PLoS ONE: Chitinase iRNR lygius kiekybine PGR naudodami vieno standarto DNR: Rūgštinis Žinduolių Chitinase yra pagrindinis stenograma pelių skrandžio

Abstract

Chitinases hidrolizuoti β-1-4 glikozidų jungtimis Chitinas, pagrindinis struktūrinis komponentas grybeliai, vėžiagyvius ir vabzdžius. Nors žinduoliai negamina Chitinas ar jos syntazės, jie išreiškia dvi veikliosios chitinases, chitotriosidase (Chit1) ir rūgštinis žinduolių chitinase (AMCase). Šie žinduolių chitinases pritraukė daug dėmesio dėl padidinto savo išraiškos žmonėms, kurie yra patologinių būklių,, įskaitant Gošė ligos, Alzheimerio ligos ir astmos skaičius. Tačiau, šių fermentų į šių ligų patofiziologiją, dalis vis dar yra kurios turi būti nustatytos. Iš Chit1 ir AMCase mRNR lygio kiekybinis ir tų lygių palyginimas su žinomais atskaitos genų lygių gali generuoti naudingą ir biomedically susijusią informaciją. Pradžioje, mes nustatė kiekybinį realaus laiko PGR sistema, kuri naudoja standartinį DNR, gaunamą pagal liguojant kDNR fragmentai tikslinių genų. Ši sistema leido mums įvertinti ir palyginti raiškos lygį; chitinases o nuoroda genus pačiu mastu. Mes nustatėme, kad AMCase iRNR yra sintetinamas ne itin aukšto lygio, kad pelės skrandį. Šio mRNR pelių skrandžio lygis buvo nuo 7 iki 10 kartų didesnė, nei iš namų ruošą genų lygių ir buvo panašus į, kad mRNR už pepsinogen C (progastricsin), pagrindinis komponentas skrandžio gleivinės lygis. Taigi, AMCase iRNR yra pagrindinis stenograma pelių pilvo, tai rodo, kad AMCase veikia kaip virškinimo fermento, kuris skaido polimerinį Chitinas ir kaip dalį priimančios gynybos nuo Chitinas, kurių sudėtyje yra patogenų skrandžio turinį. Mūsų metodika yra taikoma į mRNR kiekybinio keliems genų keliose egzempliorių, naudojant tą patį mastelį

Citavimo:. Ohno M, Tsuda K, Sakaguchi M, Sugahara Y Oyama F (2012) Chitinase iRNR lygiui kiekybiniais PGR Naudojant vieną standartą DNR: Rūgštinis žinduolių Chitinase yra pagrindinis stenograma pelių pilvo. PLoS Vienas 7 (11): e50381. Doi: 10,1371 /journal.pone.0050381

redaktorius: Dominik Hartl, Tiubingeno universitetas, Vokietija

Įstojo rugpjūčio 6, 2012 m Priėmė Sausio 19. Spalis, 2012 m Paskelbta: Lapkričio 21, 2012

Visos teisės saugomos: © 2012 Ohno et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė projekto mokslinių tyrimų dotaciją iš mokslinių tyrimų instituto mokslo ir technologijų Kogakuin universitete. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Chitinas, linijinis polimeras beta-1-4-susijusi, N
acetil-d-gliukozamino, yra antras labiausiai paplitęs polisacharidas randamas gamtoje. Ji veikia kaip pagrindinis struktūrinis komponentas grybų, vėžiagyvių, ir vabzdžių, tačiau nėra nustatyta, žinduolių [1]. Chitinases hidrolizuoti β-1-4 glikozidų obligacijų chitino polimero. Nors žinduoliai negamina Chitinas ar jos syntazės, jie išreiškia dvi veikliosios chitinases, chitotriosidase (Chit1) ir rūgštinis žinduolių chitinase (AMCase) [2], [3].

Chit1 lygis ženkliai padidėjusi plazmos pacientams, sergantiems Gošė ligos, autosominiu recesyvinis lizosominio saugojimo sutrikimas [4]. Chit1 buvo pirmasis žinduolių chitinase turi būti gryninamas ir klonuotas [5], [6]. Recessively paveldėjo trūkumas Chit1 veiklos pasitaikiusios baltaodžiams [7]. AMCase buvo atrasta, nes jos kompensacinio vaidmenį ir buvo pavadintas jo rūgštus optimalus [8]. Šie žinduolių chitinases yra laikomi kaip priimančiosios gynybos mechanizmą nuo Chitinas, kurių sudėtyje yra patogenų ir parazitų [3], [9].

