Genomische Charakterisierung einer Helicobacter pylori von einem Patienten mit Magenkrebs in Charakterisierung genomischer China

Isolat eines Helicobacter pylori
Isolat von einem Patienten mit Magenkrebs in China
Zusammenfassung
Hintergrund Helicobacter pylori ist
für seine Beziehung mit dem Auftreten mehrerer schwerer Magenerkrankungen bekannt. Die Mechanismen der Pathogenese von H. pylori ausgelöst Was sind weniger bekannt. In dieser Studie berichten wir über die Genomsequenz und genomische Charakterisierungen von H. pylori-Stamm
HLJ039, die von einem Patienten mit Magenkrebs in der chinesischen Provinz Heilongjiang isoliert wurde, wo es eine hohe Inzidenz von Magenkrebs ist. Um mögliche genomische Merkmale untersuchen, die in der Pathogenese von Karzinomen beteiligt sein können, wurde das Genom im Vergleich zu drei bisher in diesem Bereich sequenzierten Genomen.
Ergebnis
Wir erhalten 42 Contigs mit einer Gesamtlänge von 1.611.192 bp und vorhergesagten 1687 kodierenden Sequenzen . Im Vergleich zu Stämmen von Gastritis und Geschwüre in diesem Bereich isoliert, 10 verschiedene Regionen wurden für HLJ039 als einzigartig identifiziert; sie hauptsächlich Typ-II-Restriktions-Modifikationsenzym, Typ-II-m6A Methylase, DNA-Cytosin-Methyltransferase, DNA-Methylase und hypothetische Proteine ​​kodiert. Eine einzigartige 547-bp-Fragment 93% Identität mit einem hypothetischen Protein von Helicobacter cinaedi
ATCC BAA-847 zu teilen, war in allen anderen früheren H. pylori-Stämme
nicht vorhanden. Phylogenetische Analyse basierend auf Kerngenom single nucleotide polymorphisms zeigt, dass HLJ039 als hspEAsia Untergruppe definiert ist, die dem hpEastAsia Gruppe gehört.
Schlussfolgerung
DNA-Methylierungen, Variationen der genomischen Regionen in Restriktions- und Modifikationssysteme beteiligt sind, sind die " heiße "Bereiche, die auf den Mechanismus der H. pylori
-induzierten Magenkrebs in Zusammenhang stehen können. Die Genomsequenz wird nützliche Informationen für den Untertagebau potentieller Mechanismen zu ostasiatischen Magenkrebs im Zusammenhang liefern.
Schlüsselwörter Helicobacter pylori
Magenkrebs Next Generation Sequenzierung genomischer verfügt Hintergrund Helicobacter pylori
, ein Gram-negatives Bakterium, das im menschlichen Magen kolonisiert, wurde als pathogene Bakterien im Zusammenhang mit der Pathogenese von Gastritis, Geschwüre und Karzinom [1-3] weithin anerkannt. Die hohe genetische Variabilität von H. pylori
seiner dramatischen Fähigkeit treibt auf die Magen-Nische [4-9] anzupassen. Doch obwohl viele Studien durchgeführt wurden, sind ihre Mechanismen noch nicht gut aufgeklärt.
Mit der rasanten Entwicklung der nächsten Generation-Sequencing-Technologie und reduziert Kosten, wurde es möglich, in großem Maßstab Genomsequenzierungsverfahren zur Durchführung genügend Informationen darüber zu erhalten, biologische Bevölkerungsstruktur und Krankheitsmarker. In den letzten Jahren zunehmend mehr H. pylori
Stämme aus verschiedenen geographischen Regionen, Ethnien und Krankheiten sequenziert wurden [10-12], und mindestens 50 Genomsequenzen sind in öffentlichen Datenbanken verfügbar.
in einer früheren Studie, veröffentlicht wir Genomsequenzen von drei von Patienten mit Geschwüren und atrophische Gastritis in der Provinz Heilongjiang erholt Stämme [13]. Es ist bekannt, dass H. pylori
aus verschiedenen geografischen Gebieten zeigen dramatische genomischer Diversität isolierten Stämme [14]. Somit wird bei der genomischen Ebene, vergleichende Analyse unter den Stämmen mit unterschiedlichen klinischen Manifestationen sollte zunächst eine solche Störung zu beseitigen. Vergleichende genomische Sequenzanalyse von einzelnen Patienten isolierten Stämmen konnte eine zuverlässige Möglichkeit, solche Störungen zu beseitigen [15-17]. Allerdings ist es in der Regel schwierig ist, einen Patienten zu folgen und erhalten aus verschiedenen unvorhersehbaren Manifestationen isolierten Stämmen.
