caracterização genómica de um Helicobacter pylori isolado de um paciente com câncer gástrico na China

caracterização genómica de um Helicobacter pylori
isolar de um paciente com câncer gástrico na China
Abstract Background
Helicobacter pylori
é bem conhecido por sua relação com a ocorrência de várias doenças gástricas graves. Os mecanismos de patogênese desencadeada por H. pylori
são menos conhecidos. Neste estudo, relatamos a sequência do genoma e caracterizações genômicos de H. pylori
HLJ039 estirpe que foi isolada de um paciente com câncer gástrico na província chinesa de Heilongjiang, onde há uma alta incidência de câncer gástrico. Para investigar as características genéticas potenciais que podem estar envolvidos na patogênese do carcinoma, o genoma foi comparado com três genomas sequenciados anteriormente nesta área.
Resultado
Obtivemos 42 contigs com um comprimento total de 1.611.192 bp e previu 1.687 sequências codificadoras . Em comparação com cepas isoladas de gastrite e úlceras nesta área, 10 regiões diferentes foram identificados como sendo exclusivo para HLJ039; eles principalmente codificado Tipo II enzima de restrição-modificação, tipo II M6A metilase, metiltransferase DNA-citosina, metilase DNA e proteínas hipotéticas. Um único fragmento de 547 pb partilha 93% de identidade com uma proteína hipotética de Helicobacter cinaedi
ATCC BAA-847 não estava presente em todas as outras estirpes de H. pylori
anteriores. A análise filogenética com base no genoma polimorfismos de nucleotídeo único núcleo mostra que HLJ039 é definido como hspEAsia subgrupo, que pertence ao grupo hpEastAsia.
Conclusão
methylations DNA, variações das regiões genômicas envolvidas em sistemas de restrição e modificação, são o " regiões quentes "que podem estar relacionados ao mecanismo de câncer gástrico induzida por H. pylori
. A sequência do genoma irá fornecer informações úteis para a exploração mineira de potenciais mecanismos relacionados ao câncer gástrico do Leste Asiático.
Palavras-chave
Helicobacter pylori
O câncer gástrico próxima geração seqüenciamento genômico caracteriza o fundo
Helicobacter pylori
, uma bactéria Gram-negativa que coloniza no estômago humano, tem sido amplamente reconhecido como uma bactéria patogénicas relacionadas com a patogénese das gastrites, úlceras, e carcinoma de [1-3]. A elevada variabilidade genética de H. pylori
impulsiona a sua capacidade de se adaptar dramática para o nicho gástrica [4-9]. No entanto, embora muitos estudos têm sido realizados, seus mecanismos ainda não estão totalmente esclarecidos.
Com o rápido desenvolvimento da próxima geração de tecnologia de sequenciação e redução de custos, tornou-se possível realizar procedimentos genoma escala seqüenciamento grandes para obter ampla informação sobre marcadores biológicos estrutura populacional e da doença. Ao longo dos últimos anos, cada vez mais H. pylori
cepas de diferentes regiões geográficas, etnias e doenças já foram seqüenciados [10-12], e pelo menos 50 sequências do genoma estão atualmente disponíveis em bases de dados públicas.
Em um estudo anterior, publicado sequências do genoma de três cepas isoladas de pacientes com úlceras e gastrite atrófica, na província de Heilongjiang [13]. É bem sabido que a H. pylori
estirpes isoladas a partir de diferentes áreas geográficas mostram diversidade genómica dramática [14]. Assim, no nível genômico, a análise comparativa entre as cepas com diferentes manifestações clínicas devem, inicialmente, eliminar tais interferências. análise de sequenciação genómica comparativa das cepas isoladas de pacientes individuais poderia ser uma maneira de confiança eliminar tais interferências [15-17]. No entanto, geralmente é difícil de acompanhar um paciente e obter amostras isoladas de várias manifestações imprevisíveis.
Neste estudo, nós relatamos um projecto de sequência do genoma de HLJ039 estirpe que foi isolada de um paciente com câncer gástrico na província de Heilongjiang. Após a integração com os outros três genomas da mesma área, a análise genômica comparativa inicial foi realizada para investigar as características genéticas do câncer gástrico isolados.
Métodos
selecção Strain
HLJ039 foi isolada a partir de um 84-year-old homem com câncer corpo estômago pouco diferenciado. Embora alguns outros H. pylori
estirpes gástricos relacionados com carcinoma isoladas de diferentes áreas, etnias e populações do mundo estão presentes em bases de dados públicas, nós não selecionar estas estirpes para a análise comparada. A estirpe de fundo complexo vai torná-lo muito difícil identificar características genômicas confiáveis ​​que podem ser contribuíram para uma doença específica, como câncer gástrico. Como tal, a análise de uma específica região geográfica, etnia ou população pode ser uma maneira mais sensata para encontrar pistas potenciais relacionados a doenças específicas. Portanto, neste estudo, foram selecionados apenas três cepas isoladas da província de Heilongjiang para a análise comparativa. Essas cepas são muito representativa porque província de Heilongjiang tem uma alta incidência de doenças gástricas na China, especialmente para câncer gástrico. Além disso, a província chinesa de Heilongjiang está perto Coréia e Japão. Estes países do Leste Asiático supostamente têm a maior incidência de câncer gástrico em todo o mundo [18, 19].
