Forscher entwickeln eine übertragbare und integrative Typ-I-CRISPR-basierte Plattform zur Bearbeitung von Superbugs

Ein Forschungsteam unter der Leitung von Dr. Aixin YAN, Assoziierter Professor der Forschungsabteilung für Molekular- und Zellbiologie, Fakultät für Naturwissenschaften, in Zusammenarbeit mit dem Honorary Clinical Professor Patrick CY WOO vom Department of Microbiology, Li Ka Shing Medizinische Fakultät, der Universität Hongkong (HKU), berichtete über die Entwicklung einer übertragbaren und integrativen Typ-I-CRISPR-basierten Plattform, die die verschiedenen klinischen Isolate von . effizient bearbeiten kann Pseudomonas aeruginosa , ein Superbug, der verschiedene Gewebe und Organe infizieren kann und eine Hauptquelle für nosokomiale Infektionen ist.

Die Technik kann die Identifizierung von Resistenzdeterminanten von multiresistenten (MDR) Pathogenen und die Entwicklung neuer Antiresistenzstrategien beschleunigen.

Die Forschung eröffnete einen neuen Weg, diese wilden Bakterienarten und Isolate genomisch zu bearbeiten. wie solche mit klinischer und ökologischer Bedeutung und solche, die das menschliche Mikrobiom bilden. Es bot auch einen Rahmen, um andere CRISPR-Cas-Systeme zu nutzen, die in prokaryotischen Genomen weit verbreitet sind, und die CRISPR-basierten Toolkits zu erweitern. Die Forschung wurde in der führenden Wissenschaftszeitschrift veröffentlicht Nukleinsäureforschung .

Hintergrund

Das CRISPR-Cas-System umfasst das adaptive Immunsystem in Prokaryoten, das eindringende Viren durch Spaltung ihrer DNA entwaffnet. Aufgrund seiner einzigartigen Fähigkeit, DNA-Sequenzen anzusteuern und zu verändern, CRISPR-Cas wurde als Genome-Editing-Methode der nächsten Generation genutzt.

Die Methode basiert auf dem CRISPR/Cas9-System der Klasse 2 Typ II, das die Genetik und biomedizinische Forschung in einer Vielzahl von Organismen revolutioniert hat und 2020 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet wurde. Jedoch, die CRISPR-Cas-Systeme der Klasse 2 repräsentieren nur ∼10% der CRISPR-Cas-Systeme, die natürlich in Prokaryonten kodiert sind. Ihre Anwendungen zur Bearbeitung bakterieller Genome sind eher begrenzt.

Bemerkenswert, CRISPR-Cas-Systeme verschiedener Klassen und Typen werden kontinuierlich identifiziert, und sie dienen als tiefes Reservoir für die Erweiterung der CRISPR-basierten Toolkits. Das vielfältigste und am weitesten verbreitete CRISPR-Cas-System ist das Typ-I-System, das 50% aller identifizierten CRISPR-Cas-Systeme ausmacht und das Potenzial hat, die CRISPR-basierten Toolkits um entscheidende Vorteile zu erweitern, die mit den Klasse-2-Systemen nicht zugänglich sind. wie hohe Spezifität, minimales Off-Targeting, und zu großen Fragmentdeletionen fähig.

Jedoch, das CRISPR-Cas-System vom Typ I hängt von einem mehrkomponentigen Effektorkomplex ab, der als Cascade bezeichnet wird, um DNA zu stören, die nicht ohne weiteres auf heterologe Wirte übertragbar ist, die weit verbreitete Anwendung dieser natürlicherweise reichlich vorhandenen CRISPR für Genome Editing und Therapeutika behindert.

Wichtigste Ergebnisse

Vorher, Das Team hat ein hochaktives CRISPR-Cas-System vom Typ I-F in einem klinischen, multiresistenten P. aeruginosa Stamm PA154197, der aus einem Fall einer Blutstrominfektion im Queen Mary Hospital isoliert wurde. Sie charakterisierten dieses CRISPR-Cas-System und entwickelten erfolgreich eine Methode zur Genom-Editierung, die auf das MDR-Isolat basierend auf diesem nativen CRISPR-Cas-System vom Typ I-F anwendbar ist. Die Methode ermöglichte die schnelle Identifizierung der Resistenzdeterminanten des klinischen MDR-Isolats und die Entwicklung einer neuartigen Anti-Resistenz-Strategie ( Zellenberichte , 2019, 29, 1707-1717).

Um die Barriere der Übertragung der komplexen Typ-I-Kaskade auf heterologe Wirte zu überwinden, in dieser Studie, das Team hat den gesamten Typ I-F geklont ca Operon in einen integrationsfähigen Vektor mini-CTX und lieferte die Kassette durch Konjugation in heterologe Wirte, ein in der Natur üblicher DNA-Transfer-Ansatz. Der Mini-CTX-Vektor ermöglichte die Integration der gesamten Cascade auf die konservierte attB genetischer Lokus im Genom der heterologen Wirte, es ihnen ermöglicht, ein "natives" CRISPR-Cas-System vom Typ I-F zu beherbergen, das stabil exprimiert werden und funktionieren kann.

Das Team zeigte, dass die übertragene Typ-I-F-Kaskade eine deutlich größere DNA-Interferenzkapazität und eine höhere Stammstabilität aufweist als das übertragbare Cas9-System und mit Effizienz (>80%) und Einfachheit für die Genom-Editierung eingesetzt werden kann. d.h. durch eine einstufige Transformation eines einzelnen Editierplasmids.

Außerdem, Sie entwickelten ein fortschrittliches übertragbares System, das sowohl eine hochaktive Typ I-F-Kaskade als auch eine Rekombinase enthält, um die Anwendung des Systems in Stämmen mit einer geringen homologen Rekombinationskapazität zu fördern. wild P. aeruginosa Isolate ohne Genomsequenzinformationen, und in anderen Pseudomonas Spezies.

Zuletzt, die eingeführten Typ I-F Cascade-Gene können durch die I-F Cascade-vermittelte Deletion großer DNA-Fragmente leicht aus den Wirtsgenomen entfernt werden, Dies führt zu einer narbenlosen Genom-Editierung in den Wirtszellen. Auch die Anwendung des übertragbaren Systems zur Genrepression wurde demonstriert, Hervorhebung der robusten und vielfältigen Anwendungen des entwickelten übertragbaren Typs I-F CRISPR-Systems.

Dr. Aixin Yan sagte voraus, dass diese neuartige Methode nicht nur auf die Bearbeitung von Krankheitserregern, sondern auch auf das Mikrobiom ausgeweitet wird, um die menschliche Gesundheit zu fördern.

Wir glauben, dass CRISPR-basierte Technologien und Therapien in Zukunft neue Hoffnungen in die Bekämpfung von Superbugs bringen werden ."

Dr. Aixin YAN, Außerordentlicher Professor, Forschungsabteilung für Molekular- &Zellbiologie, Fakultät für Naturwissenschaften, Die Universität von Hongkong

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