Raziskovalci razvijajo prenosljivo in integrativno platformo tipa I na osnovi CRISPR za urejanje superbugov

Raziskovalna skupina, ki jo vodi dr.Aixin YAN, Izredni profesor na Oddelku za raziskave molekularne in celične biologije, Fakulteta za naravoslovje, v sodelovanju s častnim kliničnim profesorjem Patrickom CY WOO z Oddelka za mikrobiologijo, Medicinska fakulteta Li Ka Shing, Univerza v Hongkongu (HKU), poročali o razvoju prenosljive in integrativne platforme tipa I na osnovi CRISPR, ki lahko učinkovito ureja različne klinične izolate Pseudomonas aeruginosa , superbakterija, ki lahko okuži različna tkiva in organe, in glavni vir bolnišničnih okužb.

Tehnika lahko pospeši identifikacijo dejavnikov odpornosti patogenov, odpornih na več zdravil (MDR), in razvoj novih strategij proti odpornosti.

Raziskava je odprla novo pot za genomsko urejanje teh divjih bakterijskih vrst in izolatov, kot so tisti s kliničnim in okoljskim pomenom ter tisti, ki tvorijo človeški mikrobiom. Zagotovil je tudi okvir za uporabo drugih sistemov CRISPR-Cas, razširjenih v prokariontskih genomih, in razširitev naborov orodij, ki temeljijo na CRISPR. Raziskava je bila objavljena v vodilni znanstveni reviji Raziskave nukleinskih kislin .

Ozadje

Sistem CRISPR-Cas obsega adaptivni imunski sistem pri prokariotih, ki z razcepom njihove DNK razoroži invazivne viruse. Zaradi svoje edinstvene sposobnosti ciljanja in spreminjanja zaporedij DNK, CRISPR-Cas je bil izkoriščen kot metoda urejanja genoma naslednje generacije.

Metoda temelji na sistemu razreda 2 tipa CRISPR/Cas9, ki je revolucioniral genetiko in biomedicinske raziskave v številnih organizmih in bil leta 2020 nagrajen z Nobelovo nagrado za kemijo. Vendar pa sistemi razreda 2 CRISPR-Cas predstavljajo le ∼10% sistemov CRISPR-Cas, naravno kodiranih v prokariotih. Njihove aplikacije za urejanje bakterijskih genomov so precej omejene.

Izjemno, Sistemi CRISPR-Cas, ki pripadajo različnim razredom in tipom, se stalno identificirajo, in služijo kot globok rezervoar za razširitev kompletov orodij, ki temeljijo na CRISPR. Najbolj raznolik in široko razširjen sistem CRISPR-Cas je sistem tipa I, ki predstavlja 50% vseh identificiranih sistemov CRISPR-Cas in ima potencial za razširitev naborov orodij na osnovi CRISPR z značilnimi prednostmi, ki niso dostopne pri sistemih razreda 2, na primer visoka specifičnost, minimalno ciljanje brez cilja, in zmožen brisanja velikih fragmentov.

Vendar pa sistem CRISPR-Cas tipa I je odvisen od večkomponentnega efektorskega kompleksa, imenovanega Cascade, da moti DNA, ki je ni mogoče enostavno prenesti na heterologne gostitelje, ovirajo široko uporabo teh naravno bogatih CRISPR za urejanje genoma in terapijo.

Ključne ugotovitve

Prej ekipa je identificirala zelo aktiven sistem tipa I-F CRISPR-Cas v klinično odporni na več zdravil P. aeruginosa sev PA154197, izoliran iz primera okužbe krvnega obtoka v bolnišnici Queen Mary. Opisali so ta sistem CRISPR-Cas in uspešno razvili metodo urejanja genoma, ki se uporablja v izolatu MDR na podlagi tega izvornega sistema I-F CRISPR-Cas. Metoda je omogočila hitro identifikacijo dejavnikov odpornosti kliničnega izolata MDR in razvoj nove strategije proti odpornosti ( Poročila o celicah , 2019, 29, 1707-1717).

Za premagovanje ovire pri prenosu kompleksne kaskade tipa I na heterologne gostitelje, v tej študiji, ekipa je klonirala celoten tip I-F cas operon v integracijski vešči mini-CTX in kaseto dostavil v heterologne gostitelje s konjugacijo, pristop prenosa DNK, ki je običajen v naravi. Vektor mini-CTX je omogočil integracijo celotne kaskade v ohranjeno attB genetski lokus v genomu heterolognih gostiteljev, ki jim omogoča, da imajo "domač" sistem tipa I-F CRISPR-Cas, ki ga je mogoče stabilno izraziti in delovati.

Ekipa je pokazala, da prenesena kaskada tipa I-F kaže bistveno večjo zmogljivost motenj DNK in večjo stabilnost seva kot prenosljiv sistem Cas9 in se lahko uporablja za urejanje genoma z učinkovitostjo (> 80%) in preprostostjo, t.j. z enostopenjsko transformacijo enega urejevalnega plazmida.

Poleg tega razvili so napreden prenosljiv sistem, ki vključuje visoko aktivno kaskado tipa I-F in rekombinazo za spodbujanje uporabe sistema pri sevih s slabo homologno rekombinacijsko zmogljivostjo, divji P. aeruginosa izolati brez podatkov o zaporedju genoma, in v drugih Pseudomonas vrste.

Nazadnje, uvedene kaskadne gene tipa I-F je mogoče zlahka odstraniti iz genoma gostitelja z I-F kaskadno posredovano brisanjem velikih fragmentov DNK, kar ima za posledico urejanje genoma v brazgotinah v celicah gostitelja. Dokazana je bila tudi uporaba prenosnega sistema za represijo genov, poudarja robustne in raznolike aplikacije razvitega prenosnega sistema tipa I-F CRISPR.

Aixin Yan je napovedal, da se bo ta nova metoda razširila na urejanje ne le patogenov, ampak tudi mikrobiomov za spodbujanje zdravja ljudi.

Verjamemo, da bosta tehnologija in terapije, ki temeljijo na CRISPR, v prihodnje prinesla nove upanje v boj proti superbugom . "

Dr. Aixin YAN, Izredni profesor, Raziskovalni oddelek za molekularno in celično biologijo, Fakulteta za naravoslovje, Univerza v Hongkongu

• UMass Amherst dr. kandidat prejme štipendijo USDA-NIFA za raziskave alergije na hrano
• Dober holesterol ščiti jetra pred vnetji in poškodbami,