Výskumníci vyvíjajú prenosnú a integrovateľnú platformu CRISPR typu I na úpravu superbugov

Výskumný tím vedený doktorom Aixinom YANOM, Docent z výskumnej divízie molekulárnej a bunkovej biológie, Fakulta vedy, v spolupráci s čestným klinickým profesorom Patrickom CY WOO z Katedry mikrobiológie, Lekárska fakulta Li Ka Shing, Hongkongská univerzita (HKU), informoval o vývoji prenosnej a integračnej platformy typu CRISPR typu I, ktorá môže efektívne upravovať rôzne klinické izoláty Pseudomonas aeruginosa , superbug schopný infikovať rôzne tkanivá a orgány a hlavný zdroj nozokomiálnych infekcií.

Táto technika môže urýchliť identifikáciu determinantov rezistencie viacliekových rezistentných (MDR) patogénov a vývoj nových stratégií proti rezistencii.

Výskum otvoril novú cestu ku genomickej úprave týchto voľne žijúcich bakteriálnych druhov a izolátov, ako sú tie s klinickým a environmentálnym významom a tie, ktoré tvoria ľudský mikrobióm. Poskytol tiež rámec na využitie ďalších systémov CRISPR-Cas rozšírených v prokaryotických genómoch a rozšíril sady nástrojov založené na CRISPR. Výskum bol publikovaný v hlavnom vedeckom časopise Výskum nukleových kyselín .

Pozadie

Systém CRISPR-Cas obsahuje adaptívny imunitný systém v prokaryotoch, ktorý odzbrojuje invázne vírusy štiepením ich DNA. Vďaka svojej jedinečnej schopnosti zacieľovať a meniť sekvencie DNA, CRISPR-Cas bol využívaný ako metóda úpravy genómu ďalšej generácie.

Metóda je založená na systéme CRISPR/Cas9 triedy 2 typu II, ktorá priniesla revolúciu v genetike a biomedicínskom výskume v množstve organizmov a získala Nobelovu cenu za chémiu 2020. Avšak, systémy CRISPR-Cas triedy 2 predstavujú iba ~ 10% systémov CRISPR-Cas kódovaných prirodzene v prokaryotoch. Ich aplikácie na úpravu bakteriálnych genómov sú dosť obmedzené.

Je pozoruhodné, Systémy CRISPR-Cas patriace do rôznych tried a typov sú nepretržite identifikované, a slúžia ako hlboký rezervoár pre rozšírenie súprav nástrojov založených na CRISPR. Najrozmanitejšími a najrozšírenejšími systémami CRISPR-Cas je systém typu I, ktorý predstavuje 50% všetkých identifikovaných systémov CRISPR-Cas a ktorý má potenciál rozšíriť sady nástrojov založené na CRISPR s výraznými výhodami, ktoré nie sú prístupné pre systémy triedy 2, ako je vysoká špecifickosť, minimálne zacielenie, a schopné veľkých delécií fragmentov.

Avšak, systém CRISPR-Cas typu I závisí od viaczložkového efektorového komplexu nazývaného Cascade, aby interferoval s DNA, ktorá nie je ľahko prenosná na heterológnych hostiteľov, bráni rozsiahlej aplikácii týchto prirodzene sa vyskytujúcich CRISPR na úpravu genómu a terapeutiká.

Kľúčové poznatky

Predtým tím identifikoval vysoko aktívny systém CRISPR-Cas typu I-F v klinickej rezistencii na viac liečiv P. aeruginosa kmeň PA154197, ktorý bol izolovaný z prípadu infekcie krvného obehu v nemocnici Queen Mary Hospital. Charakterizovali tento systém CRISPR-Cas a úspešne vyvinuli metódu úpravy genómu použiteľnú v izoláte MDR na základe tohto natívneho systému CRISPR-Cas typu I-F. Metóda umožnila rýchlu identifikáciu determinantov rezistencie klinického izolátu MDR a vývoj novej stratégie proti rezistencii ( Bunkové správy , 2019, 29, 1707-1717).

Aby sa prekonala bariéra prenosu komplexnej kaskády typu I na heterológnych hostiteľov, v tejto štúdii, tím klonoval celý typ I-F cas operón do integračného vektora mini-CTX a doručil kazetu do heterológnych hostiteľov konjugáciou, v prírode bežný prístup k prenosu DNA. Vektor mini-CTX umožnil integráciu celej Cascade do konzervovaných attB genetický lokus v genóme heterológnych hostiteľov, čo im umožňuje uchovávať „natívny“ systém CRISPR-Cas typu I-F, ktorý je možné stabilne vyjadrovať a fungovať.

Tím ukázal, že prenesená kaskáda typu I-F vykazuje výrazne väčšiu schopnosť interferencie DNA a vyššiu stabilitu kmeňa ako prenosný systém Cas9 a je možné ju použiť na úpravu genómu s účinnosťou (> 80%) a jednoduchosťou, tj. jednokrokovou transformáciou jedného editovacieho plazmidu.

Okrem toho, vyvinuli pokročilý prenosný systém, ktorý zahŕňa vysoko aktívnu kaskádu typu I-F a rekombinázu na podporu aplikácie systému v kmeňoch so slabou homológnou rekombinačnou schopnosťou, divoký P. aeruginosa izoláty bez informácií o sekvencii genómu, a v ďalších Pseudomonas druh.

Nakoniec, zavedené kaskádové gény typu I-F je možné ľahko odstrániť z genómov hostiteľa prostredníctvom delécie veľkých fragmentov DNA sprostredkovanej kaskádou I-F Cascade, čo má za následok bezproblémovú úpravu genómu v hostiteľských bunkách. Bola tiež demonštrovaná aplikácia prenosného systému na génovú represiu, zdôrazňuje robustné a rozmanité aplikácie vyvinutého prenosného systému CRISPR typu I-F.

Aixin Yan predpovedal, že táto nová metóda bude rozšírená o úpravu nielen patogénov, ale aj mikrobiómov na podporu ľudského zdravia.

Veríme, že technológie a terapie založené na CRISPR prinesú do budúcnosti nové nádeje v boji proti superbugom . "

Doktor Aixin YAN, Docent, Divízia výskumu molekulárnej a bunkovej biológie, Fakulta vedy, Univerzita v Hongkongu

• UMass Amherst Ph.D. kandidát získa štipendium USDA-NIFA za výskum potravinovej alergie
• Dobrý cholesterol chráni pečeň pred zápalmi a poraneniami,