Ir Chit1 ir AMCase yra išskiriami baltymai su molekulinės masės maždaug 50 kDa. Abu baltymai yra N-terminalas katalizinis domeną, vyrio regioną, ir C-galinę chitino-rišantis domenas [6], [8]. Pelės AMCase rodo sekos homologiją į Chit1, su 52% identiškumą ir 60% [10] panašumo. Nepaisant šių struktūrinių panašumų, šie fermentai gerokai skiriasi atsižvelgiant į jų fermentinio elgesį rūgštaus pH. AMCase rodo žymų pH optimalus esant pH 2 ir mažiau akivaizdus optimalus esant pH 4-7 [8], o Chit1 rodo tik platų pH optimalus maždaug pH 5 [5], [11].

Žinduolių chitinases pritraukė daug dėmesio dėl savo padidėjusio raiškos asmenų su skirtingais patologiniams. Chit1 yra didesnė asmenims, sergantiems Gošė liga [4], lėtinė obstrukcinė plaučių liga (LOPL) [12], ir Alzheimerio liga [13] ir rūkančiųjų [14]. AMCase išraiška ir veikla taip pat aktyvinama per alerginių kvėpavimo takų atsakymų pelės modelių astma [15]. Be to, polimerinė chitino sukelia AMCase išraiška ir imuninių ląstelių, susijusių su alergijos ir astmos [16] priėmimui į darbą. Šie rezultatai aiškiai rodo, kad chitinolytic fermentai vaidina svarbų vaidmenį daugelyje patofiziologinių sąlygomis. Tačiau, šių fermentų šių ligų patofiziologija indėlis dar reikia nustatyti.

iš Chit1 ir AMCase mRNR lygio kiekybinis įvertinimas ir šių lygių palyginimas su žinomais atskaitos genų kiekis yra svarbus žingsniai įgyti pažvelgti į in vivo, pervežimas reguliavimo žinduolių chitinases. Neseniai, realaus laiko AT-PGR buvo naudojamas kiekybiškai iRNR lygiui daugelyje ekspresijos tyrimų [17] - [20], nes šis metodas yra pakankamai jautrus, kad aptikti mRNR iš net vienos ląstelės. Realaus laiko PGR dažniausiai apima ekspresijos lygių interesų su tais, iš namų ruošą genų, kurie yra manoma, kad nuosekliai išreikšti visi mėginiai genų normalizuoti. Tačiau, tai kiekybinis metodas yra nesėkmingas palyginti skirtingų genų transkriptų lygius tą pačią skalę.

šiame tyrime, mes sukūrė kiekybinę realaus laiko RT-PCR sistema, kuri naudoja standartinį DNR, gaunamą pagal liguojant kDNR fragmentai tikslinių genų. Ši sistema leido mums įvertinti ir palyginti raiškos lygį; chitinases o nuoroda genus pačiu mastu. Mūsų rezultatai rodo, kad AMCase yra pagrindinis stenograma to, kad pelės pilvo, tai rodo, kad atitinkamas baltymų veikia kaip virškinimo fermento, kuris skaido chitino turinčių maisto produktų ir kaip priimančiosios gynybos nuo Chitinas, kurių sudėtyje yra patogenų skrandžio turinį.

medžiagos ir metodai

RNR RNR išskyrimas ir kDNR paruošimas

Pelės viso RNR magistras grupė (Klontex laboratorijos) buvo nagrinėjama audinių pasiskirstymą nuorašai. Tyrėme keturių skirtingų embrionų etapus ir aštuonis suaugusius audinius. Be to, RNR buvo išskirtas iš plaučių ir skrandžius 3 mėnesių amžiaus vyrų pelių. C57BL /6J pelėms (skaidrus Japonija) buvo veisiami ne RIKEN smegenų mokslo institutas gyvūnų priemonę. Visi bandymai su gyvūnais buvo atliekami laikantis įstaigoje patvirtintas gaires. Protokolas buvo patvirtintas dėl pranešimo apie gyvūnų eksperimentai su RIKEN Smegenų mokslų instituto Etikos komiteto (patvirtinimo Nr H19-2B013). Visi chirurgija buvo atlikta naudojant dietilo eterio kaip anestetikas, ir buvo atlikti visi Siekiant sumažinti skausmą. Šie audiniai iRNR rengimo teikė dr. Miyazaki ir Nukina ne RIKEN Smegenų mokslų instituto. Iš viso RNR buvo ruošiamas iš plaučių ir skrandžiai, naudojant TRIzol reagento (Invitrogen) pagal gamintojo instrukcijas. Norėdami pašalinti nedidelius užteršė genomo DNR, bendra RNR mėginiai buvo gydomi RQ1 RNazės-Free DNaze (Promega) pagal gamintojo rekomenduojamą protokolą. Iš nukleino rūgščių koncentracija buvo nustatomas matuojant absorbciją prie 260 nm, naudojant BioPhotometer plius "(EPPENDORF). Kiekvienas iš visų RNR bandiniuose (3 mikrogramų) leidžiamas į atvirkštinę transkripciją su heksamerų pradmenimis,. Reakcijos mišinys (15 mikrol), esančius fermento buferio [50 mM Tris-HCl, (pH 8,3), 75 mM KCl, ir 3 mm MgCl _{2], 100 ng heksamerų, 10 mM ditiotreitolo, ir 0,5 mM deoksinukleotido trifosfatai (dNTP). Po to, kai šildymo tirpalą iki 60 ° C temperatūroje 5 min ir inkubuojant 37 ° C temperatūroje mišinys 5 min, 200 U rekombinantinis pelių leukemijos viruso atvirkštinės transkriptazės (Invitrogen) buvo pridėta, ir mišinys inkubuojamas 37 ° C temperatūroje 45 min , Atvirkštinės transkripcijos buvo nutraukta kaitinant 95 ° C temperatūroje 5 min.}

