PLoS ONE: Chitinase mRNA nivåer av kvantitativ PCR Bruke Single Standard DNA: Surt Pattedyr Chitinase er en stor transkripsjon i Mouse Stomach

Abstract

kitinaser hydrolysere β-1-4 glykosidbindinger av kitin, et større strukturell komponent av sopp, krepsdyr og insekter. Selv om pattedyr ikke produserer kitin eller dets syntase, uttrykker de to aktive kitinaser, chitotriosidase (Chit1) og syrlig pattedyr kitinase (AMCase). Disse pattedyr kitinaser har tiltrukket seg stor oppmerksomhet på grunn av deres økte ekspresjon i individer med en rekke patologiske tilstander, herunder Gauchers sykdom, Alzheimers sykdom og astma. Imidlertid gjenstår bidrag av disse enzymene til patofysiologien av disse sykdommene som skal bestemmes. Kvantifisering av Chit1 og AMCase mRNA nivåer og sammenligning av disse nivåene med nivåene av kjente referanse gener kan generere nyttig og biomedically relevant informasjon. I begynnelsen har vi etablert en kvantitativ real-time PCR system som bruker standard DNA produsert ved å ligere cDNA fragmenter av målgener. Dette systemet gjorde oss i stand til å kvantifisere og sammenligne uttrykket nivåer av kitinaser og referanse gener på samme skala. Vi fant at AMCase mRNA syntetisert ved usedvanlig høye nivåer i mus magen. Nivået av dette mRNA i mus magen var 7- til 10-ganger høyere enn nivåene av husholdningsgener og var sammenlignbare med at nivået av mRNA for pepsinogen C (progastricsin), en hovedkomponent av mageslimhinnen. Således er AMCase mRNA-transkript i en større mus magesekken, noe som tyder på at AMCase fungerer som en fordøyelseskanal enzym som bryter ned polymere kitin og som del av vertens forsvar mot chitin-inneholdende patogener i mageinnholdet. Vår metodikk er aktuelt for kvantifisering av mRNA for flere gener på tvers av flere eksemplarer som bruker den samme skalaen

Citation. Ohno M, Tsuda K, Sakaguchi M, Sugahara Y, Oyama F (2012) Chitinase mRNA nivåer ved Quantitative PCR Bruke Single Standard DNA: Surt pattedyr Chitinase er en stor transkripsjon i Mouse magen. PLoS One 7 (11): e50381. doi: 10,1371 /journal.pone.0050381

Redaktør: Dominik Hartl, Universitetet i Tübingen, Tyskland

mottatt: 6 august 2012; Godkjent: 19 oktober 2012; Publisert: 21.11.2012

Copyright: © 2012 Ohno et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av prosjektstipend fra Research Institute of Science and Technology, Kogakuin University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Chitin, en lineær polymer av β-1-4-bundne N
-acetyl-D-glukosamin, er det andre mest tallrike polysakkarid som finnes i naturen. Det fungerer som en viktig strukturell komponent av sopp, krepsdyr og insekter, men er ikke funnet hos pattedyr [1]. Kitinaser hydrolysere β-1-4 glykosidbindinger av kitin polymer. Selv om pattedyr ikke produserer kitin eller dets syntase, uttrykker de to aktive kitinaser, chitotriosidase (Chit1) og syrlig pattedyr kitinase (AMCase) [2], [3].

Chit1 nivå er markert forhøyede i plasma av pasienter med Gauchers sykdom, en autosomal recessiv lysosomal lagringsforstyrrelse [4]. Chit1 var den første pattedyr kitinase som skal renses, og klonet [5], [6]. En recessivt nedarvet mangel på Chit1 aktivitet er ofte observert hos kaukasiere [7]. AMCase ble oppdaget på grunn av sin kompenserende rolle og ble oppkalt etter sin sure pH optimal [8]. Disse pattedyr kitinaser ansees som en del av vertens forsvarsmekanisme mot chitin-inneholdende patogener og parasitter [3], [9].

