тканей для производства огромного количества AMCase в мыши.
<Р> Соляная кислота выделяется в желудке, создавая кислые условия для переваривания белков пепсином при приблизительно рН 2 [23], [24]. Мышь AMCase показывает стабильность и глубокую кислоты наиболее активен при рН 2,0, что выгодно отличает его от других ферментов мыши [8]. Необычная стабильность рН и зависимость AMCase мыши на кислых условиях позволяют эффективно переваривание хитиновых материалов в кислых условиях. Наблюдение, что AMCase преимущественно экспрессируется в точках желудка к его возможной функции в пищевой промышленности. Дикие мышей едят хитин-содержащие продукты, такие как насекомые, в то время как у мышей держали в лабораторных условиях едят искусственных диет, содержащих дрожжи Сушеные пивоваров, который также содержит хитин в клеточной стенке. Таким образом, AMCase может функционировать как пищеварительный фермент, который расщепляет полимерный хитина в желудочном содержимом.
<Р> Было также выражено высокий уровень Chit1 в желудке мыши. Тем не менее, уровень экспрессии Chit1 в желудке было 1/721, что уровня экспрессии AMCase и был ниже, чем уровни экспрессии двух генов домашнего хозяйства, GAPDH и β-актина (6А). Кроме того, Chit1 не обладает никакой хитинолитических активностью при рН желудочного сока, что составляет около рН 2 [5], [11]. Было показано, что Chit1 производится на участках вблизи нейтрального рН, таких как не-железистой части желудка и тонкой кишки [25]. Таким образом, Chit1 не способствует хитиназной активности в желудке мыши.
<Р> Хотя AMCase выражается преимущественно в желудке и подчелюстных желез, все другие ткани, рассмотренные в данном исследовании выражены низкие, но поддающиеся обнаружению, уровни Chit1 и AMCase , Уровни экспрессии Chit1 и AMCase были ниже, чем у генов домашнего хозяйства в этих тканях. Chit1 показывает широкий оптимум рН при рН около 5 [5], в то время как первичный оптимальный рН AMCase является рН 2, а вторичный рН оптимум при рН 4-7, с сохранением AMCase менее чем на 30% своей активности при рН 2 в этот диапазон рН [8]. Оба Chit1 и AMCase переварить естественный хитина и хитозана с помощью эндо-хитиназы активности и производят chitobiose [8], [26]. Хотя AMCase доминирует над Chit1 во многих тканях мыши, что не может быть каких-либо существенных различий в их хитинолитической активности в тканях мыши.
<Р> Более мРНК AMCase чем мРНК Chit1 наблюдалась в большинстве тканей мышей, за исключением глаз. Наши результаты дают возможность предположить, что экспрессия гена Chit1 может быть обусловленных эволюцией, предполагая, что он играет определенную роль в онтогенезе. Изучение регуляции экспрессии хитиназы млекопитающих может дать понимание физиологических ролей этих ферментов. Детальная характеристика промоторов генов Chit1 и AMCase, а также идентификация цис
- и транс
-Актерское факторы будут необходимы для понимания селективную экспрессию этих ферментов <. BR>

Несмотря на то, млекопитающие не производят хитина или хитин-синтазы, они постоянно подвергаются воздействию этого полимера вследствие воздействия хитин-содержащих паразитов и патогенных микроорганизмов. Субстрат для хитиназы млекопитающих предположительно окружающей среды хитин, содержащийся, например, в грибах или паразитическими нематодами. В легких, оба фермента могут выступать в качестве части механизма защиты хозяина против хитином, содержащих патогенные организмы, такие, как охрана окружающей плесени и клещей, которые индуцируют аллергии в дыхательных путях.

• PLoS ONE: Анализ Желудок и Gut Microbiomes Восточного Oyster (Crassostrea virginica) из прибрежных Луизиана, США
• PLoS ONE: фактор роста фибробластов 10-фактор роста фибробластов рецептора 2b опосредованного Signaling не требуется д…