Realaus laiko PGR

gruntai realaus laiko AT-PGR buvo sukurta remiantis Primer Express Software (Applied Biosystems) ir susintetinti komerciškai ( "Sigma-Genosys, Sigma-Aldrich). PGR reakcijos buvo atlikti galutinio tūrio 13 įxL, kurių sudėtyje yra 2 × SYBR Green Master Mix (Briliantas II SYBR Žalioji QPCR pagrindinį mišinį, Agilent), 2,7 ng pelės kDNR ar atitinkamas praskiestų išorės standartus (žiūrėti žemiau), o tinkamos koncentracijos už jam chitinases, pepsinogen C, gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH) ar beta-aktino pradmenis. buvo naudojami standartiniai realaus laiko PGR sąlygos sistemos (Mx3005P, Agilent): pradinis denatūravimo ir polimerazės aktyvavimo žingsnis 10 min 95 ° C temperatūroje, o po to 40 ciklų denatūruojant 95 ° C temperatūroje 1 min, 55 ° C temperatūroje 30 sek, ir 72 ° C temperatūroje 1 min. Tirpstantys kreivės buvo sukurtas po amplifikacijos. PGR produktai buvo elektroforezė ant 10% poliakrilamido gelyje ir analizuojami naudojant liuminescencinės Image Analyzer "(ImageQuant LAS 4000," GE Healthcare "). PGR sprendimas buvo gydomi ExoSAP-IT (USB produktai) pagal gamintojo nurodymus pašalinti neįregistruotas pradmenis ir dNTP, ir produktai buvo sekos naudojant ABI PRISM Big Dažų Terminatorius v3.1 Cycle Sequencing Kit ir 3130 Genetinis analizatorius ( Applied Biosystems). Nukleotidų sekos pradmenų atrinktų realiojo laiko PGR rodomi S1 lentelėje.

Statyba Standartinė DNR

standartinį šabloną kDNR (913 bazės) už stenograma lygių kiekybinio realaus laiko PGR buvo apskaičiuota, kaip nurodyta toliau. KDNR fragmentas, apimantis PCR-tikslinio regiono plius 9-120 bazes supančių regionų AMCase, Chit1, pepsinogen C, GAPDH ir beta-aktino buvo papildytas iš pelės skrandžio kDNR PGR naudojant KOD Plius DNR polimerazės (Toyobo) ir oligonukleotidai gruntas su apribojančius svetaines BGL
II Xho
aš Pst
I arba ne
aš (bent 5'ir 3 ' - baigiasi) pagal gamintojo protokolą. Į priekį ir atbulinės gruntai yra išvardyti S2 lentelėje. PGR produktai buvo išgrynintas naudojant vedlį SV gelio ir PGR valymo sistema (PROMEGA) ir tada suardomas su atitinkamomis restrikcijos fermentų. DNR fragmentai buvo išgrynintas naudojant agarozės gelio elektroforezės ir valymo sistema, o tada susiūta kartu su T4 DNR ligaze (Toyobo). Liguotą fragmentai buvo papildyta naudojant priekį gruntas 5'-GTGGATTCTGTGCCGACAAAGCAGATGGCC-3 "ir atvirkščią gruntas 5'-TGGGTACATGGTGGTACCACCAGACAGCAC-3" su KOD Plius DNR polimerazės. 3'-DA buvo įtraukta į amplifikuotos DNR, naudojant TAKARA Taq HS (Takara Bio), ir produktas buvo gryninamas gelio elektroforezės, kaip aprašyta aukščiau. Gautas DNR buvo klonuotas į pGEM-T yra lengva vektoriaus (Promega) per TA klonavimo, pagal gamintojo instrukcijas. Nukleotidų seka susidariusios plazmidės buvo patvirtinta sekos. Linearizuota multigene, kurių sudėtyje yra DNR fragmentas buvo parengta reamplification iš plazmidės DNR su tais pačiais pradmenų PGR metodu, naudojant KOD plius DNR polimerazę. Fragmentai buvo išvalytas ir kiekybiškai, kaip aprašyta aukščiau ir naudojamas kaip standartinis DNR.

