La tecnica può accelerare l'identificazione dei determinanti di resistenza dei patogeni multiresistenti (MDR) e lo sviluppo di nuove strategie antiresistenza.
La ricerca ha aperto una nuova strada per modificare genomicamente quelle specie batteriche selvatiche e gli isolati, come quelli con significato clinico e ambientale e quelli che formano il microbioma umano. Ha inoltre fornito un quadro per sfruttare altri sistemi CRISPR-Cas diffusi nei genomi procariotici ed espandere i kit di strumenti basati su CRISPR. La ricerca è stata pubblicata sull'importante rivista scientifica Ricerca sugli acidi nucleici .
Il sistema CRISPR-Cas comprende il sistema immunitario adattativo nei procarioti che disarma i virus invasori scindendo il loro DNA. Grazie alla sua capacità unica di mirare e alterare le sequenze di DNA, CRISPR-Cas è stato sfruttato come metodo di modifica del genoma di nuova generazione.
Il metodo si basa sul sistema CRISPR/Cas9 di Classe 2 tipo II, che ha rivoluzionato la genetica e la ricerca biomedica in una pletora di organismi ed è stata insignita del Premio Nobel 2020 per la Chimica. Però, i sistemi CRISPR-Cas di Classe 2 rappresentano solo circa il 10% dei sistemi CRISPR-Cas codificati naturalmente nei procarioti. Le loro applicazioni per modificare i genomi batterici sono piuttosto limitate.
Sorprendentemente, I sistemi CRISPR-Cas appartenenti a classi e tipologie diverse vengono continuamente identificati, e fungono da serbatoio profondo per l'espansione dei toolkit basati su CRISPR. I sistemi CRISPR-Cas più diversi e ampiamente distribuiti è il sistema di tipo I che rappresenta il 50% di tutti i sistemi CRISPR-Cas identificati e ha il potenziale per espandere i toolkit basati su CRISPR con vantaggi distintivi non accessibili con i sistemi di classe 2, come alta specificità, minimo off-targeting, e capace di grandi delezioni di frammenti.
Però, il sistema CRISPR-Cas di tipo I si basa su un complesso effettore multicomponente denominato Cascade per interferire con il DNA che non è facilmente trasferibile a ospiti eterologhi, ostacolando l'applicazione diffusa di questi CRISPR naturalmente abbondanti per l'editing e le terapie del genoma.
In precedenza, il team ha identificato un sistema CRISPR-Cas di tipo I-F altamente attivo in una clinica multiresistente P. aeruginosa ceppo PA154197 che è stato isolato da un caso di infezione del flusso sanguigno nel Queen Mary Hospital. Hanno caratterizzato questo sistema CRISPR-Cas e hanno sviluppato con successo un metodo di modifica del genoma applicabile nell'isolato MDR basato su questo sistema nativo CRISPR-Cas di tipo I-F. Il metodo ha consentito la rapida identificazione dei determinanti di resistenza dell'isolato clinico MDR e lo sviluppo di una nuova strategia antiresistenza ( Rapporti di cella , 2019, 29, 1707-1717).
Per superare la barriera del trasferimento del complesso Cascade di tipo I a host eterologhi, in questo studio, il team ha clonato l'intero tipo I-F caso l'operone in un vettore abile di integrazione mini-CTX e ha consegnato la cassetta in ospiti eterologhi per coniugazione, un approccio di trasferimento del DNA comune in natura. Il vettore mini-CTX ha permesso l'integrazione dell'intera Cascade sul conservato attB locus genetico nel genoma degli ospiti eterologhi, consentendo loro di ospitare un sistema CRISPR-Cas di tipo I-F "nativo" che può essere espresso e funzionare stabilmente.
Il team ha dimostrato che il tipo I-F Cascade trasferito mostra una capacità di interferenza del DNA significativamente maggiore e una maggiore stabilità del ceppo rispetto al sistema trasferibile Cas9 e può essere impiegato per l'editing del genoma con efficienza (>80%) e semplicità, cioè da una trasformazione in un unico passaggio di un singolo plasmide di editing.
Per di più, hanno sviluppato un sistema trasferibile avanzato che include sia una cascata di tipo I-F altamente attiva che una ricombinasi per promuovere l'applicazione del sistema in ceppi con una scarsa capacità di ricombinazione omologa, selvaggio P. aeruginosa isolati senza informazioni sulla sequenza del genoma, e in altro Pseudomonas specie.
Infine, i geni Cascade di tipo I-F introdotti possono essere facilmente rimossi dai genomi dell'ospite attraverso la delezione mediata da Cascade I-F di grandi frammenti di DNA, con conseguente modifica del genoma senza cicatrici nelle cellule ospiti. È stata anche dimostrata l'applicazione del sistema trasferibile per la repressione genica, mettendo in evidenza le applicazioni robuste e diversificate del sistema CRISPR trasferibile di tipo I-F sviluppato.
Il dottor Aixin Yan ha previsto che questo nuovo metodo sarà esteso alla modifica non solo degli agenti patogeni ma anche del microbioma per promuovere la salute umana.
Riteniamo che la tecnologia e le terapie basate su CRISPR porteranno nuove speranze per combattere i superbatteri in futuro ."
Dottor Aixin YAN, Professore Associato, Divisione Ricerca per Biologia Molecolare e Cellulare, Facoltà di Scienze, L'Università di Hong Kong
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