Både Chit1 og AMCase er utskilte proteiner med molekylvekter på omtrent 50 kDa. Begge proteiner inneholder en N-terminal katalytisk domene, en hengselsregion, og en C-terminal kitin-bindende domene [6], [8]. Mus AMCase viser sekvenshomologi Chit1, med en identitet på 52% og en likhet på 60% [10]. Til tross for disse strukturelle likheter, disse enzymene signifikant forskjellige med hensyn til deres enzymatiske oppførsel ved sur pH. AMCase viser en markert pH-optimum ved pH 2, og et mindre tydelig optimal ved pH 4-7 [8], mens Chit1 viser bare et bredt pH-optimum på omkring pH 5 [5], [11].

Mammalian kitinaser har vakt betydelig oppmerksomhet på grunn av deres økt uttrykk hos personer med ulike patologiske tilstander. Chit1 er økt i pasienter med Gauchers sykdom [4], kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) [12], og Alzheimers sykdom [13] og hos røykere [14]. AMCase uttrykk og aktivitet er også oppregulert i løpet av allergiske luftveisresponser i musemodeller av astma [15]. I tillegg induserer polymer kitin AMCase uttrykk og rekruttering av immunceller i forbindelse med allergi og astma [16]. Disse resultatene antyder sterkt at kitinolytiske enzymer spiller viktige roller i mange patofysiologiske forhold. Det gjenstår imidlertid bidraget av disse enzymene til patofysiologien av disse sykdommene skal fastsettes.

Kvantifisering av Chit1 og AMCase mRNA nivåer og sammenligning av disse nivåene med nivåene av kjente referanse gener er viktige trinnene i å få innsikt i in vivo
regulering av pattedyr kitinaser. Nylig har sanntids RT-PCR blitt anvendt for å kvantifisere mRNA-nivåer i mange genuttrykkstudier [17] - [20], fordi denne metoden er følsom nok til å detektere mRNA fra til og med en enkelt celle. Real-time PCR innebærer vanligvis normaliseringen av uttrykket nivåer av genet av interesse med de av husholdningsgener som er tenkt å være konsistent uttrykt i alle prøvene. Imidlertid svikter denne kvantifisering metode for å sammenligne nivåene av de forskjellige gentranskriptene i samme målestokk.

I den foreliggende undersøkelse har vi utviklet en kvantitativ sanntids RT-PCR system som bruker standard DNA produsert ved ligering av cDNA fragmenter av målgener. Dette systemet gjorde oss i stand til å kvantifisere og sammenligne uttrykket nivåer av kitinaser og referanse gener på samme skala. Våre resultater tyder på at AMCase er en vesentlig transkripsjon i mus magen, noe som tyder på at de tilsvarende protein virker som en fordøyelseskanal enzym som bryter ned chitin-inneholdende matvarer og som del av vertens forsvar mot chitin-inneholdende patogener i mageinnholdet.

Materialer og metoder

RNA, RNA Isolation og cDNA Forberedelse

mus Total RNA Master Panel (Clontech Laboratories) ble brukt for å undersøke vev fordeling av vitnemål. Vi analyserte fire forskjellige embryonale stadier og åtte voksne vev. I tillegg ble RNA isolert fra lungene og mager av 3 måneder gamle hannmus. C57BL /6J mus (CLEAR Japan) ble avlet ved Riken Brain Science Institute Animal Facility. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med de institusjonelle retningslinjer. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Riken Brain Science Institute (Godkjenning nr H19-2B013). Alle operasjoner ble utført ved å bruke dietyleter som et bedøvelsesmiddel, og alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse. Disse vev for mRNA forberedelse ble gitt av legene. Miyazaki og Nukina ved Riken Brain Science Institute. Totalt RNA ble fremstilt fra lungene og magene ved hjelp av TRIzol Reagens (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. For å fjerne spor av forurensende genomisk DNA, ble de totale RNA prøver behandlet med RQ1 RNase-Free DNase (Promega) i henhold til produsentens anbefalte protokoll. Konsentrasjonene av nukleinsyrene ble bestemt ved å måle absorbansen ved 260 nm ved anvendelse av en BioPhotometer Plus (Eppendorf). Hver av de totale RNA-prøver (3 ug) ble utsatt for revers transkripsjon med tilfeldige heksamerer som primere. Reaksjonsblandingen (15 ul) inneholdt enzym-buffer [50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, og 3 mM MgCl _{2], 100 ng av tilfeldige heksamerer, 10 mM ditiotreitol og 0,5 mM deoksynukleotid trifosfater (dNTP). Etter oppvarming av oppløsningen til 60 ° C i 5 minutter og inkubering av blandingen ved 37 ° C i 5 minutter, 200 U rekombinant murin leukemivirus revers transkriptase (Invitrogen) ble tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 37 ° C i 45 min . Revers transkripsjon ble avsluttet ved oppvarming til 95 ° C i 5 min.}