paruošimas Penkių kDNR, apimanti visą kodavimo Regionas

Jei patvirtinti mūsų absoliučią realaus laiko PGR metodu, mes pasirengę pilnas kodavimo kDNR pagal PGR naudojant išvardytus S3 Stalo pradmenų rinkinius. Penki kDNR, apimanti visą kodavimo regionus dviejų chitinases (Chit1 ir AMCase) ir etaloninių genų (GAPDH, beta-aktino ir pepsinogen C) buvo papildyta PGR nuo pelių skrandžio kDNR naudojant KOD Plius DNR polimerazės ir subklonuoti į pGEM-T Lengvas vektorius per TA klonavimo, kaip aprašyta aukščiau. Priemonės, kuriomis kDNR sekos buvo patikrinti to nustatoma seka, kaip aprašyta S1 pav. Subklonuotų fragmentai buvo reamplified iš plazmidės DNR su tų pačių pradmenų ir tada buvo naudojamas kaip visą koduojančios srities cDNR.

Standartiniai kreivės

molinis koncentracija multigene, kurių sudėtyje yra DNR standartą buvo apskaičiuojamas remiantis koncentracijos ir molekulinės masės. Serijinių praskiedimų buvo paruošti pradedant nuo standartinio šablono koncentracijos, kuri buvo pažymėta per maždaug 13 (Ct = frakcinės slenkstinis ciklas vertės) Ct. Standartinė DNR buvo atliktas 10 kartų serijiniu būdu atskiedus, nuo 10 ^{0 iki 10 7 molekulių, o mėginiai buvo laikomi užšaldyti iki -20 ° C iki naudojimo.}

kiekybinio mRNR Real-Time PCR naudojant standartinę Curves arba atsiradus ΔΔ ct metodas

kiekvienas mėginys buvo papildyta trimis egzemplioriais, ir kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas bent du kartus. Naudojant standartinę kreivę, iš Chit1, AMCase, GAPDH, beta-aktino ir pepsinogen C mRNR molekulės numeriai buvo ekstrapoliuoti automatiškai naudojant MxPro QPCR programinės įrangos versija 4.10 (AGILENT). Visos vertės, išreikštas molekulių per 10 ng visų RNR. Kai kuriais atvejais, vertės buvo normalizuotas prieš GAPDH ar beta-aktino mRNR lygiais.

vertinant mūsų dabartinę metodiką, taip pat dirba su ΔΔ Ct metodą [21], kurioje reikalaujama ciklo riba matavimas (CT) tikslinių genų. Ct reikšmės buvo apskaičiuotos iš MxPro QPCR Software naudojant GAPDH ar beta-aktino kaip normalizuoja.

Rezultatai

steigimas realiojo laiko PGR Analizės

ir personalo patikimas metodas į chitinase transkriptų išraiškos matavimo yra svarbus žingsnis tiriant pelės chitinases reikšmę. Realaus laiko PGR yra šiuo metu, pats jautriausias kiekybinis metodas tiek mažai gausa mRNR ir gausiai nuorašai aptikti. Mes pirmą kartą palygino genų ekspresijos lygį; Chit1 ir AMCase genų (žr 1 pav.) Įvertinti chitinase lygį, mes panaudojome du namų ruošos genai, GAPDH ir ß-aktino, kaip pamatiniai genų, nes jie constitutively išreikšta aukšto lygio daugelyje audinių ir ląstelių [22]. Be to, mes pasirinkome pepsinogen C (taip pat žinomas kaip progastricsin) kaip atskaitos geno skrandį. Pepsinogen C yra asparto proteazės, kad veikia kaip virškinimo fermento ir yra skrandyje gaminama. Šis fermentas yra pagrindinė sudedamoji skrandžio gleivinės [23]. Naudojant šiuos tris pamatinius genus, mes įvertino genų ekspresiją Chit1 ir AMCase pelių audinių (1 pav.)

