Caracterización genómica de un Helicobacter pylori aislado de un paciente con cáncer gástrico en China

Caracterización genómica de un Helicobacter pylori
aislar de un paciente con cáncer gástrico en
Resumen de China
Antecedentes
Helicobacter pylori
es bien conocido por su relación con la aparición de varias enfermedades gástricas severas. Los mecanismos de patogénesis provocada por H. pylori
son menos conocidos. En este estudio, se presenta la secuencia del genoma y caracterizaciones genómicas de H. pylori
HLJ039 cepa que se aisló de un paciente con cáncer gástrico en la provincia china de Heilongjiang, donde hay una alta incidencia de cáncer gástrico. Para investigar las posibles características genómicas que pueden estar implicados en la patogénesis del carcinoma, el genoma se comparó con tres genomas previamente secuenciados en esta área. Cruise Result
Obtuvimos 42 contigs con una longitud total de 1.611.192 pb y predijimos 1.687 secuencias de codificación . En comparación con las cepas aisladas de la gastritis y úlceras en esta área, 10 regiones diferentes fueron identificados como única para HLJ039; que codifican principalmente enzima de restricción de tipo II-modificación, tipo II metilasa M6a ADN metiltransferasa-citosina, metilasa de ADN y proteínas hipotéticas. Un único fragmento de 547 pb que compartir el 93% de identidad con una proteína hipotética de Helicobacter Cinaedi
ATCC BAA-847 no estaba presente en cualquier otro H. pylori
cepas anteriores. El análisis filogenético basado en el genoma de polimorfismos de nucleótido único núcleo muestra que HLJ039 se define como hspEAsia subgrupo, que pertenece al grupo hpEastAsia.
Conclusión
metilaciones de ADN, las variaciones de las regiones genómicas que participan en los sistemas de restricción y modificación, son el " "regiones calientes que pueden estar relacionados con el mecanismo de cáncer gástrico inducida por H. pylori
. La secuencia del genoma proporcionará información útil para la extracción de minerales de los mecanismos potenciales relacionados con el cáncer gástrico de Asia Oriental.
Palabras clave
Helicobacter pylori
El cáncer gástrico secuenciación de nueva generación Genómica ofrece el fondo
Helicobacter pylori
, una bacteria Gram-negativa que coloniza en el estómago humano, ha sido ampliamente reconocido como una bacteria patógena relacionados con la patogénesis de la gastritis, úlceras, y carcinoma [1-3]. La alta variabilidad genética de H. pylori
impulsa su capacidad dramática para adaptarse al nicho gástrico [4-9]. Sin embargo, aunque se han realizado muchos estudios, sus mecanismos están aún bien dilucidado. Vaya con el rápido desarrollo de la próxima generación de la tecnología de secuenciación y reducción de costos, se ha hecho posible llevar a cabo procedimientos gran escala de secuenciación del genoma para obtener una amplia información acerca estructura de la población y las enfermedades biológicas marcadores. En los últimos años, cada vez más cepas de H. pylori
de diferentes regiones geográficas, etnias y enfermedades se han secuenciado [10-12], y al menos 50 secuencias del genoma son actualmente disponibles en bases de datos públicas.
un estudio anterior, hemos publicado secuencias del genoma de tres cepas aisladas de pacientes con úlceras y gastritis atrófica en la provincia de Heilongjiang [13]. Es bien sabido que H. pylori
cepas aisladas de diferentes áreas geográficas muestran diversidad genómica dramático [14]. Por lo tanto, a nivel genómico, análisis comparativo entre las cepas con diferentes manifestaciones clínicas inicialmente debería eliminar tal interferencia. Análisis comparativo de secuenciación genómica de las cepas aisladas de pacientes individuales podría ser una manera confiable para eliminar tales interferencias [15-17]. Sin embargo, por lo general es difícil de seguir un paciente y obtener cepas aisladas de diversas manifestaciones impredecibles.
