PLoS ONE: Razine chitinase mRNA pomoću kvantitativne PCR korištenjem jednog standardnog DNK: Kiseli sisavaca chitinase je glavni Transkript u miša Stomach

Sažetak pregled

hitinaze hidroliziraju na β-1-4 glikozidnom vezom od hitin, a glavna strukturalna komponenta gljivice, rakova i kukaca. Iako sisavci ne proizvode hitin ili njegov sintetaza, oni izražavaju dva aktivna hitinaza, chitotriosidase (Chit1) i kiseli hitinaze sisavaca (AMCase). Ovi hitinaze sisavaca privukao značajnu pozornost zbog njihove povećane ekspresije u pojedinaca s broja patoloških stanja, uključujući Gaucherovom bolesti, Alzheimerove bolesti i astme. Međutim, doprinos tih enzima u patofiziologiji tih oboljenja i dalje treba utvrditi. Kvantifikacija razinama Chit1 i AMCase mRNA i usporedba tih razina s razinom poznatih referentnih gena može generirati korisne i Biomedicinski relevantne informacije. U početku smo osnovali kvantitativnog real-time PCR sustav koji koristi standardnu ​​DNK proizvedena vezanjem cDNA fragmente ciljnih gena. Ovaj sustav je omogućilo da se kvantificirati i usporedbu razina izraz hitinaze i referentne gene na istoj razini. otkrili smo da AMCase mRNA je sintetiziran na izvanredno visokim razinama u miša želucu. Razina ovog mRNA u mišjem želucu je 7- do 10-puta veće u odnosu na razinama domaćih gena i bila je usporediva s onom razina mRNA za pepsinogen C (progastricsin), glavna komponenta želučane sluznice. Dakle, AMCase mRNA je glavni transkript u mišjim želucu, sugerirajući da AMCase djeluje kao probavni enzim koji razgrađuje polimernog hitin i kao dio obrane domaćina protiv patogena hitina koji sadrže u želučanog sadržaja. Naša metodologija primjenjiva na kvantifikaciju mRNA za više gena u više primjeraka koji koriste istu skalu

Citation. Ohno M, Tsuda K, Sakaguchi M, Sugahara Y, Oyama F (2012) Razine chitinase mRNA kvantitativnom PCR Koristeći jedan standard DNK: Kiseli sisavaca chitinase je glavni Transkript u miša želucu. PLoS One 7 (11): e50381. doi: 10,1371 /journal.pone.0050381 pregled

Urednik: Dominik Hartl, Sveučilište u Tübingenu, Njemačka pregled

Primljeno: 6. kolovoz 2012; Prihvaćeno: 19. listopada 2012; Objavljeno: 21 studeni 2012 pregled

Copyright: © 2012 Ohno et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane projekta potpore za istraživanje iz istraživačkog instituta za znanost i tehnologiju, Kogakuin Sveučilišta. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

hitin, linearni polimer p-1-4-linked N pregled acetil-D-glukozamin, je drugi najobilniji polisaharid nalazi u prirodi. On funkcionira kao glavni strukturna komponenta gljivica, rakova i kukaca, ali se ne nalaze u sisavaca [1]. Hitinaze hidroliziraju na β-1-4 glikozidnom vezom na hitin polimera. Iako sisavci ne proizvode hitin ili njegov sintetaza, oni izražavaju dva aktivna hitinaza, chitotriosidase (Chit1) i kiseli hitinaze sisavaca (AMCase) [2], [3]. Pregled

Razina Chit1 je značajno povišen u plazmi bolesnika s Gaucherovom bolesti, autosomno recesivni poremećaj lizosomskog pohranu [4]. Chit1 je prvi hitinaza sisavaca koji se pročišćava i klonira [5], [6]. Recesivno nasljeđuje nedostatak aktivnosti Chit1 obično promatraju u bijelaca [7]. AMCase je otkrio zbog kompenzacijskog ulogu i bio je imenovan za kisele pH optimuma [8]. Ovi hitinaze sisavaca smatraju dijelom obrambeni mehanizam stanice domaćina protiv patogena i parazita hitina sadržavaju [3], [9]. Pregled