Mes pirmą kartą sukurta keletą rinkinių gruntų kiekybiniam PGR ir įvertinti jų tinkamumą pagal tai, ar jie davė pavieniai produktai , kaip atspindi vieną lydymosi temperatūra (Tm) ir vieną juosta 10% poliakrilamido gelyje. Nukleotidų sekos produktų taip pat buvo sutikrinti. Nagrinėti pradmenų, specifiškumą, kiekvienas iš PGR produktų buvo papildyta pagal realaus laiko PGR sąlygomis, naudojant pelės audinių kDNR mišinys, kurį sudaro audinių iš keturių pradinėje stadijoje ir aštuonių suaugusių audinių ir buvo tirta kartu su skirtingais metodais. Kaip parodyta pav 2A-E, tik viena smailė pasirodė disociacijos Kreivė Chit1 (Tm = 79,7 ° C), AMCase (Tm = 79,1 ° C), GAPDH (Tm = 81,4 ° C), β-aktino (Tm = 82,0 ° C) ir pepsinogen C (TM = 81,4 ° C). Ties PGR pabaigoje, mes analizuojami dėl produktų, 10% poliakrilamido gelyje. Gelyje parodė aiškius vienviečiai juostas planuojamų dydžių Chit1 (69 bp), AMCase (81 bp), GAPDH (77 bp), β-aktino (71 BP) ir pepsinogen C (82 BP) (2F pav.) Nukleotidų sekos PGR produktų buvo tiesiogiai nustatomas kaip aprašyta medžiagos ir metodai skyriuje. Mes patvirtino, kad PGR produktai buvo papildytas iš tikslinių kDNR (žr 3B pav). Šie rezultatai rodo, kad PGR produktai yra specifiniai amplikonų nuo taikinio kDNR ir kad mispriming yra nereikšmingas pagal mūsų eksperimento sąlygomis.

Statyba standartinį šabloną DNR už kiekybinio įvertinimo ir palyginimo genų ekspresijos tarp penkių genų

Mes siekėme palyginti raiškos lygį dviejų chitinases ir trijų etaloninių genų toje pačioje skalėje (1 paveikslas). Šiam tikslui, mes sukurti kiekybinį realaus laiko PGR sistemą, kuriems standartinis šablonas buvo reikalinga tiksliai kiekio ribos (Figūra 3A). Mes pastatytas standartinį šabloną DNR realaus laiko PGR iki liguojant penkis tikslines fragmentus į vieną su vienu santykiu, tada tai susiūta DNR fragmentas buvo klonuotas į plazmidžių vektoriaus, kaip aprašyta Medžiagos ir metodai skirsnyje (3a paveikslas) , 913-nukleotidų ilgio DNR šablono esančius penkis kDNR fragmentai apimančias PGR tikslinio regiono plius 9-120 bazes supančių regionų ir talpino apribojimo svetaines BGL pervežimas IĮ, Xho
i Pst
I ir Ne
i (išsamią informaciją žr 3b pav.)

įteisinimas standartinės kreivės ir kiekybinių Realaus laiko PGR sistema

iš abiejų chitinases ir referencinių mRNR kiekybinis remiasi standartiniais kreives. Serijiniu būdu atskiedus standartinį DNR šablono buvo naudojami statyti standartinę kreivę, palyginti ir įvertinti realaus laiko PGR kiekybinio strategijas, kurios buvo naudojamos analizuoti penkias mRNR. Kiekvienas standartinė kreivė buvo generuojami naudojant 10 kartų serijos praskiedžiant standartinį DNR ir penkių skirtingų pradmenų porų (pav 4A-E, kairėje). Eksponentinis amplifikacija buvo palaikomas per įvairias ciklų, duoda dinaminį diapazoną septynių eilėmis (pav 4A-E, kairėje). Naudojant standartinį šabloną DNR, kuriame yra penki kDNR fragmentai, vienodais kiekiais galima priskirti visų penkių genų kiekvieno skiedimui naudoti statyti standartines kreives (pav 4A-E, dešinėje).

Norėdami išbandyti absoliučią lygybę iš kreivių, žinomas koncentracija visą kodavimo kDNR buvo išplėstos ir vėliau tiriami kaip nežinomo mėginio. Šiam testui buvo atliktas siekiant patikrinti, kad kiekvienas išbandė praskiedimo lėmė numatomą kiekį. Kaip parodyta pav 4A-E, tiesa, buvo pastebėtas lygios kiekiai kiekvienam tiriamam tirpalu, naudojamu statyti standartinę kreivę (žr S2 paveikslą). Mažos gausa nuorašai ir gausiai nuorašai kiekybinis leidžia mums patikrinti jautrumą ir patikimumą realaus laiko PGR rodo, kad mūsų realaus laiko PGR metodas siūlo didelį dinaminį diapazoną skaičiais, didelio tikslumo ir didelio jautrumo (4a- pav E dešinėje). Taigi, mūsų realaus laiko PGR metodas suteikia patikimus vertės dviejų chitinase genų ir referencinių genų toje pačioje skalėje.

