Исследователи разрабатывают переносимую и интегрируемую платформу на основе CRISPR I типа для редактирования супербактерий.

Исследовательская группа во главе с доктором Айсинь ЯН, Доцент научно-исследовательского отдела молекулярной и клеточной биологии, Факультет наук, в сотрудничестве с почетным клиническим профессором Патриком CY WOO с кафедры микробиологии, Ли Ка Шинг, медицинский факультет, Университет Гонконга (HKU), сообщили о разработке переносимой и интегративной платформы на основе CRISPR I типа, которая может эффективно редактировать различные клинические изоляты Синегнойная палочка , супербактерия, способная инфицировать различные ткани и органы, и главный источник внутрибольничных инфекций.

Этот метод может ускорить идентификацию детерминант резистентности патогенов с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и разработку новых стратегий противодействия резистентности.

Исследование открыло новые возможности для геномного редактирования этих диких видов и изолятов бактерий. такие как те, которые имеют клиническое и экологическое значение, и те, которые образуют микробиом человека. Он также предоставил основу для использования других систем CRISPR-Cas, широко распространенных в прокариотических геномах, и расширения наборов инструментов на основе CRISPR. Исследование опубликовано в ведущем научном журнале. Исследования нуклеиновых кислот .

Фон

Система CRISPR-Cas включает в себя адаптивную иммунную систему прокариот, которая обезоруживает вторгшиеся вирусы, расщепляя их ДНК. Благодаря своей уникальной способности нацеливать и изменять последовательности ДНК, CRISPR-Cas использовался как метод редактирования генома нового поколения.

Метод основан на системе CRISPR / Cas9 класса 2 типа II, который произвел революцию в генетике и биомедицинских исследованиях множества организмов и был удостоен Нобелевской премии по химии 2020 года. Тем не мение, Системы CRISPR-Cas класса 2 представляют только ~ 10% систем CRISPR-Cas, которые в природе кодируются прокариотами. Их приложения для редактирования бактериальных геномов довольно ограничены.

Примечательно, что Системы CRISPR-Cas, принадлежащие к разным классам и типам, постоянно идентифицируются, и они служат глубоким резервуаром для расширения наборов инструментов на основе CRISPR. Самая разнообразная и широко распространенная система CRISPR-Cas - это система типа I, на которую приходится 50% всех идентифицированных систем CRISPR-Cas, и она имеет потенциал для расширения наборов инструментов на основе CRISPR с отличительными преимуществами, недоступными для систем класса 2, такая как высокая специфичность, минимальное отклонение от цели, и способна к удалению больших фрагментов.

Тем не мение, Система CRISPR-Cas типа I опирается на многокомпонентный эффекторный комплекс, называемый каскадом, для вмешательства в ДНК, которая не может быть легко передана гетерологичным хозяевам, препятствует широкому применению этих широко распространенных в природе CRISPR для редактирования генома и терапии.

Основные выводы

Ранее, команда определила высокоактивную систему CRISPR-Cas типа I-F в клинической лекарственной устойчивости P. aeruginosa штамм PA154197, который был изолирован от случая инфекции кровотока в больнице Королевы Марии. Они охарактеризовали эту систему CRISPR-Cas и успешно разработали метод редактирования генома, применимый к изоляту MDR, на основе этой системы CRISPR-Cas нативного типа I-F. Этот метод позволил быстро идентифицировать детерминанты резистентности клинического изолята МЛУ и разработать новую стратегию противодействия резистентности ( Отчеты по ячейкам , 2019, 29, 1707-1717).

Чтобы преодолеть барьер передачи комплексного каскада типа I гетерологичным хозяевам, в этом исследовании, команда клонировала весь тип I-F cas оперон в способный к интеграции вектор mini-CTX и доставил кассету к гетерологичным хозяевам путем конъюгации, подход к переносу ДНК, распространенный в природе. Вектор mini-CTX позволил интегрировать весь каскад на консервативный attB генетический локус в геноме гетерологичных хозяев, позволяя им иметь «родную» систему CRISPR-Cas типа I-F, которая может быть стабильно выражена и функционировать.

Команда показала, что перенесенный каскад типа I-F демонстрирует значительно большую способность к интерференции ДНК и более высокую стабильность штаммов, чем переносимая система Cas9, и может использоваться для редактирования генома с эффективностью (> 80%) и простотой, то есть одностадийной трансформацией единственной редактирующей плазмиды.

Более того, они разработали усовершенствованную переносимую систему, которая включает как высокоактивный каскад типа I-F, так и рекомбиназу, чтобы способствовать применению системы в штаммах с плохой гомологичной рекомбинационной способностью, дикий P. aeruginosa изоляты без информации о последовательности генома, и в других Псевдомонады разновидность.

Наконец, введенные гены каскада типа I-F могут быть легко удалены из геномов хозяина посредством делеции больших фрагментов ДНК, опосредованной I-F каскадом, что приводит к безрубцовому редактированию генома в клетках-хозяевах. Также было продемонстрировано применение переносимой системы для репрессии генов. подчеркивая надежные и разнообразные приложения разработанной системы CRISPR I-F переносного типа.

Д-р Айсин Ян предсказала, что этот новый метод будет распространен на редактирование не только патогенов, но и микробиома для улучшения здоровья человека.

<цитата>

Мы верим, что технологии и методы лечения на основе CRISPR принесут новые надежды на борьбу с супербактериями в будущем. . "

Д-р Айсинь ЯН, Доцент, Отдел исследований молекулярной и клеточной биологии, Факультет наук, Университет Гонконга

• UMass Amherst Ph.D. кандидат получает стипендию USDA-NIFA для исследования пищевой аллергии
• Хороший холестерин защищает печень от воспалений и травм,