I Chit1 i AMCase izlučuju proteine ​​s molekularnom težinom od približno 50 kDa. Oba proteina sadrži N-terminalnu katalitičku domenu, zglobnu regiju, i hitin-veznu domenu na C-kraju [6], [8]. Miš AMCase pokazuje homologiju sekvence Chit1, s identitetom 52% i sličnost od 60% [10]. Usprkos strukturnih sličnosti, ovi enzimi značajno razlikuju s obzirom na njihove enzimatske ponašanje pri kiselom pH. AMCase pokazuje izrazitu pH optimum pri pH 2 i manje očigledne optimuma pri pH 4-7 [8], dok Chit1 pokazuje samo opći pH optimum na oko pH 5 [5], [11]. Pregled

sisavaca hitinaze privukli su značajnu pažnju zbog njihove povećane ekspresije kod pojedinaca s različitih patoloških stanja. Chit1 je povećana u osoba s bolešću Gaucherovom [4], kronične opstruktivne plućne bolesti (KOPB) [12], te Alzheimerova bolest, [13] i u pušača [14]. AMCase izražavanje i aktivnost također izraženi su tijekom alergijskih reakcija dišnih putova u mišjim modelima astme [15]. Osim toga, polimerni hitin inducira ekspresiju AMCase i zapošljavanje stanica imunološkog sustava povezanih s alergijom i astmom [16]. Ovi rezultati jasno ukazuju da chitinolytic enzimi igraju važnu ulogu u mnogim patofiziološkim uvjetima. Međutim, doprinos tih enzima u patofiziologiji tih oboljenja i dalje treba utvrditi. Pregled

kvantifikacija razine Chit1 i AMCase mRNA i usporedba tih razina s razinom poznatih referentnih gena su važni koraci u dobivanju uvida u in vivo
regulaciji hitinaze sisavaca. Nedavno, u stvarnom vremenu RT-PCR je korišten kvantificirati razinu mRNA u mnogim ekspresije gena studija [17] - [20], jer je ova metoda je dovoljno osjetljiva za otkrivanje mRNA iz čak jedne stanice. Realnom vremenu PCR obično uključuje normalizaciju razine ekspresije gena od interesa onima od domaćih gena za koje se smatra da se dosljedno izražena u svim uzorcima. Međutim, ova metoda kvantifikacije ne usporediti razine različitih prijepisa gena na istoj razini. Pregled

U ovom istraživanju, razvili smo kvantitativnu realnom vremenu RT-PCR sustav koji koristi standardnu ​​DNK proizvedena vezanjem cDNA fragmenti ciljnih gena. Ovaj sustav je omogućilo da se kvantificirati i usporedbu razina izraz hitinaze i referentne gene na istoj razini. Naši rezultati ukazuju da AMCase je glavni transkript u mišjem želucu, što ukazuje da su njihovi odgovarajući protein funkcionira kao probavni enzim koji razgrađuje hrane hitin sadržava i kao dio obrani domaćina protiv patogena hitina sadržava u želucu.

Materijali i metode

RNA, RNA i pripremu cDNA pregled

miš Ukupna RNA Master Panel (Clontech Laboratories) je koristiti za ispitivanje distribucije u tkivu transkripata. Analizirali smo četiri različite embrionalne faze i osam odraslih tkiva. Osim toga, RNA je izolirana iz pluća i želuca od 3 mjeseca stari mužjaci miševa. C57BL /6J (Clear Japan) su uzgojeni u području odlagališta Riken Brain Science Institute životinja. Svi su pokusi na životinjama su provedeni u skladu s institucionalnim smjernicama. Protokol je odobren od strane Odbora za etiku u životinjama iz Riken Brain Science Institute (Odobrenje br H19-2B013). Sve operacije se izvode pomoću dietil-eter kao anestetik, a učinjeni su svi napori kako bi se smanjili patnju. Za ta tkiva za pripremu mRNA pružili su DRS. Miyazaki i Nukina na Riken Brain Science Institute. Ukupna RNA dobivena je iz pluća i želuca pomoću Trizol reagensa (Invitrogen) prema uputama proizvođača. Za uklanjanje tragova kontaminira genomske DNK, ukupna RNA uzorci su tretirani s RQ1 bez Rnase DNaze (Promega) prema preporučenom protokolu proizvođača. Koncentracije nukleinskih kiselina određena je mjerenjem apsorbancije na 260 nm pomoću BioPhotometer Plus (Eppendorf). Svaki od uzoraka ukupne RNA (3 ug) podvrgnut je reverzna transkripcija slučajnih heksamera primerima. Reakcijska smjesa (15 ul) sadržavala pufer enzima [50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, i 3 mM MgCl _{2], 100 ng nasumičnih heksamera, 10 mM ditiotreitol i 0,5 mM deoxynucleotide trifosfati (dNTP). Nakon zagrijavanja otopine na 60 ° C kroz 5 min i inkubiranje smjese na 37 ° C 5 min, 200 U rekombinantnog murine leukemia virus reverzne transkriptaze (Invitrogen) je dodan, i smjesa se inkubira na 37 ° C tijekom 45 min , Reverzne transkripcije je prekinuta zagrijavanjem do 95 ° C tijekom 5 minuta. Pregled}