Real-time PCR

Grunning for real-time RT-PCR ble utformet basert på Primer Express programvare (Applied Biosystems) og ble syntetisert kommersielt (Sigma-Genosys, Sigma-Aldrich). PCR-reaksjonene ble utført i et sluttvolum på 13 pl inneholdende 2 x SYBR grønn Master Mix (Brilliant II SYBR grønn QPCR Master Mix, Agilent), 2,7 ng av mus cDNA eller hensiktsmessige fortynninger av de eksterne standarder (se nedenfor), og hensiktsmessige konsentrasjoner av primere for kitinaser, pepsinogen C, glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) eller β-actin. Standard sanntid PCR-betingelser for systemet (Mx3005P, Agilent) ble anvendt: en innledende denaturering og polymerase aktiveringstrinn i 10 minutter ved 95 ° C, etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 1 minutt, 55 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 1 min. Melting kurver ble generert etter forsterkning. PCR-produktene ble underkastet elektroforese på en 10% polyakrylamidgel og analysert ved anvendelse av Luminescent bildeanalysatoren (Imagequant LAS 4000, GE Healthcare). PCR Løsningen ble behandlet med ExoSAP-IT (USB Products) i henhold til produsentens instruksjoner for å eliminere unincorporated primere og dNTP, og produktene ble sekvensert ved bruk av ABI PRISM Big-Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit og en 3130 Genetic Analyzer ( Applied Biosystems). Nukleotidsekvensene er valgt for real-time PCR primere er vist i tabell S1.

Byggingen av Standard DNA

standard mal cDNA (913 baser) for kvantifisering av transkripsjonsnivåer ved sanntids-PCR ble konstruert som følger. CDNA-fragmentene som dekker det PCR-mål-region pluss 9-120 baser av de flankerende regioner av AMCase, Chit1, pepsinogen C, GAPDH, og β-aktin ble amplifisert fra mus mage-cDNA ved PCR ved anvendelse KOD Plus DNA-polymerase (Toyobo) og oligonukleotidene primer som inneholder restriksjonssetene av Bgl
II, Xho
jeg, Pst
jeg, eller Ikke
jeg (på 5'- og 3 ' - slutter) i henhold til produsentens protokoll. De forover og revers primere er oppført i tabell S2. PCR-produktene ble renset ved hjelp av veiviseren SV Gel og PCR Clean-Up System (Promega) og deretter kuttet med de tilsvarende restriksjonsenzymer. DNA-fragmentene ble renset ved hjelp av agarosegel-elektroforese og rensesystemer og deretter bundet sammen med T4 DNA ligase (Toyobo). De ligerte fragmenter ble amplifisert ved hjelp av forover primer 5'-GTGGATTCTGTGCCGACAAAGCAGATGGCC-3 'og reversprimeren 5'-TGGGTACATGGTGGTACCACCAGACAGCAC-3' med KOD Plus DNA-polymerase. 3'-dA ble tilsatt til den amplifiserte DNA ved hjelp av Takara Taq-HS (Takara Bio), og produktet ble renset ved gel-elektroforese som beskrevet over. Det resulterende DNA ble klonet inn i pGEM-T Easy vektor (Promega) gjennom TA kloning, i henhold til produsentens instruksjoner. Nukleotidsekvensen av det resulterende plasmid ble bekreftet ved sekvensering. Det lineariserte multigen-inneholdende DNA-fragmentet ble fremstilt ved reamplification fra plasmid-DNA med de samme primerne ved PCR ved anvendelse KOD Plus DNA-polymerase. Fragmentene ble renset og kvantifisert som beskrevet ovenfor, og brukes som standard DNA.