Aprovação Ética
Esta pesquisa foi aprovada pela reunião do comitê de ética do Instituto Nacional de Controle de doenças transmissíveis e prevenção, China CDC, de acordo com as leis e regulamentos de ética chineses. NO:. ICDC-2013001
A sequenciação do genoma e anotação
A estirpe foi isolada da mucosa gástrica e cultivadas em base de agar Columbia suplementado com 5% de sangue de carneiro. O DNA foi extraído como descrito anteriormente [20]. Para cada cepa, todo o sequenciamento do genoma foi realizada utilizando um Illumina Hiseq 2000 por gerando bibliotecas-end emparelhado (500 pb e 2 kb) seguindo as instruções do fabricante. Os comprimentos de leitura foram de 90 pb e 50 pb para cada biblioteca, da qual mais de 100 MB de dados de alta qualidade foi gerado. A-end emparelhado lê as duas bibliotecas foram de novo montados em andaimes usando SOAPdenovo (http:... //Sabão genômica org cn). predição de genes foi realizada utilizando Glimmer. Os genes tRNA que foram pesquisados ​​por tRNAScan-SE2, enquanto os genes rRNA foram pesquisados ​​por RNAmmer3. Proteína BLAST4 foi executado usando as sequências codificadoras traduzido como uma consulta em relação à sequência de referência (H. pylori
estirpe 51).
O genoma foi ainda anotada e funcionalmente categorizados por rápida anotação usando Subsistema de Tecnologia (RAST). Um subsistema é um conjunto de papéis funcionais que um anotador decidiu estão relacionados. Subsistemas frequentemente representar a coleção de papéis funcionais que compõem uma via metabólica, complexo, ou classe de proteínas [21].
Inicial comparativa análise genômica e filogenética
Para identificar possíveis regiões que podem estar envolvidos na patogênese do câncer gástrico, MAUVE foi utilizado para comparar HLJ039 com três isolados adicionais recuperados a partir da mesma área de [22]. Como descrito anteriormente, HLJ271 foi recuperado a partir de um paciente com úlcera gástrica. HLJ193 e HLJ256 foram recuperadas a partir de pacientes com gastrite atrófica. Diferentes regiões (DRS) de HLJ039 foram marcadas ao longo de sua localização cromossomo. DRs referem-se a sequência de codificação (CDS) inserção e exclusão em HLJ039 em comparação com os outros três genomas.
Para definir a caracterização filogenética de HLJ039 usando o H. pylori publicamente disponível
sequências do genoma, 53 sequências do genoma inteiro foram extraídos GenBank para a construção de árvore filogenética (arquivo adicionais 1). P12 foi utilizado como um genoma de referência. As comparações foram feitas utilizando o programa nucmer de MUMMER3 implementado em Panseq [23]. Genomas foram fragmentados em segmentos de 500-pb que tinham de estar presentes em todos os 54 genomas de ser incluído no genoma do núcleo. genes horizontalmente transferidos geralmente têm alta diversidade genética entre diferentes estirpes, por exemplo, as zonas de plasticidade, qual o tipo de codificação sistemas de secreção IV, sistemas R-M, ou ilhas genômicas transferíveis. De acordo com o princípio do alinhamento múltiplo pelo uso de Panseq, estes genes potenciais horizontais seria removido a partir dos genes essenciais. polimorfismos de um único nucleótido (SNPs) em os genomas nucleares são determinados e usados ​​para gerar um ficheiro Phylip-formatado. SNPs concatenados de comprimento de 29259 pares de bases foram usadas para construir uma árvore filogenética utilizando o método de neighbor-joining em MEGA5. bootstrap foi utilizado para avaliar a estabilidade das relações filogenéticas.
deposição de dados genômicos
Todo este projeto genoma espingarda foi depositado na DDBJ /EMBL /GenBank sob o número de acesso JAAA00000000, enquanto a versão JAAA01000000 é descrito neste artigo.
garantia de qualidade
O DNA genômico foi extraído a partir de uma estirpe de cultura pura H. pylori
e confirmada por meio de testes bioquímicos convencionais (positivos para a urease, catalase e oxidase). O servidor RAST foi utilizado para avaliar potenciais contaminações heterogêneos.