realnom vremenu PCR pregled

Primeri za realnom vremenu RT-PCR su konstruirani na osnovi programa Primer Express (Applied Biosystems) a sintetizirane komercijalno (Sigma-Genosys, Sigma-Aldrich). PCR reakcije su provedene u konačnom volumenu od 13 ul koji sadrži 2 × SYBR Green Master Mix (Brilliant II SYBR Green qPCR Master Mix, Agilent), 2,7 ng mišjeg cDNA ili odgovarajućim razrjeđenjima vanjskog standarda (vidi niže), i odgovarajuće koncentracije početnice za hitinaza, pepsinogen C, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) ili beta-aktin. Korištene su standardne u realnom vremenu PCR uvjeti sustava (Mx3005P, Agilent) početne denaturacije i polimeraze aktiviranje korak tijekom 10 min na 95 ° C, a zatim 40 ciklusa denaturacije na 95 ° C tijekom 1 min, 55 ° C, 30 sekundi i 72 ° C tijekom 1 min. krivulje taljenja su generirani nakon pojačanja. PCR produkti su podvrgnuti elektroforezi na 10% poliakrilamidnom gelu i analizirana pomoću luminiscentnog analizatorom slike (ImageQuant LAS 4000, GE Healthcare). PCR otopina je tretirana s ExoSAP-IT (USB proizvoda) prema uputama proizvođača kako bi se uklonili i samostalna primera i dNTP, a proizvodi su sekvencionirani uporabom ABI PRISM Big Dye Terminator v3.1 ciklus sekvencioniranja Kit i 3130 Genetska Analyzer ( Applied Biosystems). Nukleotidne sekvencije primera odabranih za real-time PCR prikazani su u tablici S1. Pregled

Izgradnja Standardna DNA Netlogu

standardnog predloška cDNA (913 baza) za kvantifikaciju razine prijepisa realnom vremenu PCR je formiran kao što slijedi. CDNA fragmenti koji pokrivaju PCR-ciljnu regiju plus 9-120 baza bočnih područja AMCase, Chit1, pepsinogen C, GAPDH i p-aktin su pojačani s mišem želuca cDNA pomoću PCR, KOD plus DNA polimeraze (Tovobo) i oligonukleotide primer koji sadrži mjesta restrikcije Bgl pregled II, Xhol pregled sam, Pst pregled i, ili Ne
i (u 5 'i 3' - završava) u skladu s protokolom proizvođača. U naprijed i natrag primeri navedeni su u tablici S2. PCR produkti su pročišćeni pomoću Wizard SV gel i PCR čišćenje System (Promega), te potom razgrađen odgovarajućim restrikcijskim enzimima. Fragmenti DNA su pročišćeni elektroforezu u agaroznom gelu i čišćenje sustava, a zatim povezana zajedno s T4 DNA ligaze (Toyobo). Ligirani fragmenti su amplificirani pomoću forward primer 5'-GTGGATTCTGTGCCGACAAAGCAGATGGCC-3 'i reverznog primera 5' TGGGTACATGGTGGTACCACCAGACAGCAC-3 's KOD Plus DNA polimeraze. 3'-dA doda se amplificirane DNA pomoću Takara Taq HS (Takara Bio) i produkt je pročišćen je elektroforezom na gelu kao što je gore opisano. Nastali DNA je kloniran u pGEM-T Easy vektor (Promega) pomoću TA kloniranja, prema uputama proizvođača. Nukleotidna sekvenca dobivenog plazmida potvrđena je sekvenciranjem. Linearizirani multigena sadržava fragment DNA je pripremljen reamplification iz plazmidne DNA istog primerima PCR-om pomoću KOD Plus DNA polimeraze. Fragmenti su pročišćeni i kvantificirati kao što je opisano gore, a koristi se kao standardni DNK. Pregled

