Istraživači razvijaju prenosivu i integrativnu platformu tipa I temeljenu na CRISPR-u za uređivanje superbugova

Istraživački tim predvođen dr. Aixin YAN, Izvanredni profesor na Odjelu za istraživanje molekularne i stanične biologije, Fakultet znanosti, u suradnji s počasnim kliničkim profesorom Patrickom CY WOO -om s Odjela za mikrobiologiju, Medicinski fakultet Li Ka Shing, Sveučilište u Hong Kongu (HKU), izvijestio je o razvoju prijenosne i integrativne platforme tipa I zasnovane na CRISPR-u koja može učinkovito uređivati ​​različite kliničke izolate Pseudomonas aeruginosa , superbakterija sposobna zaraziti različita tkiva i organe i glavni izvor bolničkih infekcija.

Ova tehnika može ubrzati identifikaciju determinanti rezistencije patogena na više lijekova (MDR) i razvoj novih strategija protiv rezistencije.

Istraživanje je otvorilo novi put za genetsko uređivanje tih divljih bakterijskih vrsta i izolata, poput onih s kliničkim i ekološkim značajem i onih koji tvore ljudski mikrobiom. Također je pružio okvir za korištenje drugih CRISPR-Cas sustava rasprostranjenih u prokariotskim genomima i proširenje kompleta alata temeljenih na CRISPR-u. Istraživanje je objavljeno u vodećem znanstvenom časopisu Istraživanje nukleinskih kiselina .

Pozadina

CRISPR-Cas sustav sadrži adaptivni imunološki sustav kod prokariota koji razoružava invazivne viruse cijepanjem njihove DNK. Zbog svoje jedinstvene sposobnosti ciljanja i mijenjanja DNK sekvenci, CRISPR-Cas je iskorištavan kao nova metoda uređivanja genoma.

Metoda se temelji na CRISPR/Cas9 sustavu klase 2 tipa II, koja je revolucionirala genetiku i biomedicinska istraživanja u mnoštvu organizama i nagrađena je Nobelovom nagradom za kemiju 2020. Međutim, CRISPR-Cas sustavi klase 2 predstavljaju samo ∼10% CRISPR-Cas sustava kodiranih prirodno u prokariotima. Njihove primjene za uređivanje bakterijskih genoma prilično su ograničene.

Izvanredno, CRISPR-Cas sustavi koji pripadaju različitim klasama i tipovima kontinuirano se identificiraju, i služe kao duboki spremnik za proširenje kompleta alata temeljenih na CRISPR-u. Najrazličitiji i najrasprostranjeniji sustav CRISPR-Cas je sustav tipa I koji čini 50% svih identificiranih sustava CRISPR-Cas i ima potencijal za proširenje kompleta alata temeljenih na CRISPR-u s izrazitim prednostima koje nisu dostupne sustavima klase 2, poput visoke specifičnosti, minimalno ciljanje izvan cilja, i sposoban za brisanje velikih fragmenata.

Međutim, CRISPR-Cas sustav tipa I ovisi o višekomponentnom efektorskom kompleksu koji se naziva Kaskada za ometanje DNA koji se ne može lako prenijeti na heterologne domaćine, ometajući široku primjenu ovih prirodno bogatih CRISPR -a za uređivanje genoma i terapiju.

Ključni pronalasci

Prethodno, tim je identificirao visoko aktivan CRISPR-Cas sustav tipa I-F u kliničkoj rezistenciji na više lijekova P. aeruginosa soj PA154197 koji je izoliran iz infekcije krvotoka u bolnici Queen Mary. Opisali su ovaj CRISPR-Cas sustav i uspješno razvili metodu uređivanja genoma primjenjivu u izolatu MDR na temelju ovog izvornog tipa I-F CRISPR-Cas sustava. Metoda je omogućila brzu identifikaciju determinanti rezistencije kliničkog izolata MDR-a i razvoj nove strategije protiv rezistencije ( Ćelijska izvješća , 2019., 29, 1707-1717).

Kako bi se prevladala barijera prijenosa složene kaskade tipa I na heterologne domaćine, u ovoj studiji, tim je klonirao cijeli tip I-F cas operon u vektorski mini-CTX s integracijom i isporučio kazetu u heterologne domaćine konjugacijom, pristup prijenosa DNA uobičajen u prirodi. Mini-CTX vektor omogućio je integraciju cijele kaskade u konzerviranu attB genetski lokus u genomu heterolognih domaćina, omogućujući im da imaju "izvorni" sustav tipa I-F CRISPR-Cas koji se može stabilno izraziti i funkcionirati.

Tim je pokazao da prenesena kaskada tipa I-F pokazuje značajno veći kapacitet interferencije DNA i veću stabilnost soja od prijenosnog sustava Cas9 te se može koristiti za uređivanje genoma s učinkovitošću (> 80%) i jednostavnošću, tj. Jednostupanjskom transformacijom jednog uređivačkog plazmida.

Nadalje, razvili su napredni prijenosni sustav koji uključuje i visoko aktivnu kaskadu tipa I-F i rekombinazu za promicanje primjene sustava u sojevima sa slabim kapacitetom homologne rekombinacije, divlji P. aeruginosa izolati bez podataka o sekvenci genoma, i u drugim Pseudomonas vrsta.

Posljednje, uvedeni kaskadni geni tipa I-F mogu se lako ukloniti iz genoma domaćina brisanjem velikih fragmenata DNA posredovanim I-F kaskadom što rezultira uređivanjem genoma bez ožiljaka u stanicama domaćinima. Također je pokazana primjena prijenosnog sustava za represiju gena, ističući robusne i raznolike primjene razvijenog prijenosnog sustava tipa I-F CRISPR.

Aixin Yan je predvidio da će se ova nova metoda proširiti na uređivanje ne samo patogena već i mikrobioma radi promicanja zdravlja ljudi.

Vjerujemo da će tehnologija i terapije temeljene na CRISPR-u donijeti nove nade u borbu protiv superbugova u budućnosti . "

Dr. Aixin YAN, Izvanredni profesor, Istraživački odjel za molekularnu i staničnu biologiju, Fakultet znanosti, Sveučilište u Hong Kongu

• UMass Amherst dr. Sc. kandidat dobiva stipendiju USDA-NIFA-e za istraživanje alergije na hranu
• Dobar kolesterol štiti jetru od upale i ozljeda,