In dieser Studie berichteten wir einen Entwurf Genomsequenz von Stamm HLJ039, die von einem Patienten mit Magenkrebs in der Provinz Heilongjiang, wurde isoliert. Nach der Integration mit den anderen drei Genome aus dem gleichen Gebiet, erste vergleichende wurde genomische Analyse durchgeführt, die genetischen Merkmale von Magenkrebs zu untersuchen Isolate.
Methoden
HLJ039
Selection Der Stamm wurde von einem 84-jährigen isoliert Mann mit schlecht differenzierten Magen Körper Krebs. Obwohl einige andere Magenkarzinom bezogenen H. pylori
aus verschiedenen Bereichen isolierten Stämme, Ethnien und Bevölkerungen der Welt in öffentlichen Datenbanken vorhanden sind, haben wir nicht diese Stämme für unsere vergleichende Analyse auswählen. Der Komplex Stamm Hintergrund wird es sehr schwierig, zuverlässige genomischer Merkmale zu identifizieren, die auf eine bestimmte Krankheit wie Magenkrebs beigetragen werden kann. Als solches kann ein sinnvoller Weg sein, eine bestimmte geografische Region, der ethnischen Zugehörigkeit oder Bevölkerung Analyse auf bestimmte Krankheiten im Zusammenhang mit potenziellen Hinweise zu finden. Daher wird in dieser Studie wählten wir nur drei Stämme aus der Provinz Heilongjiang für die vergleichende Analyse isoliert. Diese Stämme sind sehr repräsentativ, weil der Provinz Heilongjiang eine hohe Inzidenz von Magenerkrankungen in China hat, vor allem für Magenkrebs. Darüber hinaus ist die chinesische Provinz Heilongjiang in der Nähe von Korea und Japan. Diese Ost-asiatischen Ländern angeblich die höchste Inzidenz von Magenkrebs haben weltweit [18, 19].
Ethik Genehmigung
Diese Arbeit wurde von der Sitzung der Ethikkommission der Landesanstalt für übertragbare Krankheitskontrolle und Prävention genehmigt wurde, China CDC, nach dem chinesischen Ethik Gesetze und Vorschriften. NO:. ICDC-2013001
Genom-Sequenzierung und Annotation
Der Stamm von Magenschleimhaut und kultiviert auf Columbia-Agar-Basis mit 5% Schafblut ergänzt wurde isoliert. DNA wurde wie zuvor beschrieben extrahiert [20]. Für jeden Stamm wurde Gesamt-Genom-Sequenzierung unter Verwendung eines Illumina HiSeq 2000 durch die Erzeugung Paired-End-Bibliotheken (500 bp und 2 kb) durchgeführt nach den Anweisungen des Herstellers. Die Leselängen betrugen 90 bp und 50 bp für jede Bibliothek, von denen mehr als 100 Mb von qualitativ hochwertigen Daten generiert wurde. Die Paired-End liest aus den beiden Bibliotheken wurden de novo in Gerüste montiert mit SOAPdenovo (http:... //Seife Genomik org cn). Gene Vorhersage wurde mit Glimmer durchgeführt. Die tRNA-Gene wurden durch tRNAScan-SE2 durchsucht, während die rRNA-Gene durch RNAmmer3 durchsucht wurden. Protein BLAST4 wurde unter Verwendung der übersetzten kodierenden Sequenzen als eine Abfrage der Referenzsequenz (H. pylori-Stamm
51) laufen.
Das Genom wurde weiter kommentiert und funktionell kategorisiert von Rapid Annotation mit Subsystem-Technologie (RAST). Ein Subsystem ist eine Reihe von funktionalen Rollen, die ein Kommentator hat beschlossen, in Zusammenhang stehen. Subsystemen häufig die Sammlung von funktionalen Rollen darstellen, die einen Stoffwechselweg, komplex oder Proteinklasse [21] zusammensetzen.
Erste vergleichende genomische und phylogenetische Analyse
Um mögliche Regionen zu identifizieren, die bei der Entstehung von Magenkrebs beteiligt sein können, MAUVE wurde verwendet HLJ039 mit drei zusätzlichen Isolaten aus dem gleichen Gebiet [22] gewonnen zu vergleichen. Wie zuvor beschrieben, wurde HLJ271 von einem Patienten mit Magengeschwüren gewonnen. HLJ193 und HLJ256 wurden von Patienten mit atrophischer Gastritis gewonnen. Verschiedene Regionen (NUE) von HLJ039 wurden entlang ihrer Chromosomen Lage gekennzeichnet. DRs siehe Sequenz (CDS) Einfügen und Löschen in HLJ039 zu Codierung im Vergleich zu den anderen drei Genome.
