Tekniikka voi nopeuttaa monilääkeresistenttien (MDR) patogeenien resistenssitekijöiden tunnistamista ja uusien vastustuskykyisten strategioiden kehittämistä.
Tutkimus avasi uuden tien genomisesti muokata näitä luonnonvaraisia bakteerilajeja ja isolaatteja, kuten ne, joilla on kliinistä ja ympäristön kannalta merkittävää merkitystä ja jotka muodostavat ihmisen mikrobiomin. Se tarjosi myös kehyksen muiden prokaryoottisissa genomeissa yleisten CRISPR-Cas-järjestelmien hyödyntämiseksi ja CRISPR-pohjaisten työkalusarjojen laajentamiseksi. Tutkimus on julkaistu johtavassa tiedelehdessä Nukleiinihappotutkimus .
CRISPR-Cas-järjestelmä käsittää prokaryoottien adaptiivisen immuunijärjestelmän, joka riisuu hyökkäävät virukset pois katkaisemalla niiden DNA:n. Ainutlaatuisen kykynsä kohdistaa ja muuttaa DNA -sekvenssejä ansiosta CRISPR-Casia on hyödynnetty seuraavan sukupolven genomin editointimenetelmänä.
Menetelmä perustuu luokan 2 tyypin II CRISPR/Cas9 -järjestelmään, joka on mullistanut genetiikan ja biolääketieteellisen tutkimuksen lukuisissa organismeissa ja sai vuoden 2020 kemian Nobel -palkinnon. Kuitenkin, luokan 2 CRISPR-Cas-järjestelmät edustavat vain ~ 10% CRISPR-Cas-järjestelmistä, jotka on koodattu luonnollisesti prokaryooteissa. Niiden sovellukset bakteerien genomien muokkaamiseen ovat melko rajallisia.
Merkittävästi, CRISPR-Cas-järjestelmiä, jotka kuuluvat eri luokkiin ja tyyppeihin, tunnistetaan jatkuvasti, ja ne toimivat syvänä säiliönä CRISPR-pohjaisten työkalusarjojen laajentamiselle. Monipuolisin ja laajalti jaettu CRISPR-Cas-järjestelmä on tyypin I järjestelmä, joka muodostaa 50% kaikista tunnistetuista CRISPR-Cas-järjestelmistä ja jolla on mahdollisuus laajentaa CRISPR-pohjaisia työkalupakkeja, joilla on erityisiä etuja, joita ei voida käyttää luokan 2 järjestelmissä, kuten korkea spesifisyys, minimaalinen kohdentaminen, ja pystyy poistamaan suuria fragmentteja.
Kuitenkin, tyypin I CRISPR-Cas-järjestelmä perustuu monikomponenttiseen efektorikompleksiin, jota kutsutaan nimellä Cascade häiritäkseen DNA:ta, jota ei voida helposti siirtää heterologisille isännille, estää näiden luonnostaan runsaiden CRISPR:ien laajan soveltamisen genomin muokkaamiseen ja hoitoon.
Aiemmin, tiimi on tunnistanut erittäin aktiivisen tyypin I-F CRISPR-Cas -järjestelmän kliinisesti monilääkeresistentiksi P. aeruginosa kanta PA154197, joka eristettiin Queen Mary -sairaalan verenkiertotapaustapauksesta. He luonnehtivat tätä CRISPR-Cas-järjestelmää ja kehittivät menestyksekkäästi genominkäsittelymenetelmän, jota voidaan soveltaa MDR-isolaattiin ja joka perustuu tähän alkuperäiseen tyypin I-F CRISPR-Cas -järjestelmään. Menetelmä mahdollisti kliinisen MDR-isolaatin resistenssiä määrittävien tekijöiden nopean tunnistamisen ja uuden resistenssin vastaisen strategian kehittämisen ( Soluraportit , 2019, 29, 1707-1717).
Voittaaksesi esteen, joka johtuu kompleksisen tyypin I kaskadin siirtämisestä heterologisille isännille, tässä tutkimuksessa, ryhmä kloonasi koko tyypin I-F cas operonin integroinnin taitavaan vektoriin mini-CTX ja toimittanut kasetin heterologisiin isäntiin konjugaation avulla, Luonnossa yleinen DNA -siirtomenetelmä. Mini-CTX-vektori mahdollisti koko Cascaden integroinnin konservoituihin attB geneettinen lokus heterologisten isäntien genomissa, joiden avulla he voivat käyttää "natiivi" tyypin I-F CRISPR-Cas -järjestelmää, joka voidaan ilmaista vakaasti ja toimia.
Tiimi osoitti, että siirretyn tyypin I-F Cascade -laitteessa on merkittävästi suurempi DNA-häiriökapasiteetti ja suurempi kannan stabiilisuus kuin siirrettävässä Cas9-järjestelmässä, ja sitä voidaan käyttää genomin muokkaamiseen tehokkaasti (> 80%) ja yksinkertaisesti, eli yhden editointiplasmidin yksivaiheisella transformaatiolla.
Lisäksi, he ovat kehittäneet kehittyneen siirrettävän järjestelmän, joka sisältää sekä erittäin aktiivisen tyypin I-F-kaskadin että rekombinaasin järjestelmän käytön edistämiseksi kannoissa, joilla on heikko homologinen rekombinaatiokyky, villi P. aeruginosa eristää ilman genomin sekvenssitietoja, ja muissa Pseudomonas lajia.
Lopuksi, käyttöön otetut tyypin I-F Cascade -geenit voidaan helposti poistaa isäntägenomeista suurten DNA-fragmenttien I-F Cascade -välitteisen deleetion kautta, mikä johtaa arpittomaan genomin editointiin isäntäsoluissa. Myös siirrettävän järjestelmän soveltaminen geenien tukahduttamiseen osoitettiin, korostaen kehitetyn siirrettävän tyypin I-F CRISPR -järjestelmän vankkoja ja monipuolisia sovelluksia.
Tohtori Aixin Yan ennusti, että tämä uusi menetelmä laajennetaan koskemaan paitsi taudinaiheuttajia myös mikrobiomia ihmisten terveyden edistämiseksi.
Uskomme, että CRISPR-pohjainen tekniikka ja hoidot tuovat uusia toiveita superbugien taistelussa tulevaisuudessa . "
Tohtori Aixin YAN, Apulaisprofessori, Molekyyli- ja solubiologian tutkimusosasto, Tieteen tiedekunta, Hongkongin yliopisto