Utarbeidelse av fem cDNA dekker hele Coding omegn

For å validere vår absolutte sanntids PCR-metoden, utarbeidet vi fullt kodende cDNA ved PCR ved anvendelse av primer settene som er oppført i Tabell S3. Fem cDNA som dekker hele den kodende regioner av to kitinaser (Chit1 og AMCase) og referanse gener (GAPDH, p-aktin og pepsinogen C) ble amplifisert ved PCR fra mus mage-cDNA ved hjelp av KOD Plus DNA-polymerase og ble subklonet inn i pGEM-T enkel vektor gjennom TA kloning, som beskrevet ovenfor. Sekvensen av cDNA ble verifisert ved sekvensering, som beskrevet i figur S1. De subklonet fragmentene ble reamplifisert fra plasmid-DNA med de samme primerne og ble deretter anvendt som hele det kodende område cDNA.

standardkurver

Den molare konsentrasjon av multigen-inneholdende DNA standard ble beregnet på grunnlag av konsentrasjonen og molekylvekten. Seriefortynninger ble fremstilt ved å starte med standard mal konsentrasjon, noe som ga en Ct på ​​omtrent 13 (Ct = brøkterskelsyklus verdi). Standard DNA ble underkastet 10-gangers seriefortynninger, som strekker seg fra 10 ^{0 to 10 7-molekyler, og aliquoter ble holdt frosset ved -20 ° C inntil bruk.}

Kvantifisering av mRNA real-time PCR ved hjelp av standardkurver eller ΔΔ Ct Method

hver prøve ble forsterket i tre eksemplarer, og hver forsøket ble gjentatt minst to ganger. Ved hjelp av standardkurven, ble antall Chit1, AMCase, GAPDH, β-aktin, og pepsinogen C mRNA molekyler ekstrapolert automatisk ved hjelp av MxPro QPCR Software versjon 4,10 (Agilent). Alle verdier ble uttrykt som molekyler pr 10 ng av total RNA. I noen tilfeller, ble verdiene normalisert mot nivået av GAPDH eller β-aktin-mRNA.

For å evaluere vår nåværende metode, vi også anvendes den ΔΔ Ct metoden [21], som krever måling av syklusen terskel (CT) av målgener. Ct-verdier ble beregnet ved MxPro QPCR programvare ved hjelp av GAPDH eller β-actin som en normalizer.

Resultater

Etablering av Real-time PCR-analyse

Etablering av pålitelig metode for måling av uttrykket av kitinase transkripsjoner er et viktig skritt i å undersøke betydningen av muse kitinaser. Real-time RT-PCR er i dag, den mest sensitive kvantitative metode for påvisning av både lav overflod mRNA og rikelig transkripsjoner. Vi først sammenlignet genuttrykk nivåer av Chit1 og AMCase gener (se figur 1). For å evaluere kitinase nivåene, har vi brukt to husholdningsgener, GAPDH og β-aktin, som referanse gener fordi de er konstitutivt uttrykt i høye nivåer i de fleste vev og celler [22]. I tillegg valgte vi pepsinogen C (også kjent som progastricsin) som en referanse gen i magen. Pepsinogen C er en asparagin protease som fungerer som et fordøyelsesenzym og er produsert i magen. Dette enzymet utgjør en hovedkomponent i den gastriske mukosa [23]. Ved hjelp av disse tre referanse gener, vurderte vi genuttrykket av Chit1 og AMCase i mus vev (figur 1).

Vi først utviklet flere sett med primere for kvantitativ PCR og evaluert deres egnethet basert på om de ga enkeltprodukter , noe som reflekteres ved en enkelt smeltetemperatur (Tm) og et enkelt bånd på en 10% polyakrylamidgel. Nukleotidsekvensene til produktene ble også bekreftet. For å undersøke spesifisiteten av primerne, ble hver av PCR-produktene amplifisert i henhold til sanntids-PCR-betingelser ved å bruke en mus vev cDNA-blanding bestående av vev fra fire embryonale stadier og åtte voksent vev og ble undersøkt i kombinasjon med ulike metoder. Som vist på figur 2A-E, bare en topp fremkom i dissosiasjon kurver for Chit1 (Tm = 79,7 ° C), AMCase (Tm = 79,1 ° C), GAPDH (Tm = 81,4 ° C), β-aktin (Tm = 82,0 ° C) og pepsinogen C (Tm = 81,4 ° C). Ved slutten av PCR, analyserte vi produktene på en 10% polyakrylamidgel. Gel elektroforese viste klare enkle bånd på de forventede størrelser av Chit1 (69 bp), AMCase (81 bp), GAPDH (77 bp), β-aktin (71 bp) og pepsinogen C (82 bp) (figur 2F). Nukleotidsekvensene av PCR-produktene ble bestemt direkte som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Vi har bekreftet at PCR-produktene ble amplifisert fra mål-cDNA (se figur 3B). Disse resultatene indikerer at PCR-produktene er bestemte amplikonene fra mål-cDNA og det mispriming er neglisjerbar i henhold til våre forsøksbetingelser.