Um die phylogenetische Charakterisierung von HLJ039 mit der öffentlich zugänglichen H. pylori
Genomsequenzen, 53 ganze Genomsequenzen von extrahiert wurden definieren GenBank für phylogenetische Baum-Konstruktion (Weitere Datei 1). P12 wurde als Referenz-Genom verwendet. Vergleiche wurden mit dem nucmer Programm von MUMMER3 implementiert in Panseq [23] gemacht. Genomen wurden in 500-bp-Segmente zerlegt, die in allen 54 Genomen vorhanden sein musste im Kerngenom enthalten sein. Horizontal in der Regel übertragenen Gene zwischen verschiedenen Stämmen hohe genetische Vielfalt haben, zum Beispiel die Plastizität Zonen, die kodieren Typ IV Sekretion Systeme, R-M-Systemen oder übertragbar genomischen Inseln. Nach dem Prinzip der mehrfachen Ausrichtung durch die Verwendung von Panseq, diese potentiellen würden horizontal Gene aus den Kerngene entfernt werden. Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) in den Kern Genome ermittelt und verwendet, um eine Phylip-formatierte Datei zu erzeugen. Verketteten SNPs in Länge von 29.259 bp wurden unter Verwendung der Neighbor-Joining-Methode in MEGA5 einen phylogenetischen Baum zu konstruieren, verwendet. Bootstrap-Methode wurde verwendet, um die Stabilität der phylogenetischen Beziehungen zu beurteilen.
Genomische Daten Ablagerung
Dieser gesamte Genom Shotgun-Projekt hat bei DDBJ /EMBL /GenBank unter der Zugangsnummer JAAA00000000 hinterlegt worden, während Version JAAA01000000 wird in diesem Papier beschrieben.
Qualitätssicherung
Die genomische DNA wurde aus einem reinen kultivierten H. pylori
Stamm extrahiert und bestätigt herkömmlichen biochemischen Tests unter Verwendung von (positiv für Urease, Katalase und Oxidase). Der RAST Server wurde verwendet, um mögliche Kontaminationen heterogene bewerten.
Erste Ergebnisse
Wir haben 42 contigs letztlich mit einer Gesamtlänge von 1.611.192 bp erhalten und vorhergesagten 1687 CDS im Entwurf Genom des Stammes HLJ039. Weitere Informationen finden Sie in den Sequenzierungs Berichte von HLJ039 (Weitere Datei 2). Der G + C-Gehalt betrug 38,72%. Das Subsystem Verteilung und allgemeine Informationen über die mögliche funktionelle Verteilung der HLJ039 sind in Abbildung 1 auf die zusätzlichen drei HLJ Genome im Vergleich gezeigt, HLJ039 hat 10 verschiedene Regionen (NUE). Detaillierte Informationen zu dieser Fragmente ist in Tabelle 1 Die Standorte dieser DRs sind im gesamten Genom (Abbildung 2) markiert dargestellt. Etwa die Hälfte dieser Sequenzen kodiert hypothetischen Proteinen. Die meisten der DR-Sequenzen Proteine ​​in DNA-Methylase und einem Restriktionsmodifikationsenzym beteiligt codiert. Bemerkenswert ist, eine einzigartige 547-bp-Fragment (DS9) 93% Identität mit einem hypothetischen Protein von Helicobacter cinaedi
ATCC BAA-847 gefunden wurde, den Austausch, die nie zuvor in irgendwelchen anderen H. pylori-Stämme
anwesend waren, was anzeigte, eine mögliche horizontale Gentransfer zwischen H. pylori
und H. cinaedi
. DS9, in Gerüst 5, fügt in ein 1371-bp codierende Gen Typ III Restriktionsendonuklease, die für Adenin-spezifische DNA-Methylase Änderungen verantwortlich ist. Abbildung 1 Subsystem Verteilungsstatistik von Helicobacter pylori-Stamm HLJ039 durch die schnelle Annotation erzeugt unter Verwendung von Subsystem-Technologie-Server.
Tabelle 1 Grundlegende Informationen der verschiedenen Regionen (SCN) in HLJ039
DR Bei
starten
Ende
Genbeschreibungen
DR1
145.736
180.926
25 hypothetische Proteine, VirB4, DNA-Topoisomerase I, ParA, Mobil Element Protein, Erster ORF in Transposon ISC1904
DR2
618.752
619.703
Fucosyltransferase
DR3
740.131
740.654
hypothetisches Protein
DR4 1.200.420
1.202.309
hypothetisches Protein
DNA-Cytosin-Methyltransferase
DR5
1.254.233 1.256.053

hypothetisches Protein
DR6
1.335.551
1.337.398
Typ II m6A Methylase (hinFIM)
hypAIVR
DR7
1.393.932
1.394.805
hypothetisches Protein
DR8
1.443.251
1.445.196
Typ-II-Enzym DNA-Modifikation
hypothetisches Protein
DS9
1.484.058
1.484.604
hypothetisches Protein 93% Identität mit einem Fragment von Helicobacter cinaedi teilen
ATCC BAA-847
DR10
1.538.060
1.539.662
Typ IIG Einschränkung und Modifikationsenzym
Abbildung 2 Genome Ausrichtung des Magenkarzinoms isolieren HLJ039 mit nicht-Karzinom-Isolate.