Priprema pet cDNA pokrivajući cijelo područje kodiranja pregled

Kako bi potvrdili našu apsolutnu realnom vremenu PCR metode, pripremili smo puni kodiranje cDNA pomoću PCR primera postavlja navedene u tablici S3. Pet cDNA koji obuhvaćaju cijeli kodirajućih regija dvaju hitinaza (Chit1 i AMCase) i referentnog gena (GAPDH, p-aktin i pepsinogen C) su povećani pomoću PCR iz mišjeg želuca cDNA pomoću KOD Plus DNA polimeraze i subklonirane su u pGEM-T lako vektora putem TA kloniranja, kao što je gore opisano. Sekvence cDNA potvrđeni sekvencioniranjem, kao što je opisano na slici S1. Je subklonirana fragmenti su ponovno pojača iz plazmida DNA s istim klicama, a zatim su korišteni kao cijeli kodiranje cDNA područja. Pregled

Standardna krivulja pregled

Izračunat je molarna koncentracija DNA standarda multigena sadržava temelji se na koncentraciji i molekulske mase. Serijska razrjeđenja pripravljeni su počevši od standardne koncentracije predloška koji je ostvario CT od približno 13 (Ct = frakcijskom vrijednosti praga ciklusa). Standardni DNA je podvrgnuta 10-strukih serijskih razrijeđenja, u rasponu od 10 ^{0 do 10 7 molekule, a alikvoti su pohranjeni na -20 ° C do upotrebe.}

kvantifikacije mRNA Real-time PCR pomoću standardnih krivulja ili ΔΔ Ct Metoda pregled

svaki uzorak je bio pojačan u tri primjerka, a svaki pokus ponovljen najmanje dva puta. Pomoću standardne krivulje, broj Chit1, AMCase, GAPDH, p-aktin i pepsinogen C mRNA molekula automatski ekstrapolirani pomoću MxPro qPCR Software verzije 4.10 (Agilent). Sve su vrijednosti bile izražene kao molekula po 10 ng ukupne RNA. U nekim slučajevima, vrijednosti su normalizirane prema razinama GAPDH ili P-aktin mRNA. Pregled

Za procjenu naše sadašnje metodologije, također zaposlen ΔΔ Ct metode [21], što zahtijeva mjerenje praga ciklusa (Ct) ciljnih gena. Ct vrijednosti izračunate su po MxPro qPCR softvera pomoću GAPDH ili p-aktin kao normalizaciju. Pregled

Rezultati

Uspostava realnom vremenu PCR test pregled

uspostavu pouzdana metoda za mjerenje ekspresije chitinase transkripata je važan korak u istraživanju značaj mišem hitinaze. Real-time RT-PCR je, u ovom trenutku, najosjetljivije kvantitativna metoda za detekciju obje niske brojnosti mRNA i obilje transkripata. Prvo smo u odnosu na razinu ekspresije gena Chit1 i AMCase gena (vidi sliku 1). Za procjenu razine hitinaze, koristili smo dva domaćih gena, GAPDH i P-aktin, kao referentne gene jer su konstitutivno eksprimiran u visokoj razini u većini tkiva i stanica [22]. Osim toga, mi smo izabrali pepsinogen C (također poznat kao progastricsin) kao referentna gena u želucu. Pepsinogen C je aspartatna proteaza koja djeluje kao probavni enzim, a proizvodi se u želucu. Ovaj enzim predstavlja glavnu komponentu želučane sluznice [23]. Korištenjem ove tri referentne gene, ocijenili smo ekspresiju gena Chit1 i AMCase u mišjim tkivima (Slika 1). Pregled

