Genomisk karakterisering av en Helicobacter pylori isolat från en patient med magcancer i Kina

Genomisk karakterisering av en Helicobacter pylori
isolera från en patient med magcancer i Kina Bild Sammanfattning
Bakgrund
Helicobacter pylori
är välkänt för sin relation med förekomsten av flera allvarliga gastric sjukdomar. Mekanismerna för patogenes utlöses av H. pylori
är mindre kända. I denna studie rapporterar vi genomsekvensen och iska beskrivningar av H. pylori
stam HLJ039 som isolerades från en patient med magcancer i den kinesiska provinsen Heilongjiang, där det finns en hög förekomst av magcancer. För att undersöka potentiella iska funktioner som kan vara inblandade i patogenes av cancer, var genomet jämfört med tre tidigare sekvenserade genom inom detta område.
Resultat
Vi fick 42 kontiger med en total längd på 1.611.192 bp och förutspådde 1,687 kodande sekvenser . Jämfört med stammar som isolerats från gastrit och sår i detta område, var 10 olika regioner identifierats som unika för HLJ039; de huvudsakligen kodad typ II restriktions ändring enzym, typ II M6A metylas, DNA-cytosin metyltransferas, DNA-metylas, och hypotetiska proteiner. En unik 547-bp fragment som delar 93% identitet med ett hypotetiskt protein av Helicobacter cinaedi
ATCC BAA-847 inte var närvarande i någon annan tidigare H. pylori
stammar. Fylogenetisk analys baserad på kärn genomet single nucleotide polymorphisms visar att HLJ039 definieras som hspEAsia grupp, som hör till hpEastAsia gruppen.
Slutsats
DNA metyleringar, variationer av genom regioner som deltar i restriktions och modifieringssystem, är " heta "områden som kan ha samband med mekanismen för H. pylori
inducerad magsäckscancer. Genomsekvensen kommer att ge värdefull information för djup utvinning av potentiella mekanismer i samband med östasiatisk magsäckscancer
Nyckelord
Helicobacter pylori
Magcancer Nästa generations sekvense Genomic har bakgrund.
Helicobacter pylori
, en gramnegativ bakterie som koloniserar i människans mage, har allmänt erkänd som en patogena bakterier i samband med patogenesen av gastrit, magsår och cancer [1-3]. Den höga genetiska variationen av H. pylori
driver sin dramatiska förmåga att anpassa sig till den gastric nisch [4-9]. Men även om många studier har utförts, dess mekanismer är fortfarande inte väl klarlagd.
Med den snabba utvecklingen av nästa generations sekvenseringsteknologi och minskade kostnader, har det blivit möjligt att utföra storskaliga genomet sekvense förfaranden för att få gott om information om biologiska befolkningsstrukturen och sjukdomsmarkörer. Under de senaste åren har allt fler H. pylori
stammar från olika geografiska regioner, etniska grupper, och sjukdomar sekvenserats [10-12], och åtminstone 50 genomsekvenser är för närvarande tillgängliga i offentliga databaser.
en tidigare studie, publicerade vi genomsekvenser av tre stammar som återvunnits från patienter med sår och atrofisk gastrit i Heilongjiangprovinsen [13]. Det är väl känt att H. pylori
stammar som isolerats från olika geografiska områden visar dramatiska genomisk mångfald [14]. Således, på genomisk nivå, jämförande analys bland stammar med olika kliniska manifestationer bör inledningsvis eliminera sådana störningar. Jämförande genomisk sekvenseringsanalys av stammar som isolerats från enskilda patienter kan vara ett tillförlitligt sätt att eliminera sådana störningar [15-17]. Det är dock vanligtvis svårt att följa en patient och erhålla stammar som isolerats från olika oförutsägbara manifestationer.
I denna studie, rapporterade vi ett förslag genomsekvens av stammen HLJ039 som isolerades från en patient med magcancer i Heilongjiang-provinsen. Efter integration med de andra tre genomen från samma område, var första jämförande genomisk analys för att undersöka genetiska särdrag av magcancer isolat.
Metoder
Stam val
HLJ039 isolerades från en 84-årig man med dåligt differentierad mage kropp cancer. Även om vissa andra magkarcinom relaterade H. pylori
stammar som isolerats från olika områden, etniska, och befolkningar i världen finns i offentliga databaser, vi inte välja dessa stammar för vår jämförande analys. Den komplexa stammen bakgrunden kommer att göra det mycket svårt att identifiera tillförlitliga iska egenskaper som kan bidragit till en viss sjukdom som magcancer. Som sådan kan analysera ett specifikt geografiskt område, etnicitet, eller befolkningen vara ett mer förnuftigt sätt att hitta potentiella ledtrådar relaterade till specifika sjukdomar. Därför, i denna studie, valde vi bara tre stammar som isolerats från Heilongjiang-provinsen för jämförande analys. Dessa stammar är mycket representativ eftersom Heilongjiang-provinsen har en hög förekomst av mag sjukdomar i Kina, särskilt för magcancer. Dessutom kinesiska Heilongjiang-provinsen är nära Korea och Japan. Dessa östasiatiska länder har enligt uppgift den högsta förekomsten av magcancer i världen [18, 19].