Alle oben genannten Ergebnisse unterstreichen die wichtige Rolle der DNA-Restriktionsmodifikationssystemen in H. pylori
genomische Rekombination. Insgesamt 29.259 Kern SNPs wurden unter den 54 analysierten Genomsequenzen gefunden. Basierend auf einem Kern-Genom SNP-Analyse von 54H. pylori
in verschiedenen Regionen weltweit verteilt Stämme wurde ein Stammbaum erzeugt, um den HLJ039 Subtyp zu zeigen. Alle Stämme wurden in verschiedene Gruppen klassifiziert durch frühere Studien definiert gemäß multilocus Sequenz Typisierung [24, 25]. Abbildung 3 zeigt, dass HLJ039 als Angehörige der hspEAsia Untergruppe definiert wurde, die der hpEastAsia Gruppe gehörte. Abbildung 3 Die phylogenetische Analyse von 54 Stämmen Helicobacter pylori basierend auf ihr Kerngenom Einzelnukleotid-Polymorphismen.
Hinweis: Verschiedene Regionen (NUE) bezieht sich auf kodierenden Sequenz Einfügen und Löschen in HLJ039 im Vergleich zu den anderen drei Genome Zukunft Richtungen
Die Inzidenz von Magenkarzinom in ostasiatischen Ländern
recht hoch ist [18, 19. ]. Um die potentiellen pathogenen Mechanismen erforschen, die zu diesem Phänomen beitragen können, mehr ostasiatische H. pylori-Stämme
müssen zuerst sequenziert werden. Die Stämme für die Sequenzierung ausgewählt werden, sollten repräsentativ sein und geografische Variation zu eliminieren. Unsere zukünftige Ausrichtung konzentriert sich auf große genomische Sequenzierung von verschiedenen klinischen Isolate aus Gebieten mit einer hohen Inzidenz von Magenkrebs. Detailliertere sowie Restriktions- und Modifikationssysteme in der DNA-Methylierung beteiligt Analysen für Studien von H. pylori
-induzierten Magenkrebs die attraktivsten Richtungen wäre. Die Zustimmung
informiert
schriftliche Einwilligung des Patienten erhalten wurde die Veröffentlichung dieses Berichts sowie der zugehörigen Bilder.
Verfügbarkeit Daten unterstützen
zusätzliche Daten, die Ergebnisse unterstützen die hier berichtet werden innerhalb der zusätzlichen Dateien enthalten.
Erklärungen
Danksagung
Diese Arbeit wird unterstützt wurde ein Fonds für China Mega-Projekt für Infectious Disease (2011ZX10004-001) und einen Zuschuss von der National Technology R &. D-Programm im 12. Fünfjahresplan von China (2012BAI06B02) | Elektronische Zusatzmaterial
13099_2014_126_MOESM1_ESM. doc Weitere Datei 1: Allgemeine Informationen für die Öffentlichkeit zugänglich Genome (DOC 60 KB) 13099_2014_126_MOESM2_ESM.doc Weitere Datei. 2:. Montagehinweise für HLJ039 (DOC 27 KB) Autoren 'Original vorgelegt Dateien für Bilder
Nachfolgend finden Sie die Links zu Original vorgelegt Autoren Dateien für Bilder. 13099_2014_126_MOESM3_ESM.tiff Autoren Originaldatei für Abbildung 1 13099_2014_126_MOESM4_ESM.tiff Autoren Originaldatei für Abbildung 2 13099_2014_126_MOESM5_ESM.tiff Autoren Originaldatei für Abbildung 3 Konkurrierende Interessen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Autoren Beiträge
YY die bioinformatische Analyse und schrieb das Manuskript durchgeführt wird; MZ und LH waren für Bakterien Isolierung und Identifizierung verantwortlich; LL, XH und YZ ausgeführt genomische Sequenzierung; JZ und PN entwickelt, um die Studie und finanzielle Unterstützung für diese Arbeit. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

• Die adjuvante Chemotherapie und Bestrahlung für Adenokarzinom des Magens: eine institutionelle Erfahrung
• Ein Fall von metastasierendem leptomeningealen Karzinomatose vom frühen Magenkarzinom