Stomach Health > Vatsa terveys >  > Q and A > vatsa kysymys

Tutkijat kehittävät siirrettävän ja integroivan tyypin I CRISPR-pohjaisen alustan superbugien muokkaamiseen

Aixin YANin johtama tutkimusryhmä, Apulaisprofessori Molekyyli- ja solubiologian tutkimusosastolta, Tieteen tiedekunta, yhteistyössä kunniakliinisen professorin Patrick CY WOO:n kanssa mikrobiologian laitokselta, Li Ka Shingin lääketieteellinen tiedekunta, Hongkongin yliopisto (HKU), raportoi kehitettävän siirrettävän ja integroivan tyypin I CRISPR-pohjaisen alustan, joka voi muokata tehokkaasti eri kliinisiä isolaatteja Pseudomonas aeruginosa , superbug, joka kykenee tartuttamaan erilaisia ​​kudoksia ja elimiä, ja merkittävä sairaalainfektioiden lähde.

Tekniikka voi nopeuttaa monilääkeresistenttien (MDR) patogeenien resistenssitekijöiden tunnistamista ja uusien vastustuskykyisten strategioiden kehittämistä.

Tutkimus avasi uuden tien genomisesti muokata näitä luonnonvaraisia ​​bakteerilajeja ja isolaatteja, kuten ne, joilla on kliinistä ja ympäristön kannalta merkittävää merkitystä ja jotka muodostavat ihmisen mikrobiomin. Se tarjosi myös kehyksen muiden prokaryoottisissa genomeissa yleisten CRISPR-Cas-järjestelmien hyödyntämiseksi ja CRISPR-pohjaisten työkalusarjojen laajentamiseksi. Tutkimus on julkaistu johtavassa tiedelehdessä Nukleiinihappotutkimus .

Tausta

CRISPR-Cas-järjestelmä käsittää prokaryoottien adaptiivisen immuunijärjestelmän, joka riisuu hyökkäävät virukset pois katkaisemalla niiden DNA:n. Ainutlaatuisen kykynsä kohdistaa ja muuttaa DNA -sekvenssejä ansiosta CRISPR-Casia on hyödynnetty seuraavan sukupolven genomin editointimenetelmänä.

Menetelmä perustuu luokan 2 tyypin II CRISPR/Cas9 -järjestelmään, joka on mullistanut genetiikan ja biolääketieteellisen tutkimuksen lukuisissa organismeissa ja sai vuoden 2020 kemian Nobel -palkinnon. Kuitenkin, luokan 2 CRISPR-Cas-järjestelmät edustavat vain ~ 10% CRISPR-Cas-järjestelmistä, jotka on koodattu luonnollisesti prokaryooteissa. Niiden sovellukset bakteerien genomien muokkaamiseen ovat melko rajallisia.

Merkittävästi, CRISPR-Cas-järjestelmiä, jotka kuuluvat eri luokkiin ja tyyppeihin, tunnistetaan jatkuvasti, ja ne toimivat syvänä säiliönä CRISPR-pohjaisten työkalusarjojen laajentamiselle. Monipuolisin ja laajalti jaettu CRISPR-Cas-järjestelmä on tyypin I järjestelmä, joka muodostaa 50% kaikista tunnistetuista CRISPR-Cas-järjestelmistä ja jolla on mahdollisuus laajentaa CRISPR-pohjaisia ​​työkalupakkeja, joilla on erityisiä etuja, joita ei voida käyttää luokan 2 järjestelmissä, kuten korkea spesifisyys, minimaalinen kohdentaminen, ja pystyy poistamaan suuria fragmentteja.

Kuitenkin, tyypin I CRISPR-Cas-järjestelmä perustuu monikomponenttiseen efektorikompleksiin, jota kutsutaan nimellä Cascade häiritäkseen DNA:ta, jota ei voida helposti siirtää heterologisille isännille, estää näiden luonnostaan ​​runsaiden CRISPR:ien laajan soveltamisen genomin muokkaamiseen ja hoitoon.

Avainlöydökset

Aiemmin, tiimi on tunnistanut erittäin aktiivisen tyypin I-F CRISPR-Cas -järjestelmän kliinisesti monilääkeresistentiksi P. aeruginosa kanta PA154197, joka eristettiin Queen Mary -sairaalan verenkiertotapaustapauksesta. He luonnehtivat tätä CRISPR-Cas-järjestelmää ja kehittivät menestyksekkäästi genominkäsittelymenetelmän, jota voidaan soveltaa MDR-isolaattiin ja joka perustuu tähän alkuperäiseen tyypin I-F CRISPR-Cas -järjestelmään. Menetelmä mahdollisti kliinisen MDR-isolaatin resistenssiä määrittävien tekijöiden nopean tunnistamisen ja uuden resistenssin vastaisen strategian kehittämisen ( Soluraportit , 2019, 29, 1707-1717).

Voittaaksesi esteen, joka johtuu kompleksisen tyypin I kaskadin siirtämisestä heterologisille isännille, tässä tutkimuksessa, ryhmä kloonasi koko tyypin I-F cas operonin integroinnin taitavaan vektoriin mini-CTX ja toimittanut kasetin heterologisiin isäntiin konjugaation avulla, Luonnossa yleinen DNA -siirtomenetelmä. Mini-CTX-vektori mahdollisti koko Cascaden integroinnin konservoituihin attB geneettinen lokus heterologisten isäntien genomissa, joiden avulla he voivat käyttää "natiivi" tyypin I-F CRISPR-Cas -järjestelmää, joka voidaan ilmaista vakaasti ja toimia.

Tiimi osoitti, että siirretyn tyypin I-F Cascade -laitteessa on merkittävästi suurempi DNA-häiriökapasiteetti ja suurempi kannan stabiilisuus kuin siirrettävässä Cas9-järjestelmässä, ja sitä voidaan käyttää genomin muokkaamiseen tehokkaasti (> 80%) ja yksinkertaisesti, eli yhden editointiplasmidin yksivaiheisella transformaatiolla.

Lisäksi, he ovat kehittäneet kehittyneen siirrettävän järjestelmän, joka sisältää sekä erittäin aktiivisen tyypin I-F-kaskadin että rekombinaasin järjestelmän käytön edistämiseksi kannoissa, joilla on heikko homologinen rekombinaatiokyky, villi P. aeruginosa eristää ilman genomin sekvenssitietoja, ja muissa Pseudomonas lajia.

Lopuksi, käyttöön otetut tyypin I-F Cascade -geenit voidaan helposti poistaa isäntägenomeista suurten DNA-fragmenttien I-F Cascade -välitteisen deleetion kautta, mikä johtaa arpittomaan genomin editointiin isäntäsoluissa. Myös siirrettävän järjestelmän soveltaminen geenien tukahduttamiseen osoitettiin, korostaen kehitetyn siirrettävän tyypin I-F CRISPR -järjestelmän vankkoja ja monipuolisia sovelluksia.

Tohtori Aixin Yan ennusti, että tämä uusi menetelmä laajennetaan koskemaan paitsi taudinaiheuttajia myös mikrobiomia ihmisten terveyden edistämiseksi.

Uskomme, että CRISPR-pohjainen tekniikka ja hoidot tuovat uusia toiveita superbugien taistelussa tulevaisuudessa . "

Tohtori Aixin YAN, Apulaisprofessori, Molekyyli- ja solubiologian tutkimusosasto, Tieteen tiedekunta, Hongkongin yliopisto

Other Languages