Os pesquisadores desenvolvem uma plataforma baseada em CRISPR tipo I transferível e integrativa para editar superbugs

Uma equipe de pesquisa liderada pelo Dr. Aixin YAN, Professor Associado da Divisão de Pesquisa de Biologia Molecular e Celular, Faculdade de Ciência, em colaboração com o Professor Clínico Honorário Patrick CY WOO do Departamento de Microbiologia, Faculdade de Medicina Li Ka Shing, a Universidade de Hong Kong (HKU), relataram o desenvolvimento de uma plataforma baseada em CRISPR tipo I transferível e integrativa que pode editar de forma eficiente os diversos isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa , uma superbactéria capaz de infectar vários tecidos e órgãos e uma importante fonte de infecções nosocomiais.

p A técnica pode acelerar a identificação de determinantes de resistência de patógenos multirresistentes (MDR) e o desenvolvimento de novas estratégias anti-resistência.

p A pesquisa abriu um novo caminho para editar genomicamente essas espécies bacterianas selvagens e isolados, tais como aqueles com significância clínica e ambiental e aqueles que formam o microbioma humano. Ele também forneceu uma estrutura para aproveitar outros sistemas CRISPR-Cas amplamente difundidos em genomas procarióticos e expandir os kits de ferramentas baseados em CRISPR. A pesquisa foi publicada na principal revista científica Pesquisa de ácidos nucléicos .

Fundo

p O sistema CRISPR-Cas compreende o sistema imunológico adaptativo em procariotos que desarma os vírus invasores por meio da clivagem de seu DNA. Devido à sua capacidade única de direcionar e alterar sequências de DNA, CRISPR-Cas foi explorado como o método de edição de genoma de próxima geração.

p O método é baseado no sistema Classe 2 tipo II CRISPR / Cas9, que revolucionou a genética e a pesquisa biomédica em uma infinidade de organismos e recebeu o Prêmio Nobel de Química em 2020. Contudo, os sistemas CRISPR-Cas Classe 2 representam apenas ± 10% dos sistemas CRISPR-Cas codificados naturalmente em procariotos. Suas aplicações para editar genomas bacterianos são bastante limitadas.

p Notavelmente, Os sistemas CRISPR-Cas pertencentes a diferentes classes e tipos são continuamente identificados, e eles servem como um reservatório profundo para a expansão dos kits de ferramentas baseados em CRISPR. Os sistemas CRISPR-Cas mais diversos e amplamente distribuídos são o sistema tipo I, que representa 50% de todos os sistemas CRISPR-Cas identificados e tem o potencial de expandir os kits de ferramentas baseados em CRISPR com vantagens distintas não acessíveis com os sistemas de classe 2, como alta especificidade, mínimo fora da segmentação, e capaz de grandes deleções de fragmentos.

p Contudo, sistema CRISPR-Cas tipo I articula-se em um complexo efetor de múltiplos componentes denominado como Cascata para interferir no DNA que não é prontamente transferível para hospedeiros heterólogos, dificultando a aplicação generalizada destes CRISPR naturalmente abundantes para edição de genoma e terapêutica.

Principais conclusões

p Anteriormente, a equipe identificou um sistema CRISPR-Cas tipo I-F altamente ativo em um multirresistente clínico P. aeruginosa estirpe PA154197 que foi isolada de um caso de infecção da corrente sanguínea no Queen Mary Hospital. Eles caracterizaram este sistema CRISPR-Cas e desenvolveram com sucesso um método de edição de genoma aplicável no isolado MDR com base neste sistema I-F CRISPR-Cas nativo. O método permitiu a rápida identificação dos determinantes de resistência do isolado clínico MDR e o desenvolvimento de uma nova estratégia anti-resistência ( Relatórios de Célula , 2019, 29, 1707-1717).

p Para superar a barreira de transferência do complexo tipo I em cascata para hospedeiros heterólogos, neste estudo, a equipe clonou todo o tipo I-F cas operon em um vetor proficiente de integração mini-CTX e distribuiu o cassete em hospedeiros heterólogos por conjugação, uma abordagem de transferência de DNA comum na natureza. O vetor mini-CTX permitiu a integração de todo o Cascade ao conservado attB locus genético no genoma dos hospedeiros heterólogos, permitindo-lhes abrigar um sistema "nativo" tipo I-F CRISPR-Cas que pode ser expresso de forma estável e funcionar.

p A equipe mostrou que o tipo I-F Cascade transferido exibe uma capacidade de interferência de DNA significativamente maior e maior estabilidade de cepa do que o sistema Cas9 transferível e pode ser empregado para edição de genoma com eficiência (> 80%) e simplicidade, isto é, por uma transformação em uma etapa de um único plasmídeo de edição.

p Além disso, eles desenvolveram um sistema transferível avançado que inclui uma cascata de tipo I-F altamente ativa e uma recombinase para promover a aplicação do sistema em cepas com uma capacidade de recombinação homóloga pobre, selvagem P. aeruginosa isola sem informação de sequência do genoma, e em outro Pseudomonas espécies.

p Por último, os genes do tipo I-F Cascade introduzidos podem ser facilmente removidos dos genomas do hospedeiro através da deleção mediada por I-F Cascade de grandes fragmentos de DNA, resultando na edição do genoma sem cicatrizes nas células hospedeiras. A aplicação do sistema transferível para repressão gênica também foi demonstrada, destacando as aplicações robustas e diversas do sistema transferível I-F CRISPR desenvolvido.

p O Dr. Aixin Yan previu que este novo método será estendido para editar não apenas patógenos, mas também microbioma para promover a saúde humana.

p Acreditamos que a tecnologia e as terapias baseadas em CRISPR trarão novas esperanças para combater superbugs no futuro . "

Dr. Aixin YAN, Professor adjunto, Divisão de Pesquisa para Biologia Molecular e Celular, Faculdade de Ciência, A Universidade de Hong Kong

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