Resultados iniciais
Nós, essencialmente obtidos 42 contigs com um comprimento total de 1.611.192 bp e previstos 1.687 CDS dentro do projecto de genoma de HLJ039 tensão. Informações adicionais são incluídos nos relatórios de sequenciamento de HLJ039 (arquivo adicionais 2). O teor G + C foi 38,72%. A distribuição subsistema e informações gerais sobre o potencial de distribuição funcional da HLJ039 são mostrados na Figura 1. Em comparação com os três genomas adicionais HLJ, HLJ039 tem 10 regiões diferentes (DRS). Informações pormenorizadas sobre estes fragmentos é mostrado na Tabela 1. Os locais destes DRs são rotulados em todo o genoma (Figura 2). Cerca de metade destas sequências codificadas proteínas hipotéticas. A maioria das sequências de proteínas envolvidas em DR metilase de ADN e uma enzima de modificação de restrição codificados. Notavelmente, um fragmento de 547 pb exclusivo (DR9) partilha 93% de identidade com uma proteína hipotética de Helicobacter cinaedi
ATCC BAA-847 verificou-se que nunca tinha estado presente em quaisquer outras H. pylori
estirpes anteriormente, que indicou uma possível transferência horizontal de genes entre H. pylori Comprar e H. cinaedi
. DR9, localizado no andaime 5, insere em um tipo III endonuclease de restrição de 1371 pb do gene de codificação, que é responsável pelas modificações de ADN metilase específico-adenina. A Figura 1 Subsistema estatísticas de distribuição de Helicobacter pylori HLJ039 tensão gerada pela anotação rápida usando o servidor tecnologia do subsistema.
Tabela 1 Informações básicas das diferentes regiões (DRS) em HLJ039
DR
Comece
End
Gene descrição
DR1
145736 180926

25 proteínas hipotéticas, VirB4, topoisomerase I do DNA, Pará, proteína elemento mobile, primeira ORF no transposon ISC1904
DR2
618.752
619.703
fucosiltransferase
DR3
740.131
740.654
proteína hipotética
DR4
1.200.420
1.202.309
hipotética proteína
metiltransferase DNA-citosina
DR5
1.254.233 1.256.053

proteína hipotética
DR6
1.335.551
1.337.398
Tipo II M6A metilase (hinFIM)
hypAIVR
DR7
1.393.932
1.394.805
proteína hipotética
DR8
1.443.251
1.445.196
tipo de enzima de modificação de ADN II
proteína hipotética
DR9
1.484.058
1.484.604
proteína hipotética partilha 93% de identidade com um fragmento do Helicobacter cinaedi
ATCC BAA-847
DR10
1.538.060
1.539.662
restrição Tipo IIG e enzima de modificação
Figura 2 Genoma alinhamento do carcinoma gástrico isolar HLJ039 com carcinoma não-isolados.
Todas as conclusões acima destacar o papel importante dos sistemas de modificação de restrição de DNA em H. pylori
recombinação genômica. Um total de 29,259 SNPs centrais foram encontrados entre as sequências do genoma analisados ​​54. Com base numa análise do núcleo genoma SNP de 54H. pylori
linhagens distribuídas em várias regiões do mundo, uma árvore filogenética foi gerado para mostrar o subtipo HLJ039. Todas as estirpes foram classificadas em diferentes grupos definidos por estudos anteriores de acordo com a tipagem de sequência multilocus [24, 25]. A Figura 3 mostra que HLJ039 foi definido como pertencente ao subgrupo hspEAsia, que pertencia ao grupo hpEastAsia. Figura 3 A análise filogenética de 54 estirpes de Helicobacter pylori com base em seus polimorfismos de nucleotídeo único núcleo do genoma.
Nota: Diferentes regiões (DRS) refere-se a codificação de inserção sequência e exclusão no HLJ039 em comparação com os outros três genomas
direções futuras
A incidência de carcinoma gástrico em países do Leste Asiático é bastante elevado [18, 19. ]. Para explorar os mecanismos patogênicos potenciais que podem contribuir para este fenómeno, mais do Leste Asiático H. pylori
estirpes deve primeiro ser sequenciado. As estirpes seleccionadas para a sequenciação deve ser representativa e eliminar a variação geográfica. Nossos caminhos futuros incidirá sobre sequenciamento genômico em larga escala de diferentes isolados clínicos de áreas com uma elevada incidência de câncer gástrico. Análises mais detalhadas envolvidas na metilação do DNA, bem como sistemas de restrição e de modificação seria as instruções mais atraentes para os estudos de H. pylori
cancro gástrico induzida.
Consentimento
consentimento informado foi obtido a partir do paciente para a publicação deste relatório e quaisquer imagens que o acompanham.
Disponibilidade de dados de apoio
dados adicionais que suportam os resultados aqui apresentados estão incluídos dentro dos arquivos adicionais.
Declarações
Agradecimentos
este trabalho foi apoiado por um fundo para a China mega-Projeto de Doenças Infecciosas (2011ZX10004-001) e uma bolsa da National Tecnologia R &. Programa D na 12ª Plano Quinquenal da China (2012BAI06B02)
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