Prvi dizajniran nekoliko setova početnica za kvantitativne PCR i ocijeniti njihovu prikladnost ovisno o tome dali su pojedinačni proizvodi što se odražava u temperaturi jednom taljenja (Tm) i jedan bend na 10% poliakrilamid gel. Nukleotidni slijedovi iz proizvoda također je potvrđeno. Ispitati specifičnost primera, svaka PCR produkata je pojačan u realnom vremenu PCR uvjetima korištenjem smjese miša tkiva cDNA koja se sastoji od tkiva iz četiri embrionalnih faze i osam odraslih tkiva i ispitana je u kombinaciji s različitim metodama. Kao što je prikazano na slici 2A-E, samo jedan pik pojavila krivulje disocijacije za Chit1 (Tm = 79.7 ° C), AMCase (Tm = 79.1 ° C), GAPDH (Tm = 81.4 ° C), β-aktin (Tm = 82,0 ° C) i pepsinogen C (Tm = 81,4 ° C). Na kraju PCR, analizirali smo proizvode na 10% poliakrilamidnom gelu. Gel elektroforeza pokazali jasne pojedinačne crte na očekivanim veličinama Chit1 (69 bp), AMCase (81 bp), GAPDH (77 bp), β-aktin (71 bp) i pepsinogen C (82 bp) (Slika 2F). Nukleotidni slijedovi iz PCR proizvoda određene su izravno kao što je opisano u dijelu Materijali i metode. utvrdili smo da su PCR produkti umnoženi iz ciljne cDNA (vidi Sliku 3B). Ovi rezultati pokazuju da su PCR proizvodi su specifične umnošci iz ciljne cDNA i da mispriming zanemariva u našim eksperimentalnim uvjetima. Pregled

Izgradnja DNK standardnog predloška za kvantifikaciju i usporedba Gene Expression Među pet gena pregled

Mi smo tražili za usporedbu razina ekspresije dvaju hitinaze i tri referentne gena na istoj razini (Slika 1). U tu svrhu, postavili smo kvantitativnu real-time PCR sustav za koji je bilo neophodno za precizno kvantificiranje (Slika 3A) standardna predložak. konstruirali smo standardnu ​​šablonu DNA za real-time PCR vezanjem pet ciljane fragmenata u odnosu jedan na jedan, a onda Ligiranom DNA fragment je kloniran u plazmidni vektor kao što je opisano u Materijali i postupci sekcije (slika 3A) , 913-nukleotid-dugo DNA kalupa sadrži pet fragmenta koji pokrivaju PCR-ciljnu regiju plus 9-120 bazama bočnim područjima i sadržavali su restrikcijskih mjesta za Bgl
II, Xhol pregled I. Pst pregled i i Ne
sam (vidi detalje u slici 3B). pregled

Validacija standardne krivulje i kvantitativna real-time PCR sustav pregled

kvantifikacija oba hitinaze i referentnih mRNA se oslanja na standardne krivulje. Serijska razrjeđenja standardnog predloška DNA korištene su za konstrukciju standardne krivulje za usporedbu i procjenu u realnom vremenu RT-PCR kvantifikacije strategije koje su korištene za analizu pet mRNA. Svaki Standardna krivulja je generiran s 10-struko razrjeđenje standardne DNK i pet različitih parova početnica (Slika 4A-E, lijevo). Eksponencijalna amplifikacija je održavana u širokom rasponu ciklusa, dajući dinamički raspon od sedam redova veličine (Slika 4A-E, lijevo). Koristeći standardnu ​​šablonu DNA koja sadrži pet cDNA fragmente, jednake količine se mogu dodijeliti svih pet gena u svakoj upotrebi razrjeđivanje za konstrukciju standardne krivulje (Slika 4A-E, desno). Pregled

Za testiranje apsolutnu jednakost krivulja, i poznata koncentracija cijelu kodirajuću cDNA je, te analizirana kao nepoznatog uzorka. Ova je analiza provedena kako bi provjerili da je svaki testirani razrjeđivanje rezultirala očekivanim količinama. Kao što je prikazano na slici 4A-E, u redu, jednake količine su promatrani za svaki testirani razrjeđenja je korištena za konstrukciju standardne krivulje (vidi sliku S2). Kvantifikacija niske brojnosti transkripata i obilje transkripata nam omogućuje provjeru valjanosti osjetljivost i pouzdanost u realnom vremenu PCR, što znači da je naše real-time PCR metoda nudi veliki dinamički raspon kvantifikaciju, visoke točnosti, te visoka osjetljivost (Slika 4a E, desno). Dakle, naše real-time PCR metoda daje pouzdane vrijednosti za dva chitinase gena i referentnih gena na istoj razini. Pregled