En este estudio, se informó de un proyecto de secuencia del genoma de la cepa HLJ039 que fue aislado de un paciente con cáncer gástrico en la provincia de Heilongjiang. Después de la integración con los otros tres genomas de la misma área, se llevó a cabo análisis genómico comparativo inicial para investigar las características genéticas de los aislados de cáncer gástrico.
Métodos
selección de cepas
HLJ039 fue aislado de 84 años de edad hombre con cáncer de estómago cuerpo pobremente diferenciado. Aunque algunas otras cepas de H. pylori
gástricas relacionadas con carcinoma-aisladas de diferentes áreas, etnias y poblaciones del mundo están presentes en bases de datos públicas, no hemos seleccionado estas cepas para nuestro análisis comparativo. La cepa de fondo compleja hará que sea muy difícil la identificación de las características genómicas fiables que pueden ser aportados a una enfermedad específica como el cáncer gástrico. Como tal, el análisis de una región geográfica específica, etnia o población puede ser una manera más sensata para encontrar posibles pistas relacionadas con enfermedades específicas. Por lo tanto, en este estudio, se seleccionaron tres cepas aisladas de la provincia de Heilongjiang para el análisis comparativo. Estas cepas son muy representativo porque la provincia de Heilongjiang tiene una alta incidencia de enfermedades gástricas en China, especialmente para el cáncer gástrico. Además, la provincia china de Heilongjiang está cerca de Corea y Japón. Estos países de Asia oriental se informa, tienen la mayor incidencia de cáncer gástrico en todo el mundo [18, 19].
Ética aprobación
Esta investigación fue aprobado por la reunión del comité de ética del Instituto Nacional para el control de las enfermedades transmisibles y la prevención, China CDC, de acuerdo con las leyes y reglamentos de ética chinos. Nº. CIDC-2013001
secuenciación y anotación de genomas Francia El cepa fue aislada de la mucosa gástrica y se cultivaron en agar Columbia suplementado con base de sangre de carnero al 5%. Se extrajo el ADN como se describe anteriormente [20]. Para cada cepa, la secuenciación de todo el genoma se realizó utilizando un Illumina HiSeq 2000 por bibliotecas de gama emparejado generadores (500 pb y 2 kb) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las longitudes de lectura eran 90 pb y 50 pb para cada biblioteca, a partir del cual se generaron más de 100 Mb de datos de alta calidad. La gama emparejado lee de las dos bibliotecas de novo fueron montados en andamios utilizando SOAPdenovo (http:... //Jabón genómica org cn). La predicción de genes se realizó con luz tenue. Los genes de ARNt se buscaron por tRNAScan-SE2, mientras que los genes rRNA se buscaron por RNAmmer3. BLAST4 proteína se realizó utilizando las secuencias de codificación traducidas como una consulta en la secuencia de referencia (H. pylori cepa
51). Francia El genoma fue anotado más y funcionalmente categorizada por rápida anotación utilizando Subsistema Tecnología (RAST). Un subsistema es un conjunto de roles funcionales que un anotador ha decidido están relacionados. Subsistemas representan con frecuencia la colección de papeles funcionales que componen una ruta metabólica, complejo, o una clase de proteínas [21].
Comparativa análisis genómico y filogenético
inicial para identificar posibles regiones que pueden estar implicados en la patogénesis del cáncer gástrico, MAUVE se utilizó para comparar HLJ039 con tres aislados adicionales recuperados de la misma zona [22]. Como se describió previamente, HLJ271 se recuperó de un paciente con úlcera gástrica. HLJ193 y HLJ256 fueron recuperados de pacientes con gastritis atrófica. Diferentes regiones (DR) de HLJ039 se marcaron a lo largo de su localización cromosómica. DRs se refiere a la secuencia de codificación (CDS) de inserción y deleción en HLJ039 en comparación con los otros tres genomas.