išraiška Chit1 ir AMCase pelių audiniai

Jei studijuoti in vivo
reguliavimo Chit1 ir AMCase genų ekspresiją, bendras išgauti iš keturių embriono etapais ir iš įvairių suaugusiųjų audinių RNR mėginiai buvo analizuojami kiekybinio realaus laiko PGR metodu, naudojant vieną standartinį DNR (3 paveikslas). Rezultatai buvo išreikštas molekulių per 10 ng visų RNR (5 ir 6 paveikslus). Tiek Chit1 ir AMCase mRNR buvo plačiai išreikštas pelės audiniuose (5a pav ir 5b). Išvalyti audinio ypatumus buvo pastebėta išraiškos būdus abiejų chitinase mRNR. Aukšto lygio Chit1 mRNR buvo aptikta, kad pelės skrandžio (pav 5A, viršutinis panelis), o po to į akis ir plaučių. Chit1 iRNR buvo aptikta esant žemai, bet lengvai aptikti, lygių kituose audiniuose (pav 5A, mažesnė grupė). AMCase iRNR buvo daugiausia aptikta skrandį, po to pažandikaulinius liaukos (pav 5B, viršutinė plokštė), bet taip pat dalyvavo kituose audiniuose (pav 5B, mažesnė grupė).

tada palygino AMCase santykis į Chit1. Kopija skaičius kiekvienam mRNR buvo nustatoma naudojant tą patį standartinį skiedinius. Mes nustatėme, kad skrandis ir pažandikaulinius liauka daugiausia išreiškė AMCase mRNR (Paveikslas 5C, viršutinė panelė). Kiti audiniai tiriami šiame tyrime pagamino daugiau AMCase nei Chit1 ir Chit1 buvo paplitęs tik į akis (pav 5C, mažesnė grupė).

Kitas tirtų santykinį kiekybiškai originalioje pateikti 5 paveiksle duomenimis, kuris buvo išreikštas molekulių per 10 ng viso RNR, naudojant buityje genų, kaip aprašyta medžiagų ir metodų. Rezultatai parodė, kaip papildoma informacija S3 figūrą (duomenys normalizavosi GAPDH) ir S4 pav (normalizavosi beta-aktino). Tada mes išanalizavo duomenis parodyta 5 paveiksle, kurį ΔΔ Ct metodą [21], ir nurodomas kaip papildoma informacija, S5 figūrą (normalūs GAPDH) ir S6 figūrą (normalūs beta-aktino). Lyginant santykinį išraišką aptiktas šių absoliučių ir santykinių kiekybinio vertinimo metodus, nebuvo reikšmingo skirtumo tarp duomenų, išskyrus Chit1 iRNR išraiškos, kuri buvo Gausiausiai išreikštos akimis normalizavosi beta-aktino (žr 5 paveiksle, S3 pav ir S4 pav.) Panašūs rezultatai taip pat buvo gautas santykinis kiekybinio naudojant ΔΔ Ct metodą [21] (žr 5 paveiksle, S5 pav ir S6 pav.) Tačiau mes negalėjo tiesiogiai įvertinti abipusius raiškos lygius Chit1 ir AMCase kai analizuojamos ΔΔ Ct metodu.

analizė Chit1, AMCase, Pepsinogen C, GAPDH ir beta-aktino plaučių ir skrandžio audinių

Daugelis tyrimų buvo atlikti žinduolių chitinases patofiziologija plaučių audiniuose. Šiame tyrime mes parodėme, kad AMCase iRNR daugiausia išreikštas pelės skrandžio audinių (5 paveikslas). Mes taip pat palyginti ekspresijos lygį; chitinases ir orientacinės genus, naudojant kDNR, pagaminti iš plaučių ir skrandžio audiniuose 3 mėnesių amžiaus pelių (n = 5). Kiekybiniai duomenys yra parodyta 6 pav Kai Chit1 lygiai buvo nustatyti ties 1,0, santykiniai ekspresijos lygis kDNR buvo AMCase, 14; GAPDH, 196; ir β-aktino, 681 pelių plaučių audinio (6a pav.) Šis rezultatas rodo, kad plaučių audiniuose išreikšti daugiau AMCase nei Chit1, nors AMCase išraiška lygis buvo mažesnis nei dviejų namų ruošą genuose.

skrandžio audinių, kai Chit1 lygis buvo nustatytas 1,0, santykinis ekspresijos lygį buvo AMCase, 721; pepsinogen C 2261; GAPDH, 61; ir β-aktino, 127 (6B pav.) Tiek GAPDH ir beta-aktino genų yra gerai žinomas buityje genus ir constitutively išreiškė didelės koncentracijos audinius ir ląsteles. Pepsinogen C (progastricsin) yra asparto proteazės, kad veikia kaip virškinimo fermento ir yra skrandyje gaminama. Šis fermentas yra pagrindinė sudedamoji skrandžio gleivinės [23]. Sąvoka lygis AMCase buvo daug didesnis nei GAPDH ir beta-aktino ir buvo panaši į pepsinogen C lygio Šie rezultatai rodo, kad skrandžio AMCase yra pagrindinis stenograma į skrandžio gleivinę ir rodo, kad šis fermentas gali žaisti svarbu fiziologiniai vaidmenis skrandį.