Izražavanje Chit1 i AMCase u Miš Tkiva

Kako bi proučili in vivo pregled regulacije Chit1 i AMCase ekspresije gena, uzoraka ukupne RNA izvađeni iz četiri embrionalnih fazi i iz raznih odraslih tkiva analizirani su s kvantitativnom realnom vremenu PCR analizi koristeći jednu standardnu ​​DNA (slika 3). Rezultati su izraženi kao molekula po 10 ng ukupne RNA (Slika 5 i Slika 6). I Chit1 i AMCase mRNA su vrlo izražen u mišjim tkivima (Slika 5a i 5b). Jasne specifičnosti tkiva su kod ekspresije obrazaca oba chitinase mRNA. Visoke razine Chit1 mRNA detektirane su u mišjim želucu (Slika 5A, gornji panel), a zatim oči i pluća. Chit1 mRNA gena niskim, a lako detektirati, razine u drugim tkivima (Slika 5A, donji prikaz). AMCase mRNA pretežno otkrivena je u želucu, nakon čega slijedi submaksilarne žlijezda (slika 5B, gornja ploča), ali je također bio prisutan u drugim tkivima (Slika 5b, donji dio slike). Pregled

Mi smo tada u odnosu omjera AMCase da Chit1. Kopija broj svakog mRNA je određena pomoću iste standardne razrjeđenja. Otkrili smo da je želudac i submaksilarne žlijezde pretežno izrazio AMCase mRNA (Slika 5c, gornji panel). Ostali tkiva ispituje u ovom istraživanju proizveo više AMCase od Chit1 i Chit1 je rasprostranjen samo u očima (Slika 5c, donji panel). Pregled

Sljedeći ispitanih relativnu kvantifikaciju u izvornim podacima prikazanim na slici 5, koja je izražena kao molekula po 10 ng ukupne RNA, uporabom domaćih gena kako je opisano u Materijali i postupci. Rezultati su prikazani kao popratne podatke na slici S3 (podaci se normalizira GAPDH) i Slika S4 (normalizirani p-aktin). Zatim, analizirali smo podatke prikazane na slici 5 do ΔΔ Ct metode [21], a prikazani su kao i dodatne informacije na Slici S5 (normalizirani GAPDH) i Slika S6 (normalizirani p-aktin). Kada se uspoređuju relativni izraz otkrio sadašnjim apsolutnim i relativnim metodama kvantifikaciju, nije bilo značajne razlike među podacima, osim za izražavanje Chit1 mRNA, što je najviše u izobilju izraženim u očima kad normalizirani ß-aktin (vidi sliku 5, Slika S3 i Slika S4). Slični rezultati su dobiveni relativne kvantifikacije pomoću ΔΔ Ct metode [21] (vidi Sliku 5, Slika S5 i Slika S6). Međutim, nismo mogli izravno ocijeniti investicijski razine ekspresije Chit1 i AMCase kada se analiziraju od strane ΔΔ Ct metode. Pregled

Analiza Chit1, AMCase, Pepsinogen C, GAPDH i ß-aktin u pluća i želuca tkiva

Mnoge studije su provedena na patofiziologiju hitinaze sisavaca u pluća tkiva. U ovom istraživanju, pokazali smo da AMCase mRNA pretežno izražava se u mišje želučanog tkiva (slika 5.). Također smo u odnosu na razinu izraz hitinaze i referentnih gena koji koristi cDNA pripremljene iz pluća i želuca tkivima 3 mjeseci starih miševa (n = 5). Kvantitativni podaci su prikazani na Slici 6. Kada su razine Chit1 namjesti se na 1.0, a relativna razina ekspresije cDNA AMCase, 14; GAPDH, 196; i β-aktin, 681 u mišjim plućima tkiva (Slika 6A). Ovaj rezultat pokazuje da pluća tkiva izraziti više AMCase nego Chit1, iako je razina AMCase izraz bio manji nego što je dva domaćih gena. Pregled

U želucu tkiva, kada je razina Chit1 postavljena je na 1,0, relativne razine ekspresije bili AMCase, 721; pepsinogen C, 2261; GAPDH, 61; i β-aktin, 127 (slika 6B). I GAPDH i P-aktin geni su dobro poznati domaćih gena i konstitutivno eksprimiran u visokoj razini u većini tkiva i stanica. Pepsinogen C (progastricsin) je aspartatna proteaza koja djeluje kao probavni enzim, a proizvodi se u želucu. Ovaj enzim je glavna komponenta želučane sluznice [23]. Razina ekspresije AMCase bila mnogo veća od onih GAPDH i P-aktin i bila je usporediva s razinom pepsinogen C. Ovi rezultati pokazuju da želudac AMCase je glavni transkript u sluznicu želuca i sugeriraju da ovaj enzim je vjerojatno da će igrati važne fiziološke uloge u želucu. pregled

također smo preispitati relativni izraz Chit1, AMCase i pepsinogen C prikazan je na slici 6 korištenjem domaćih gena po metodi kao što je gore opisano. Rezultati su prikazani kao popratne podatke na slici S7 (normalizirani GAPDH) i Slika S8 (normalizirani p-aktin). Nije bilo značajne razlike između slike 6, Slika S7 i S8 Slika. Pregled