Konstruksjon av standard templat-DNA for kvantifisering og Sammenligning av Gene Expression mellom fem gener

Vi har søkt å sammenligne uttrykket nivåer av to kitinaser og tre referanse gener på samme skala (figur 1). For dette formål har vi satt opp en kvantitativ real-time PCR system som en standard mal var nødvendig for nøyaktig kvantifisering (figur 3A). Vi har konstruert en standard templat DNA for real-time PCR ved ligering av de fem puls fragmentene i en en-til-en-forhold, og da dette ligerte DNA-fragment ble klonet inn i plasmidvektoren som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder (figur 3A) . Den 913-nukleotid lange mal DNA inneholdt fem cDNA fragmenter dekker PCR-målområdet pluss 9-120 baser av flankerende områder og inneholdt restriksjonssetene av Bgl
II, Xho
jeg Pst
jeg og Ikke
i (se detaljer i Figur 3B).

Validering av standardkurve og kvantitativ real-time PCR System

kvantifiseringen av både kitinaser og referanse mRNAer er avhengig av standardkurver. Serielle fortynninger av standard templat-DNA ble brukt til å konstruere en standardkurve for å sammenligne og evaluere den sanntids RT-PCR kvantifisering strategier som ble brukt til å analysere de fem mRNA. Hvert standardkurve ble generert ved bruk av 10-gangers seriefortynninger av standard DNA, og de fem forskjellige primerparene (figur 4A-E, venstre). Eksponentiell amplifisering ble opprettholdt over et bredt område av sykluser, noe som ga et dynamisk område på syv størrelsesordener (figur 4A-E, venstre). Ved å bruke standard mal DNA som inneholder de fem cDNA fragmenter, kan like mengder tilordnes alle fem gener i hver fortynning bruk for å konstruere standardkurver (Figur 4A-E, høyre).

For å teste den absolutte likestilling av kurvene, ble en kjent konsentrasjon av den fullstendige kodende cDNA amplifisert og deretter analysert som en ukjent prøve. Denne analysen ble utført for å kontrollere at hver testet fortynning resulterte i den forventede mengde. Som vist i figur 4A-E, rett, ble like mengder observert for hver testet for fortynning anvendt for å konstruere standardkurven (se fig S2). Kvantifisering av lav overflod utskrifter og rikelig transkripsjoner tillater oss å validere følsomhet og pålitelighet real-time PCR, noe som indikerer at vår real-time PCR metoden gir et stort dynamisk område på kvantifisering, høy nøyaktighet og høy følsomhet (figur 4Å E, høyre). Dermed gir vår real-time PCR-metoden pålitelige verdier for to kitinase gener og for referanse gener på samme skala.

Uttrykk for Chit1 og AMCase i Muse Vev

For å studere in vivo
regulering av Chit1 og AMCase genekspresjon, total RNA prøver ekstrahert fra fire embryonale stadier og fra forskjellige voksent vev, ble analysert med en kvantitativ real-time PCR-analyse ved hjelp av enkel standard DNA (figur 3). Resultatene ble uttrykt som molekyler pr 10 ng av total RNA (figur 5 og figur 6). Både Chit1 og AMCase mRNA ble allment uttrykt i musevev (figur 5A og 5B). Klare vev særegen ble observert i uttrykk mønstre av begge kitinase mRNA. Høye nivåer av Chit1 mRNA ble detektert i mus magesekken (figur 5A, øvre panel), etterfulgt av øynene og lunge. Chit1 mRNA ble funnet i lave, men lett påvisbare, nivåer i andre vev (figur 5A, lavere panel). AMCase mRNA ble hovedsakelig funnet i magesekken, etterfulgt av kjertler under pakkboksen (figur 5B, øvre panel), men var også til stede i andre vev (figur 5B, nedre panel).

