Genomische karakterisering van een Helicobacter pylori isolaat van een patiënt met maagkanker in China

Genomische karakterisering van een Helicobacter pylori
isoleren van een patiënt met maagkanker in De abstracte China achtergrond
Helicobacter pylori
staat bekend om haar relatie met het optreden van een aantal ernstige maag-en vaatziekten. De mechanismen van de pathogenese veroorzaakt door H. pylori
zijn minder bekend. In deze studie, melden we het genoom sequentie en genomische karakteriseringen van H. pylori
stam HLJ039 dat werd geïsoleerd uit een patiënt met maagkanker in de Chinese provincie Heilongjiang, waar sprake is van een hoge incidentie van maagkanker. Om potentiële genomische functies die betrokken kunnen zijn bij de pathogenese van carcinoom onderzoeken, werd het genoom in vergelijking met drie eerder sequentie genomen op dit gebied.
Resultaat
We verkregen 42 contigs met een totale lengte van 1.611.192 bp en 1687 voorspelde coderende sequenties . In vergelijking met stammen geïsoleerd uit gastritis en maagzweren in dit gebied, werden 10 verschillende gebieden geïdentificeerd als uniek voor HLJ039; ze vooral gecodeerde type II restrictie-modificatie-enzym, type II M6A methylase, DNA-cytosine methyltransferase, DNA methylase, en hypothetische eiwitten. Een unieke 547-bp fragment delen van 93% identiteit met een hypothetisch eiwit van Helicobacter cinaedi
ATCC BAA-847 was niet aanwezig in elke andere eerdere H. pylori
stammen. Fylogenetische analyses gebaseerd op core genoom single nucleotide polymorphisms blijkt dat HLJ039 wordt gedefinieerd als hspEAsia subgroep, die behoort tot de groep hpEastAsia.
Conclusie
DNA methyleringen, variaties van de genomische regio die deze restrictie en modificatie systemen, zijn de " hot "gebieden die kan worden gerelateerd aan het mechanisme van H. pylori geïnduceerde
maagkanker. De genoomsequentie nuttige informatie voor de diepe winning van mogelijke mechanismen die verband houden met Oost-Aziatische maagkanker te bieden.
Sleutelwoorden
Helicobacter pylori
Maagkanker Next generation sequencing Genomic beschikt Achtergrond
Helicobacter pylori
, een Gram-negatieve bacterie koloniseert die in de menselijke maag, is algemeen erkend als een pathogene bacterie met betrekking tot de pathogenese van gastritis, maagzweren en carcinoma [1-3]. De hoge genetische variabiliteit van H. pylori
drijft de dramatische vermogen tot aanpassing aan de maag niche [4-9]. Echter, hoewel veel studies zijn uitgevoerd, de mechanismen zijn nog steeds niet goed opgehelderd. Hotels met de snelle ontwikkeling van de volgende generatie sequencing technologie en lagere kosten, is het mogelijk geworden om grootschalige genoom sequencing uit te voeren om voldoende informatie te verkrijgen biologische populatie structuur en ziektemerkers. In de afgelopen jaren hebben steeds meer H. pylori
stammen uit verschillende geografische regio's, etniciteiten, en ziekten gesequenced [10-12], en ten minste 50 genoomsequenties zijn momenteel beschikbaar in openbare databanken.
In een eerdere studie publiceerden we genoomsequenties van drie stammen hersteld van patiënten met maagzweren en atrofische gastritis in de provincie Heilongjiang [13]. Het is bekend dat H. pylori
stammen geïsoleerd uit verschillende geografische gebieden tonen dramatische genomische diversiteit [14]. Zo is op de genomische niveau, vergelijkende analyse tussen de stammen met verschillende klinische manifestaties moet in eerste instantie een dergelijke storing te voorkomen. Vergelijkende genomische sequentie analyse van stammen afkomstig van één patiënt kan een betrouwbare manier om dergelijke interferentie [15-17] elimineren. Echter, is het meestal moeilijk om een ​​patiënt te volgen en het verkrijgen van stammen geïsoleerd uit diverse onvoorspelbare uitingen.
In deze studie hebben we melding gemaakt van een ontwerp genoomsequentie van stam HLJ039 dat werd geïsoleerd uit een patiënt met maagkanker in de provincie Heilongjiang. Na de integratie met de andere drie genomen uit hetzelfde gebied, was de eerste vergelijkende genomische analyse uitgevoerd om de genetische kenmerken van maagkanker isolaten.