Rasprava pregled

I Chit1 i AMCase su mislili da pomogne u obrani domaćina protiv patogena hitina koji sadržavaju [3], [ ,,,0],9]. Osim toga, AMCase je djelatna molekula u alergijskoj upali. Ovi chitinolytic enzimi igraju važnu ulogu u patofiziologiji alergijskih reakcija dišnih puteva u mišjim modelima astme. Relativno se malo zna, međutim, o in vivo
razina uzajamnog ekspresije Chit1 i AMCase. Kvantifikacija mRNA može generirati korisne i Biomedicinski relevantne informacije. U ovom istraživanju, uspostavili smo kvantitativnog real-time PCR sustav sposoban za određivanje razine mRNA dva hitinaze sisavaca i usporedbe tih razina s onima referentnih gena koristeći istu skalu. Naši rezultati ukazuju da AMCase pretežno nastaje ekspresijom u mišjim želucu. Pregled

kvantitativni u realnom vremenu RT-PCR predstavlja važan napredak na kvantificiranje mRNA i omogućava detekciju ekspresije određenog gena od interesa na molekularnoj razini , Postoje mnogi izvještaji o otkrivanju izuzetno niske razine mRNA pomoću ove tehnologije. Međutim, u stvarnom vremenu RT-PCR nije naširoko koristi, jer još uvijek ima ograničenja u kvantificiranja više mRNA pomoću iste ljestvice. konstruirali smo standardnu ​​šablonu DNA se sastoji od pet fragmenta (svaka ~200 duge baza). Ovi fragmenti uključuju fragmente iz dva hitinaze, jedan marker i dva domaćih gena i spojeni su u jedan-na-jedan omjerima (Slika 3A). GAPDH i β-aktin, najčešće korišteni domaćih gena, uključene su kao internih kontrola i reference za PCR amplifikaciju. Osim toga, koristili smo pepsinogen C kao marker genom jer je proizvedena na visokoj razini u želucu [23]. Ova metoda ostavljena apsolutnu kvantificiranje broja i Chit1 AMCase mRNA molekula, kao i broj molekula mRNA referenca, na 10 ng ukupne RNA (mol /10 ng) (Slika 5 i Slika 6). Nadalje možemo ispitati relativni kvantitativno određivanje razine Chit1 i AMCase mRNA pomoću dva domaćih gena, GAPDH i β-aktin (prateće informacije Slika S3 i S4 slici). Pregled

Relativno kvantificiranje je lakše izvesti nego apsolutnu kvantifikaciju, jer je kalibracijska krivulja nije potrebno. Relativne kvantifikacije, razina mRNA gena od interesa su u usporedbi s onima iz domaćih gena [21]. Međutim, ova metoda kvantifikacije ne usporediti razine različitih prijepisa gena na istoj razini. Iako je naša metoda zahtijeva više koraka povezanih s izgradnjom standardne DNK i procesima validacije, ova metoda može dati ekspresije gena podatke koji su izravno usporedivi između gena (Slika 5 i Slika 6). Naš real-time PCR daje veliki dinamički raspon kvantifikaciju i visoku osjetljivost i kvantifikacija niske brojnosti transkripata nam je omogućilo da provjeriti osjetljivost i pouzdanost naše metode (slika 4). Ova tehnika je vrlo dobro prilagođen za kvantifikaciju i usporedbe razine mRNA u više gena koji koriste istu skalu. Naš postupak je primjenjiv na biomedicinskog inženjerstva, kao i kliničke i praktične primjene. Pregled