Vi deretter sammen forholdene mellom AMCase til Chit1. Kopiantallet av hvert mRNA ble bestemt ved å bruke de samme standard fortynninger. Vi fant ut at magen og kjertler under kjertelen overveiende uttrykt AMCase mRNA (figur 5C, øvre panel). De andre undersøkte vev i denne studien produsert mer AMCase enn Chit1, og Chit1 var utbredt bare i øynene (figur 5C, lavere panel).

Vi neste undersøkte den relative kvantifiseringen i de opprinnelige dataene som er presentert i figur 5, som ble uttrykt som molekyler pr 10 ng av total-RNA ved bruk av husholdningsgener som beskrevet i Materialer og metoder. Resultatene er vist som tilleggsinformasjon i fig S3 (data ble normalisert ved GAPDH) og fig S4 (normalisert ved β-aktin). Deretter, analyserte vi dataene vist i figur 5 ved ΔΔ Ct metoden [21] og er vist som tilleggsinformasjon i fig S5 (normalisert ved GAPDH) og fig S6 (normalisert ved β-aktin). Når man sammenligner den relative uttrykk oppdaget av dagens absolutte og relative kvantifisering metoder, var det ingen signifikant forskjell mellom data, bortsett fra for Chit1 mRNA uttrykk, som var mest rikelig uttrykt i øynene når normalisert ved β-aktin (se Figur 5, Figur S3 og Figur S4). Lignende resultater ble også oppnådd ved relativ kvantifisering hjelp av ΔΔ Ct metoden [21] (se figur 5, Figur S5 og S6 figur). Vi kan imidlertid ikke direkte vurdere gjensidig uttrykk nivåer av Chit1 og AMCase når analysert ved ΔΔ Ct metoden.

Analyse av Chit1, AMCase, pepsinogen C, GAPDH, og β-aktin i lunge og mage Vev

Mange studier har blitt utført på patofysiologien av pattedyr kitinaser i lungevev. I denne studien viste vi at AMCase mRNA uttrykkes hovedsakelig i mus magen vev (figur 5). Vi har også sammenlignet uttrykket nivåer av kitinaser og referansegener ved hjelp av cDNA fremstilt fra lunge- og mage vev av 3-måneder gamle mus (n = 5). De kvantitative data er vist i figur 6. Når Chit1 nivåer ble satt til 1,0, den relative ekspresjonsnivåer av cDNA var AMCase, 14; GAPDH, 196; og β-aktin, 681 i muselungevevet (figur 6A). Dette resultatet indikerer at lungevev uttrykke mer enn AMCase Chit1, selv om det AMCase ekspresjonsnivået var lavere enn for de to husholdningsgener.

i mage vev, da Chit1 nivå ble satt til 1,0, den relative ekspresjonsnivåer var AMCase, 721; pepsinogen C, 2261; GAPDH, 61; og β-aktin, 127 (figur 6B). Både GAPDH og p-aktin-genene er velkjente husholdningsgener, og er konstitutivt uttrykt i høye nivåer i de fleste vev og celler. Pepsinogen C (progastricsin) er et asparagin protease som fungerer som et fordøyelsesenzym og er produsert i magen. Dette enzymet er en viktig komponent i mageslimhinnen [23]. Ekspresjonsnivået av AMCase var mye høyere enn de til GAPDH og β-aktin og var sammenlignbare med nivået av pepsinogen C. Disse resultatene indikerer at mage AMCase er en vesentlig transkripsjon i den gastriske slimhinne, og tyder på at dette enzymet er sannsynlig å spille viktige fysiologiske roller i magen.

Vi har også re-undersøkt relative uttrykk for Chit1, AMCase og pepsinogen C vist i figur 6 ved hjelp av husholdningsgener ved foreliggende fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor. Resultatene er vist som tilleggsinformasjon i fig S7 (normalisert ved GAPDH) og fig S8 (normalisert ved β-aktin). Det var ingen signifikant forskjell mellom Figur 6, Figur S7 og Figur S8.