Methods
Strain selectie
HLJ039 werd geïsoleerd uit een 84-jarige te onderzoeken man met een slecht gedifferentieerde maag kanker lichaam. Hoewel sommige andere maag-carcinoom gerelateerde H. pylori
stammen geïsoleerd uit verschillende gebieden, etnische groepen en bevolkingsgroepen in de wereld aanwezig zijn in openbare databanken zijn, hadden we niet deze stammen voor onze vergelijkende analyse te selecteren. Het complex stamachtergrond zal het zeer moeilijk om betrouwbare genomische karakteristieken die kunnen worden toegeschreven aan een specifieke ziekte zoals maagkanker identificeren. Als zodanig is het analyseren van een bepaald geografisch gebied, etniciteit, of populatie kan een verstandiger manier om potentiële aanwijzingen met betrekking tot specifieke ziekten te vinden. Daarom is in dit onderzoek, hebben we gekozen voor slechts drie stammen geïsoleerd uit de provincie Heilongjiang voor de vergelijkende analyse. Deze stammen zijn zeer representatief, omdat de provincie Heilongjiang heeft een hoge incidentie van maag ziekten in China, in het bijzonder voor maagkanker. Daarnaast heeft de Chinese provincie Heilongjiang is in de buurt van Korea en Japan. Deze Oost-Aziatische landen hebben naar verluidt de hoogste incidentie van maagkanker wereldwijd [18, 19].
Ethiek goedkeuring
Dit onderzoek werd goedgekeurd door de vergadering van de ethische commissie van het nationaal instituut voor besmettelijke ziekten en preventie, China CDC, volgens de Chinese ethiek wet- en regelgeving. NO:. ICDC-2013001
Genome sequencing en annotatie
De stam van het maagslijmvlies werd geïsoleerd en gekweekt op Columbia agar basis aangevuld met 5% schapen bloed. DNA werd geëxtraheerd zoals eerder beschreven [20]. Voor elke stam werd hele genoom sequencing uitgevoerd met een Illumina HiSeq 2000 door het genereren gepaarde-end libraries (500 bp en 2 kb) volgens de instructies van de fabrikant. De lees lengtes waren 90 bp en 50 bp voor elke bibliotheek, waarvan meer dan 100 Mb van kwalitatief hoogwaardige data gegenereerd. De gepaarde-end leest van de twee bibliotheken waren de novo geassembleerd in steigers met behulp van SOAPdenovo (http:... //Zeep genomics org cn). Genpredictie werd uitgevoerd met behulp van Glimmer. De tRNA genen werden gezocht door tRNAScan-SE2, terwijl de rRNA genen werden gezocht door RNAmmer3. Eiwit BLAST4 werd uitgevoerd met behulp van de vertaalde coderende sequenties als een query tegen de referentie sequentie (H. pylori
stam 51). Ondernemingen De genoom werd verder geannoteerd en functioneel ingedeeld naar Rapid Annotatie behulp Subsystem Technology (RAST). Een subsysteem is een set van functionele rollen die een annotator heeft besloten zijn gerelateerd. Subsystemen vaak vertegenwoordigen de collectie van functionele rollen die een metabole route samenstellen, complex, of eiwit klasse [21].
Initial vergelijkende genomische en fylogenetische analyse Belgique Om mogelijke gebieden die betrokken kunnen zijn bij de pathogenese van maagkanker te identificeren, MAUVE werd gebruikt om HLJ039 vergelijken met drie extra isolaten hersteld van hetzelfde gebied [22]. Zoals eerder beschreven, werd HLJ271 gewonnen uit een patiënt met een maagzweer. HLJ193 en HLJ256 werden hersteld van patiënten met atrofische gastritis. Verschillende regio's (DRS) van HLJ039 werden gemerkt langs de chromosoom locatie. Certificaten zie coderende sequentie (CDS) insertie en deletie in HLJ039 vergelijking met de andere drie genomen. Belgique Om het fylogenetische karakterisering van HLJ039 ook via het openbare H. pylori
genoomsequenties, 53 gehele genoom sequenties werden uit geëxtraheerd GenBank voor verwantschapsboom bouw (Extra-bestand 1). P12 werd gebruikt als referentie genoom. Vergelijkingen werden gemaakt met het programma vanaf nucmer MUMMER3 in Panseq [23] uitgevoerd. Genomen werden gefragmenteerd in 500-bp segmenten die aanwezig moest in alle 54 genomen te worden opgenomen in het kern genoom. Horizontaal overgebrachte genen hebben meestal grote genetische variatie tussen de verschillende stammen, bijvoorbeeld de plasticiteit zones die coderen Type IV secretie systemen, R-M systemen of overdraagbare genomische eilanden. Volgens het principe van meervoudige uitlijning met behulp van Panseq, zouden deze potentiële horizontale genen van de kern genen worden verwijderd. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in het kern genoom bepaald en gebruikt om een ​​Phylip geformatteerde bestand te genereren. Aaneengeschakeld SNPs in lengte van 29.259 bp werden gebruikt om een ​​fylogenetische boom te construeren met behulp van de buur verbindingsmethode in MEGA5. Bootstrap methode werd gebruikt om de stabiliteit van de fylogenetische relaties te beoordelen.