Mes taip pat iš naujo išnagrinėti santykinį išraišką Chit1, AMCase ir pepsinogen C parodyta 6 pav naudojant buityje genus pagal šio metodo, kaip aprašyta aukščiau. Rezultatai parodė, kaip pagalbinės informacijos S7 figūrą (normalūs GAPDH) ir S8 figūrą (normalūs beta-aktino). Nebuvo jokio reikšmingo skirtumo tarp 6 paveiksle, S7 ir S8 pav.

Diskusijos

Ir Chit1 ir AMCase yra manoma, kad pagalba priimančiojoje gynybos nuo Chitinas, kurių sudėtyje yra patogenų [3], [ ,,,0],9]. Be to, AMCase yra efektoriaus molekulė į alerginis uždegimas. Šie chitinolytic fermentai vaidina svarbų vaidmenį alerginių kvėpavimo takų atsakymų pelės modeliai astmos patofiziologija. Palyginti mažai žinoma, tačiau, apie in vivo
tarpusavio ekspresijos lygio Chit1 ir AMCase. Iš mRNR kiekybinis gali generuoti naudingą ir biomedically susijusią informaciją. Šiame tyrime mes sukūrėme kiekybinį realaus laiko PGR sistema, galinti nustatyti iRNR lygius dviem žinduolių chitinases ir lyginant šiuos lygius su etaloninių genų naudojant tą pačią skalę. Mūsų rezultatai rodo, kad AMCase daugiausia išreikštas pelės skrandį.

Kiekybiniai realaus laiko PGR yra svarbus anksto vertindamas iRNR ir leidžia tam tikro geno interesų išraiška aptikimo molekuliniu lygmeniu , Yra daug ataskaitas apie labai mažas mRNR naudojant šią technologiją aptikti. Tačiau realaus laiko PGR nėra plačiai naudojamas, nes jis vis dar turi trūkumų kiekybiškai kelis mRNR per tą patį mastelį. Mes pastatytas standartinis DNR šablono, kurį sudaro penki kDNR fragmentai (kiekvienas ~200 bazių ilgio). Šie fragmentai įtraukti fragmentai dvi chitinases, vieną persekiotoją ir dviejų namų ruošą genų ir buvo sujungtos į "vienas su vienu santykis (3a pav.) GAPDH ir β-aktino, dažniausiai naudojami buities genai, buvo įtraukti kaip vidaus kontrolės ir prašymų PGR. Be to, mes naudojamas pepsinogen C kaip žymėtaisiais geno, nes jis yra pagamintas aukšto lygio, kad skrandžio [23]. Šis metodas leido absoliučią kiekybiškai apie Chit1 ir AMCase mRNR molekulės skaičius, taip pat nuoroda mRNR molekulės skaičių, už 10 ng visų RNR (mol /10 ng) (5 paveiksle ir 6 pav). Be to, mes galime išnagrinėti santykinį kiekybiškai įvertinti Chit1 ir AMCase mRNR lygius naudojant dvi buityje genus, GAPDH ir β-aktino (pagalbinė informacija S3 paveiksle S4 pav.)

Santykinis kiekybinis yra lengviau atlikti nei absoliutaus kiekybinio todėl, kad dėl kalibravimo kreivė nėra būtinas. Santykinis kiekybinio, iRNR lygiai dominančio geno lyginami nuo tų namų ruošą genų [21]. Tačiau, tai kiekybinis metodas yra nesėkmingas palyginti skirtingų genų transkriptų lygius tą pačią skalę. Nors mūsų metodas reikalauja daug priemonių, susijusių su standartiniu DNR statybos ir tvirtinimo procesų, šis metodas gali suteikti genų ekspresijos duomenis, kurie yra tiesiogiai palyginami tarp genų (5 paveiksle ir 6 pav.) Mūsų realaus laiko PGR numatyta didelį dinaminį diapazoną kiekybinio įvertinimo ir didelio jautrumo, ir mažai gausa nuorašai kiekybinis leido patvirtinti jautrumą ir patikimumą mūsų metodas (4 paveikslas). Šis metodas yra labai gerai tinka prie kiekybinio ir palyginimo mRNR lygių keliose genų, naudojant tą patį mastelį. Mūsų dabartinis metodas yra taikomas biomedicininės inžinerijos, taip pat klinikinių ir praktinių reikmėms.

šiame tyrime, mes nustatėme, kad AMCase iRNR yra sintetinamas ne itin aukšto lygio pelių skrandžio, palyginti su iš namų ruošą genų lygių (5 ir 6 paveikslus). Iš AMCase mRNR lygis yra panašus į pepsinogen C (progastricsin) mRNR, pagrindinis komponentas skrandžio gleivinės skrandyje (6B pav.) Be to į skrandį, kad pažandikaulinius liaukos taip pat buvo nustatyta, kad išreikšti didelius kiekius AMCase (5 pav). Kaip sintezės žinduolių chitinase mRNR, tiek skrandžio ir pažandikaulinius liaukos yra laikomas žinomiausių audinių gamybai milžinišką AMCase į pele.