Diskusjoner

Både Chit1 og AMCase er tenkt å hjelpe til verten forsvar mot kitin-holdige patogener [3], [ ,,,0],9]. I tillegg er AMCase et effektor-molekyl i allergisk inflammasjon. Disse kitinolytiske enzymer spiller en viktig rolle i patofysiologien av allergiske luftveisresponser i musemodeller av astma. Relativt lite er kjent, men om de in vivo
gjensidig uttrykk nivåer av Chit1 og AMCase. Kvantifiseringen av mRNA kan generere nyttig og biomedically relevant informasjon. I denne studien ble etablert vi en kvantitativ real-time PCR system i stand til å bestemme mRNA-nivåene av to pattedyr kitinaser og til å sammenlikne disse nivåene med de fra referanse gener ved å bruke den samme målestokk. Våre resultater tyder på at AMCase uttrykkes hovedsakelig i mus magen.

Kvantitativ sanntids RT-PCR representerer et viktig fremskritt i å kvantifisere mRNA og tillater påvisning av ekspresjonen av et spesielt gen av interesse på molekylært nivå . Det er mange rapporter om påvisning av ekstremt lave nivåer av mRNA ved bruk av denne teknologien. Imidlertid er sanntids RT-PCR ikke er en mye brukt fordi det fortsatt har begrensninger i å kvantifisere flere mRNA ved å bruke den samme målestokk. Vi har konstruert en standard templat-DNA som omfatter fem cDNA-fragmenter (hver rundt 200 baser lang). Disse fragmentene inkludert fragmenter for to kitinaser, en markør og to housekeeping gener og ble kombinert i en-til-en-forhold (figur 3A). GAPDH og β-aktin, de mest brukte husholdningsgener, ble inkludert som internkontroll og referanser for PCR forsterkning. I tillegg brukte vi pepsinogen C som et markør-gen, fordi det er produsert ved et høyt nivå i magen [23]. Denne metoden tillot absolutt kvantifisering av antallet Chit1 og AMCase mRNA molekyler, så vel som antall referanse mRNA molekyler, pr 10 ng av total RNA (mol /10 ng) (figur 5 og figur 6). Videre kan vi undersøke relativ kvantifisering av Chit1 og AMCase mRNA nivåer ved hjelp av to housekeeping gener, GAPDH og β-aktin (Støtte Informasjon Figur S3 og figur S4).

Relativ kvantifisering er lettere å utføre enn absolutt kvantifisering fordi en kalibrerings~~POS=TRUNC kurven~~POS=HEADCOMP er ikke nødvendig. I relativ kvantifisering, blir mRNA-nivåer av genet av interesse i forhold fra de av husholdningsgener [21]. Imidlertid svikter denne kvantifisering metode for å sammenligne nivåene av de forskjellige gentranskriptene i samme målestokk. Selv om foreliggende fremgangsmåte krever flere trinn i forbindelse med byggingen av standard DNA og med validerings prosesser, kan denne fremgangsmåte gi genekspresjon data som er direkte sammenlignbare mellom gener (figur 5 og figur 6). Vår real-time PCR gitt et stort dynamisk område for mengdebestemmelse og høy følsomhet, og kvantifisering av lav-overflod transkripter tillot oss å validere følsomheten og påliteligheten av vår metode (figur 4). Denne teknikken er svært godt egnet til kvantifisering og sammenligning av mRNA nivåer på tvers av flere gener som bruker den samme skalaen. Vår nåværende metoden gjelder for biomedisinsk engineering samt kliniske og praktiske bruksområder.