A definir la caracterización filogenética de HLJ039 usando el H. pylori a disposición del público
secuencias del genoma, 53 secuencias de todo el genoma se extrajeron de GenBank para la construcción del árbol filogenético (archivo adicional 1). P12 se utilizó como un genoma de referencia. Las comparaciones se realizaron utilizando el programa de nucmer MUMMER3 implementado en Panseq [23]. Genomas se fragmentaron en segmentos de 500 pb que tenían que estar presentes en los 54 genomas que han de incluirse en el núcleo del genoma. los genes transferidos horizontalmente por lo general tienen una alta diversidad genética entre las diferentes cepas, por ejemplo, las zonas de plasticidad, que los sistemas de secreción tipo IV de codificación, sistemas de R-M, o islas genómicas transferibles. De acuerdo con el principio de alineación múltiple por el uso de Panseq, estos genes horizontales potenciales se eliminan de los genes esenciales. polimorfismos de nucleótido único (SNP) en los genomas centrales están determinados y se utilizan para generar un archivo con formato Phylip. SNPs concatenados de longitud de 29.259 pb se utilizaron para construir un árbol filogenético mediante el método de vecino a participar en MEGA5. método de arranque se utilizó para evaluar la estabilidad de las relaciones filogenéticas.
deposición de datos genómicos
Todo este proyecto del genoma escopeta se ha depositado en DDBJ /EMBL /GenBank con el número de JAAA00000000, mientras que la versión JAAA01000000 se describe en este documento. La garantía de calidad
Francia El ADN genómico fue extraído a partir de una cepa cultivada H. pylori pura
y confirmado mediante pruebas bioquímicas convencionales (positivos para la ureasa, catalasa y oxidasa). El servidor RAST se utilizó para evaluar posibles contaminaciones heterogéneos.
Hallazgos inicial ¿En última instancia, obtuvimos 42 contigs con una longitud total de 1.611.192 pb y predijo 1.687 CDS dentro del proyecto genoma de la cepa HLJ039. Información adicional se incluye en los informes de secuenciación de HLJ039 (archivo adicional 2). El contenido de G + C fue de 38,72%. El Subsistema de distribución e información general sobre la distribución potencial funcional de HLJ039 se muestra en la Figura 1. En comparación con los tres genomas adicionales HLJ, HLJ039 tiene 10 regiones diferentes (DRS). La información detallada acerca de estos fragmentos se muestra en la Tabla 1. La ubicación de estos proyectos de resolución se etiquetan en todo el genoma (Figura 2). Aproximadamente la mitad de estas secuencias codifica proteínas hipotéticas. La mayor parte de las secuencias de DR proteínas implicadas en la metilasa de ADN y una enzima de modificación de la restricción codificados. En particular, se encontró un fragmento de 547-bp único (DR9) compartiendo 93% de identidad con una proteína hipotética de Helicobacter Cinaedi
ATCC BAA-847 que nunca había estado presente en cualquier otro H. pylori
cepas anteriormente, que se indica una posible transferencia horizontal de genes entre H. pylori y H.
Cinaedi
. DR9, situada en andamio 5, se inserta en un tipo III endonucleasa de restricción 1371 pb del gen de codificación, que es responsable de las modificaciones metilasa de ADN-adenina específica. Figura 1 Las estadísticas de distribución del subsistema de Helicobacter pylori HLJ039 tensión generada por la rápida anotación utilizando el servidor tecnología del subsistema.
Tabla 1 Información básica sobre las diferentes regiones (DRS) en HLJ039
DR Linguee Comienza
End
Gen Descripción
DR1
145736 180926