U ovom istraživanju, otkrili smo da AMCase mRNA se sintetizira na iznimno visokoj razini u mišje želuca u odnosu na razine domaćih gena (Slika 5 i Slika 6). Razina AMCase mRNA se može usporediti s onom pepsinogen C (progastricsin) mRNA, glavna komponenta sluznice želuca u želucu (Slika 6B). Osim želuca, submaksilarne žlijezde također je nađeno da daje velike količine AMCase (slika 5). Kao i za sintezu hitinaze mRNA sisavaca, i želuca i submaksilarne žlijezde smatraju značajnim tkiva za proizvodnju ogromne količine AMCase u miša. Pregled

klorovodična kiselina izlučuje u želucu, stvarajući kiselih uvjeta za probavu proteina pepsinskom na približno pH 2 [23], [24]. Miš AMCase pokazuje stabilnost duboku kiseline te je najaktivniji na pH 2.0, što ga razlikuje od drugih enzima mišem [8]. Neobičan pH stabilnost i ovisnost miša AMCase na kiselim uvjetima omogućuju učinkovitu probavu hitinski materijala u kiselim uvjetima. Ustanovljeno je da AMCase pretežno se izražava u trbuhu ukazuje na njegovu moguću funkciju u preradi hrane. Divlji miševi jedu hranu hitina koji sadrže, kao što su kukci, dok miševi drže u laboratoriju jesti umjetne prehrane koji sadrže sušeni pivski kvasac ", koji također sadrži hitin u staničnoj stijenci. Dakle, AMCase može funkcionirati kao probavni enzim koji razgrađuje polimernog hitin u želučanog sadržaja. Pregled

Najviša razina Chit1 također je izražen u miša želucu. Međutim, Chit1 razina ekspresije u želucu bio 1/721 onom nivou AMCase ekspresije i bila je niža od razine ekspresije dvaju domaćih gena, GAPDH i β-aktin (slika 6a). Osim toga, Chit1 ne posjeduje chitinolytic aktivnost na pH želučanog soka, što je oko pH 2 [5], [11]. Pokazano je da se proizvodi Chit1 na mjestima blizu neutralnog pH, kao što je non-žljezdanog dijela želuca i tankog crijeva [25]. Dakle, Chit1 ne doprinosi chitinase aktivnosti u mišjem želucu. Pregled

Iako AMCase izražava pretežno u želucu i submaksilarne žlijezde, sva druga tkiva ispitivani u ovom istraživanju izrazili nizak, ali se može detektirati, razine Chit1 i AMCase , Razina ekspresije Chit1 i AMCase bile su niže od onih od domaćih gena u tim tkivima. Chit1 prikazuje široku pH optimuma oko pH 5 [5], dok je primarna optimalan pH AMCase je pH 2, a sekundarni pH optimalno je na pH 4-7 s AMCase zadržavanje manje od 30% svog djelovanja na pH 2, ovaj raspon pH [8]. Oba Chit1 i AMCase probaviti prirodnim hitin i hitosana putem endo-hitinaza aktivnosti i proizvode chitobiose [8], [26]. Iako AMCase je dominantna nad Chit1 u mnogim mišem tkivima, možda neće biti nikakvih značajnih razlika u njihovoj chitinolytic aktivnosti u mišjim tkivima. Pregled

Više AMCase mRNA od Chit1 mRNA uočena je u većini mišem tkiva, osim za oči. Naši rezultati također ukazuju na to da genska ekspresija Chit1 se može regulirati razvojno, sugerirajući da je to igra ulogu u posebnom pažnjom. Studiranje regulaciju ekspresije hitinaze sisavaca mogu dati uvid u fiziološke uloge ovih enzima. Detaljan karakterizacija promotorske regije Chit1 i AMCase gena, kao i identifikacija cis pregled - i TRANS
-acting faktori će biti potrebna za razumijevanje selektivnu ekspresiju ovih enzima <. br>

Iako sisavci ne proizvode hitin ili hitin sintetaza, oni su stalno izloženi tom polimera kroz izloženost parazita i patogena hitina koji sadrže. Supstrat za hitinaze sisavaca je vjerojatno hitin okoliša, kao što je nađeno kod gljiva ili parazitskih nematoda. U plućima, oba enzima može djelovati kao dio obrambeni mehanizam stanice domaćina protiv patogena hitina sadržavaju, kao kalup i grinje okoliša da induciraju dišnih putova alergijom.

• PLoS ONE: Analiza želudac i crijevo Microbiomes Istočnog Oyster (Crassostrea virginica) iz obalnog Louisiana, SAD
• PLoS ONE: čimbenik rasta fibroblasta 10-čimbenik rasta fibroblasta receptor 2b posredovani prijenos signala nije potrebna za odrasle žljezdana Želudac Homeostasis