I denne undersøkelsen fant vi at AMCase mRNA er syntetisert på ekstraordinært høye nivåer i musen magen i forhold til nivåene av husholdningsgener (figur 5 og figur 6). Nivået av AMCase mRNA er sammenlignbar med pepsinogen C (progastricsin) mRNA, en hovedkomponent av den gastriske slimhinne i magesekken (figur 6B). I tillegg til magen, ble kjertler under kjeven også funnet å uttrykke store mengder AMCase (figur 5). Som for syntetisering av pattedyr kitinase mRNA, blir både mage og kjertler under kjeven betraktes som bemerkelsesverdig vev for fremstilling av enorm mengde AMCase i mus.

saltsyre utskilles i magen, noe som skaper sure betingelser for fordøyelse av proteiner med pepsin ved omtrent pH 2 [23], [24]. Mus AMCase viser dyp syre stabilitet og er mest aktiv ved pH 2,0, som skiller den fra andre muse enzymer [8]. Den uvanlige pH-stabilitet og avhengighet av musen AMCase på sure betingelser tillater effektiv fordøyelse av chitinous materialer under sure betingelser. Observasjonen at AMCase hovedsakelig uttrykt i magen poeng på en mulig funksjon i matvareindustrien. Vill mus spise chitin-inneholdende matvarer som insekter, mens musene holdt i laboratoriet spise kunstig diett inneholdende tørket bryggeribek gjær, som også inneholder kitin i celleveggen. Dermed kan AMCase fungere som en fordøyelseskanal enzym som bryter ned polymer kitin i mageinnholdet.

Det høyeste nivået av Chit1 ble også uttrykt i musen magen. Imidlertid Chit1 ekspresjonsnivået i magen var 1/721 den for AMCase ekspresjonsnivået og var lavere enn uttrykket nivåer av to husholdningsgener, GAPDH og β-aktin (figur 6A). I tillegg vil Chit1 ikke har noen kitinolytiske aktivitet ved pH-verdien til magesafter, som er rundt pH 2, [5], [11]. Det har vist seg at Chit1 produseres på steder av nær nøytral pH-verdi, som for eksempel den ikke-kjertel del av magesekken og tynntarmen [25]. Dermed gjør Chit1 ikke bidrar til chitinase-aktivitet i mus magen.

Selv om AMCase uttrykkes hovedsakelig i magen og kjertler under kjeven, alle andre undersøkte vev i denne studien uttrykte lave, men påviselige nivåer av Chit1 og AMCase . Uttrykket nivåer av Chit1 og AMCase var lavere enn de av housekeeping gener i disse vev. Chit1 viser et bredt pH-optimum på omkring pH 5 [5], mens den primære optimale pH-verdi på AMCase er pH 2, og den sekundære pH-optimum ligger ved pH 4-7, med AMCase beholder mindre enn 30% av sin aktivitet ved pH 2 i dette pH-område [8]. Både Chit1 og AMCase fordøye naturlig kitin og kitosan via endo-chitinase-aktivitet og produserer kitobiose [8], [26]. Selv AMCase er dominant over Chit1 i mange mus vev, kan det ikke være noen vesentlige forskjeller i deres kitinolytiske aktivitet i mus vev.

Mer AMCase mRNA enn Chit1 mRNA ble observert i de fleste mus vev, bortsett fra øynene. Våre resultater tyder også på at genuttrykk av Chit1 kan utviklingshemmede regulert, noe som tyder på at det spiller en rolle i ontogeny. Å studere reguleringen av ekspresjonen av pattedyr kitinaser kan gi innsikt i de fysiologiske rollene til disse enzymene. En detaljert karakterisering av promotorområdene for Chit1 og AMCase gener, samt identifikasjon av cis
- og trans
-acting faktorer vil være nødvendig for å forstå den selektive ekspresjonen av disse enzymene <. br>

Selv om pattedyr ikke produserer kitin eller chitin syntase, de er kontinuerlig utsatt for denne polymer ved eksponering for chitin-inneholdende parasitter og patogener. Substratet for pattedyr kitinaser er antagelig miljø kitin, slik som finnes i sopp eller parasittiske nematoder. I lungene, kan begge enzymene fungere som en del av vertens forsvarsmekanisme mot chitin-inneholdende patogener, slik som muggsopp og midd, som induserer luftveier allergi.

• PLoS ONE: Analyse av magen og tarmen Microbiomes i det østlige Oyster (Crassostrea virginica) fra Coastal Louisiana, USA
• PLoS ONE: fibroblastvekstfaktor 10-fibroblast vekstfaktor reseptor 2b mediert signale kreves ikke for voksen kjertelmagen Homeostase