Druskos rūgštis išsiskiria į skrandį, kurti rūgštinės sąlygas baltymų virškinimo pepsino maždaug pH 2 [23], [24]. Pelės AMCase rodo didelį rūgščių stabilumą ir aktyviausi esant pH 2.0, kuri išskiria jį iš kitų pelės fermentų [8]. Neįprastas pH stabilumas ir priklausomybė nuo pelių AMCase apie rūgštinėmis sąlygomis galima efektyviai virškinimą chitinous medžiagų pagal rūgščioje terpėje. Pastaba, kad AMCase daugiausia išreikštas skrandžio kiekis į jo galimą funkcijos maisto perdirbimo. Laukiniai pelių valgyti chitino, kurių sudėtyje yra maisto produktų, tokių kaip vabzdžių, o laikomi laboratorijoje pelių valgyti dirbtines mitybos, kurių sudėtyje yra sausos alaus mielės, kuriame taip pat yra Chitinas į ląstelės sienelės. Taigi, AMCase gali funkcionuoti kaip virškinimo fermento, kuris skaido polimerinį Chitinas skrandžio turinį.

aukščiausio lygio Chit1 taip pat buvo išreikštas pelės skrandį. Tačiau Chit1 išraiška lygis skrandyje buvo 1/721, kad iš AMCase ekspresijos lygį ir buvo mažesnis nei ekspresijos lygio dviejų namų ruošą genų, GAPDH ir β-aktino (6a pav.) Be to, Chit1 neturi jokių chitinolytic veiklą tuo skrandžio sulčių pH, kuris yra aplink pH [5] 2, [11]. Ji buvo parodyta, kad Chit1 gaminamas vietose šalia-neutralaus pH, pavyzdžiui, ne-liaukų dalį skrandžio ir plonosios žarnos [25]. Taigi, Chit1 neprisideda prie chitinase veiklą pelės skrandį.

Nors AMCase išreiškiama daugiausia skrandžio ir pažandikaulinius liaukų, visi kiti audiniai tiriami šiame tyrime išreiškė mažas, tačiau galima aptikti, lygius Chit1 ir AMCase , Sąvoka lygiai Chit1 ir AMCase buvo mažesnis nei iš namų ruošą genų šių audinių. Chit1 rodo platų optimaliam terpės pH maždaug pH 5 [5], kadangi pagrindinis optimalus pH AMCase pH 2 ir antrinė pH optimalus yra, esant pH 4-7, su AMCase išlaikant mažiau nei 30% savo veiklos, esant pH 2 į šis pH diapazonas [8]. Tiek Chit1 ir AMCase virškinti natūralų Chitinas ir chitozano per endo-chitinase veiklos ir gaminti chitobiose [8], [26]. Nors AMCase yra dominuojanti virš Chit1 daugelyje pelės audiniuose, ten negali būti jokių reikšmingų skirtumų jų chitinolytic veiklos pelės audiniuose.

Daugiau AMCase iRNR nei Chit1 mRNR buvo stebimas daugelyje pelės audiniuose, išskyrus akis. Mūsų rezultatai taip pat rodo, kad genų ekspresija Chit1 gali būti Ewolucyjnie reguliuojama, o tai rodo, kad jis vaidina svarbų vaidmenį ontogenezie. Studijavimas apie žinduolių chitinases raiškos reguliavimas gali duoti įžvalgas fiziologinių funkcijų šių fermentų. Išsamus apibūdintos promotoriaus regionuose Chit1 ir AMCase genų, taip pat nustatymas, , CIS UAB - ir TRANS
-acting veiksniai turės suprasti selektyvus šių fermentų ekspresiją <. Br>

Nors žinduoliai negamina chitino arba chitino sintazę, jie yra nuolat veikiami šio polimero per sąlyčio su Chitinas, kurių sudėtyje yra parazitų ir patogenų. Už žinduolių chitinases substratas yra turbūt aplinkos Chitinas, pavyzdžiui, rasti grybų ar parazitinių nematodų. Į plaučius, abu fermentai gali veikti kaip dalis priimančiosios gynybos mechanizmo su Chitinas, kurių sudėtyje yra patogenų, pavyzdžiui, aplinkos pelėsių ir erkių, kurios sukelia kvėpavimo takų alergijos.

• PLoS ONE: analizė Skrandžio ir žarnyno Microbiomes Rytų austrė (Crassostrea virginica) Pakrančių Luizianoje, JAV
• PLoS ONE: fibroblastų augimo faktorius 10-fibroblastų augimo faktoriaus receptoriaus 2b keisdamas Signalizacijos nereikia Suaugusiųjų Glandular Skrandžio Homeostasis