Etik godkännande
Denna forskning godkändes av stämman etisk kommitté för nationella institut för smittskydd och förebyggande, Kina CDC, enligt kinesisk etiska lagar och förordningar. NR:. ICDC-2013001
Genome sekvensering och annotering
Stammen isolerades från magslemhinnan och odlades på Columbia agar bas kompletterat med 5% fårblod. DNA extraherades såsom tidigare beskrivits [20]. För varje stam, var hel-genomsekvensering utfördes med användning av en Illumina Hiseq 2000 genom att generera parade-end bibliotek (500 bp och 2 kb) följande tillverkarens instruktioner. READ längder var 90 bp och 50 bp för varje bibliotek, där mer än 100 MB data av hög kvalitet skapades. Den parade slut läser från de två biblioteken var de novo monteras ställningar med hjälp av SOAPdenovo (http:... //Tvål genomik org cn). Gen förutsägelse utfördes med användning av Glimmer. TRNA-generna söktes genom tRNAScan-SE2, medan rRNA gener söktes genom RNAmmer3. Protein BLAST4 kördes med användning av de översatta kodande sekvenser som en fråga mot referenssekvensen (H. pylori
stam 51).
Genomet ytterligare kommenterad och funktionellt kategoriserade efter Rapid Notering använder Subsystem Technology (RAST). En delsystem är en uppsättning av funktionella roller som en annotator har beslutat är relaterade. Delsystem representerar ofta insamling av funktionella roller som utgör en metabolisk väg, komplex, eller proteinklass [21].
Initial jämförande genomisk och fylogenetisk analys
att identifiera eventuella områden som kan vara inblandade i patogenesen av magcancer, MAUVE användes för att jämföra HLJ039 med ytterligare tre isolat som återvunnits från samma område [22]. Såsom beskrivits tidigare, var HLJ271 återhämtat sig från en patient med magsår. HLJ193 och HLJ256 utvanns från patienter med atrofisk gastrit. Olika regioner (DRS) av HLJ039 märktes längs dess kromosom läge. DR se kodande sekvens (CDS) insättning och deletion i HLJ039 jämfört med de andra tre genom.
Att definiera fylogenetiska karakterisering av HLJ039 använda den allmänt tillgängliga H. pylori
genomsekvenser, 53 hela genomsekvenser extraherades från GenBank för fylogenetiska träd konstruktion (Ytterligare fil 1). P12 användes som en referens genom. Jämförelser gjordes med användning av nucmer programmet från MUMMER3 implementeras i Panseq [23]. Genomen fragmenterades i 500-bp segment som måste vara närvarande i alla 54 genomen som ska ingå i kärngenomet. Horisontellt överförda gener har vanligtvis hög genetisk mångfald bland olika stammar, exempelvis plasticiteten zoner, som kodar typ IV sekretionssystem, R-M-system, eller överlåtbara iska öarna. Enligt principen om fler inriktning med hjälp av Panseq skulle dessa potentiella horisontella gener tas bort från kärngener. Single nucleotide polymorphisms (SNP) i kärn genomen bestäms och används för att generera en phylip-formaterad fil. Konkatenerade SNP i längd av 29259-bp användes för att konstruera ett fylogenetiskt träd med hjälp av granne-sammanfogningsmetod i MEGA5. Bootstrap metod användes för att utvärdera stabiliteten hos de fylogenetiska relationer.
Genetiska data avsättning Review, är detta hela genomet hagelgevär projektet har deponerats vid DDBJ /EMBL /GenBank under accessionsnummer JAAA00000000, medan version JAAA01000000 beskrivs i detta dokument.
Kvalitetssäkring
genomiskt DNA extraherades från en ren odlade H.pylori
stam och bekräftades med användning av konventionella biokemiska tester (positiva för ureas, katalas, och oxidas). RAST-servern användes för att utvärdera potentiella heterogena föroreningar.
Initiala fynd
Vi slutligen erhållna 42 kontiger med en total längd på 1.611.192 bp och förväntade 1,687 CDS inom utkastet genomet av stammen HLJ039. Ytterligare information finns i sekvense rapporter HLJ039 (extra fil 2). G + C-halt var 38,72%. Fördelningen delsystem och allmän information om den potentiella funktionella fördelningen av HLJ039 visas i figur 1. Jämfört med de ytterligare tre HLJ genomen, HLJ039 har 10 olika regioner (DRS). Detaljerad information om dessa fragment visas i tabell 1. Placeringen av dessa DR märks i hela genomet (Figur 2). Ungefär hälften av dessa sekvenser kodade hypotetiska proteiner. De flesta av de DR-sekvenser kodade proteiner involverade i DNA-metylas och ett restriktions modifiering enzym. Noterbart var en unik 547-bp fragment (DR9) delar 93% identitet med ett hypotetiskt protein av Helicobacter cinaedi
ATCC BAA-847 funnit att aldrig hade varit närvarande i andra H. pylori
stammar tidigare, vilket indikerade en möjlig horisontell genöverföring mellan H. pylori Mössor och H. cinaedi
. DR9, som ligger i byggnadsställning 5, införs i en 1371-bp-genen som kodar för typ III-restriktionsendonukleas, som är ansvarig för adenin-specifik DNA-metylas modifieringar. Figur 1 Subsystem statistiken av Helicobacter pylori stam HLJ039 genereras av snabb anteckning med hjälp av delsystem teknik server.