25 proteínas hipotéticas, VirB4, la ADN topoisomerasa I, párrafo, proteínas elemento móvil, primer ORF en transposón ISC1904
DR2
618.752 619.703

fucosiltransferasa
DR3
740.131 740.654

proteína hipotética
DR4
1.200.420 1.202.309

proteína hipotética
ADN metiltransferasa-citosina
DR5
1.254.233 1.256.053

proteína hipotética
DR6
1.335.551 1.337.398

Tipo II metilasa M6A (hinFIM)
hypAIVR
DR7
1.393.932 1.394.805

proteína hipotética
DR8
1.443.251 1.445.196

Tipo enzima de modificación de ADN II
proteína hipotética
DR9
1.484.058 1.484.604

proteína hipotética compartir el 93% de identidad con un fragmento de Helicobacter Cinaedi
ATCC BAA-847
DR10
1.538.060 1.539.662

restricción de tipo IIG y la enzima de modificación
Figura 2 genoma alineación de carcinoma gástrico aislar HLJ039 con carcinoma no aislados.
totalidad de los hallazgos ponen de relieve la importancia del papel de los sistemas de modificación de restricción de ADN en H. pylori
recombinación genómica. Un total de 29,259 SNPs centrales se encontraron entre los 54 secuencias del genoma analizados. Sobre la base de un análisis de núcleos SNP del genoma de 54H. pylori
cepas distribuidas en varias regiones del mundo, un árbol filogenético se generó para mostrar el subtipo HLJ039. Todas las cepas se clasifican en diferentes grupos definidos por estudios anteriores de acuerdo con la secuencia de multilocus escribiendo [24, 25]. La Figura 3 muestra que HLJ039 se define como perteneciente al subgrupo hspEAsia, que pertenecía al grupo hpEastAsia. Figura 3 El análisis filogenético de las cepas de Helicobacter pylori 54 sobre la base de sus núcleo del genoma polimorfismos de nucleótido único.
Nota: Las diferentes regiones (DRS) se refiere a la codificación de secuencia de inserción y deleción en HLJ039 en comparación con los otros tres genomas
Direcciones futuras
La incidencia de carcinoma gástrico en los países de Asia oriental es bastante alto [18, 19. ]. Para explorar los potenciales mecanismos patogénicos que pueden contribuir a este fenómeno, más de Asia Oriental por H. pylori
cepas deben primero ser secuenciados. Las cepas seleccionadas para la secuenciación deben ser representativos y eliminar la variación geográfica. Nuestras direcciones futuras se centrarán en gran escala de secuenciación genómica de diferentes aislados clínicos de áreas con una alta incidencia de cáncer gástrico. Análisis más detallados implicados en la metilación del ADN, así como sistemas de restricción y modificación serían las direcciones más atractivas para los estudios de H. pylori
cáncer gástrico inducida.
Consentimiento
consentimiento informado por escrito del paciente para la la publicación de este informe y cualquier imagen que se acompañan.
disponibilidad de datos de apoyo
datos adicionales que apoyan los resultados que aquí se incluyen dentro de los archivos adicionales.
Declaraciones
Agradecimientos
este trabajo fue apoyado por un fondo para China Mega-Proyecto de Enfermedades Infecciosas (2011ZX10004-001) y una beca de la Tecnología Nacional de I &. Programa D en el plan de Cinco años 12 de China (2012BAI06B02)
material complementario Electrónico
13099_2014_126_MOESM1_ESM. doc archivo adicional 1: información general para los genomas disponibles públicamente (DOC 60 KB) 13099_2014_126_MOESM2_ESM.doc archivo adicional 2:.. la información Asamblea para HLJ039 (DOC 27 KB) Autores "original presentado archivos de imágenes
a continuación se presentan los enlaces a original de los autores presentó archivos de imágenes. 'archivo original para la figura 1 13099_2014_126_MOESM4_ESM.tiff autores 13099_2014_126_MOESM3_ESM.tiff Autores archivo original para la figura 2 13099_2014_126_MOESM5_ESM.tiff autores archivo original para la figura 3 Conflicto de intereses México La autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Autores' contribuciones
YY realizaron el análisis de la bioinformática y escribió el manuscrito; MZ y LH fueron responsables para el aislamiento e identificación de bacterias; LL, XH y YZ realizó la secuenciación genómica; JZ y PN diseñó el estudio y dieron apoyo financiero para este trabajo. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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