Tabell 1 Grundläggande information om de olika regionerna (DRS) i HLJ039
DR
Start
End
Gene beskrivning
DR1
145.736
180.926
25 hypotetiska proteiner, VirB4, DNA topoisomeras i, para, rörligt element protein, första ORF i transposon ISC1904
DR2
618.752
619.703
fukosyltransferas
DR3
740131
740654
Hypotetiskt protein
DR4
1200420
1202309
Hypotetiskt protein
DNA-cytosin metyltransferas
DR5
1254233
1256053
hypotetiskt protein
DR6
1335551
1337398
Typ II M6A metylas (hinFIM) Review hypAIVR
DR7
1393932
1394805
hypotetiskt protein
DR8
1443251 1445196
typ II DNA-modifiering enzym
hypotetiskt protein
DR9
1484058
1484604
hypotetiskt protein som delar 93% identitet med ett fragment av Helicobacter cinaedi
ATCC BAA-847
DR10
1.538.060
1.539.662
Typ IIG begränsning och modifiering enzym
Figur 2 Genome anpassning av magcancer isolera HLJ039 med icke-carcinoma isolat.
Samtliga ovanstående slutsatser belysa den viktiga roll som DNA-restriktionsmodifieringssystem i H. pylori
genomisk rekombination. Totalt 29,259 kärn SNP återfanns bland de 54 analyserade genomsekvenser. Baserat på en kärna genom SNP-analys av 54H. pylori
stammar fördelade i olika delar av världen, var ett fylogenetiskt träd som genereras för att visa HLJ039 subtyp. Alla stammar indelades i olika grupper som definieras av tidigare studier enligt multilocus sekvens typning [24, 25]. Figur 3 visar att HLJ039 definierades som tillhör den hspEAsia undergrupp, som tillhörde den hpEastAsia gruppen. Figur 3 fylogenetisk analys av 54 Helicobacter pylori stammar baserat på deras kärn genomet single nucleotide polymorphisms.
Obs: Olika regioner (DRS) hänvisar till kodande sekvens insättning och deletion i HLJ039 jämfört med de andra tre genomen
Framtida riktningar
Förekomsten av magcancer i östasiatiska länder är ganska hög [18, 19. ]. För att undersöka de potentiella patogena mekanismer som kan bidra till detta fenomen, pylori mer östasiatisk H.
stammar måste först sekvenseras. Stammarna som valts ut för sekvensering bör vara representativa och eliminera geografisk variation. Våra framtida inriktningar kommer att fokusera på storskalig genomisk sekvensering av olika kliniska isolat från områden med en hög förekomst av magcancer. Mer detaljerade analyser som är involverade i DNA-metylering liksom restriktions och modifieringssystem skulle vara de mest attraktiva riktningar för studier av H. pylori
inducerad magsäckscancer.
Samtycke
Skriftligt informerat samtycke erhölls från patienten för offentliggörandet av denna rapport och eventuella tillhörande bilder.
Tillgång till underlag
ytterligare data som stöder de resultat som rapporteras här ingår i de ytterligare filer.
förklaringar
Tack
detta arbete stöddes av en fond för Kina Mega-Projekt för Infectious Disease (2011ZX10004-001) och ett bidrag från National Technology R &. D Program i den 12: e femårsplanen Kina (2012BAI06B02) Review Electronic kompletterande material
13099_2014_126_MOESM1_ESM. doc Ytterligare fil 1: Allmän information om de allmänt tillgängliga genomen (dOC 60 KB) 13099_2014_126_MOESM2_ESM.doc Ytterligare fil 2:.. Assembly information HLJ039 (dOC 27 KB) Författare "ursprungliga inlämnade handlingarna Images of Nedan finns länkar till författarnas original lämnat filer för bilder. 13099_2014_126_MOESM3_ESM.tiff Författaroriginalfilen för figur 1 13099_2014_126_MOESM4_ESM.tiff Författaroriginalfilen för figur 2 13099_2014_126_MOESM5_ESM.tiff Författaroriginalfilen för figur 3 konkurrerande intressen
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Författare " bidrag
YY utförde bioinformatik analys och skrev manuskriptet; MZ och LH var ansvariga för bakterier isolering och identifiering; LL, XH och YZ utfört genomisk sekvensering, JZ och PN utformade studien och gav ekonomiskt stöd för detta arbete. Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• Adjuvant chemo-strålning för adenocarcinom: en institutionell experience
• Ett fall av metastaserande leptomeningeal karcinomatos från gastric carcinoma