Genomic data afzetting Inloggen Deze whole genome shotgun project is op DDBJ /EMBL /GenBank gedeponeerd onder toegangsnummer JAAA00000000, terwijl versie JAAA01000000 wordt beschreven in dit document.
Kwaliteitszorg
genomisch DNA werd geëxtraheerd uit een zuivere gekweekte H. pylori stam
bevestigd met gebruikelijke biochemische tests (positief voor urease, katalase en oxidase). De RAST server werd gebruikt om potentiële heterogene verontreinigingen te evalueren.
Eerste bevindingen
We uiteindelijk verkregen 42 contigs met een totale lengte van 1.611.192 bp en voorspelde 1687 CDS binnen het ontwerp-genoom van stam HLJ039. Aanvullende informatie is opgenomen in de sequentie meldingen van HLJ039 (aanvullende bestand 2). De G + C gehalte was 38,72%. Het subsysteem distributie en algemene informatie over de mogelijke functionele verdeling van HLJ039 zijn weergegeven in figuur 1. In vergelijking met de drie extra HLJ genomen, HLJ039 heeft 10 verschillende gebieden (DR). Gedetailleerde informatie over deze fragmenten wordt getoond in Tabel 1. De locaties van deze Certificaten de vol- gehele genoom (figuur 2). Ongeveer de helft van deze sequenties gecodeerde hypothetische eiwitten. De meeste DR sequenties gecodeerde eiwitten betrokken bij DNA-methylase en een restrictie-modificatie-enzym. Met name een unieke 547-bp fragment (DR9) delen 93% identiteit met een hypothetisch eiwit van Helicobacter cinaedi
ATCC BAA-847 werd gevonden die nooit aanwezig was in elke andere H. pylori
stammen eerder, die aangaf een mogelijke horizontale genoverdracht tussen H. pylori Kopen en H. cinaedi
. DR9, in steiger 5, voegt in een 1371-bp dat codeert voor type III restrictie-endonuclease, dat verantwoordelijk is voor adenine-specifieke DNA methylase modificaties. Figuur 1 Subsystem distributiestatistieken van Helicobacter pylori stam HLJ039 gegenereerd door de snelle annotatie met behulp van technologie van het subsysteem server.
Tabel 1 Standaard informatie over de verschillende regio's (DRS) in HLJ039
DR
Start
Einde
Gene beschrijving
DR1
145.736
180.926
25 hypothetische eiwitten, VirB4, DNA topoisomerase I, para, Mobile element eiwit, First ORF in transposon ISC1904
DR2
618.752
619.703
fucosyltransferase
DR3
740.131
740.654
Hypothetisch eiwit
DR4
1.200.420
1.202.309
Hypothetisch eiwit
DNA-cytosine methyltransferase
DR5
1.254.233
1256053
Hypothetisch eiwit
DR6
1.335.551
1.337.398
Type II M6A methylase (hinFIM)
hypAIVR
DR7
1.393.932
1.394.805
Hypothetisch eiwit
DR8
1.443.251
1.445.196
Type II DNA-modificatie-enzym
hypothetisch eiwit
DR9
1.484.058
1.484.604
hypothetisch eiwit deelt 93% identiteit met een fragment van Helicobacter cinaedi
ATCC BAA-847
DR10
1.538.060
1.539.662
Type IIG restrictie en modificatie enzym
figuur 2 Genome uitlijning van maagcarcinoom isoleren HLJ039 met niet-carcinoom isolaten.
Al het bovenstaande bevindingen benadrukken de belangrijke rol van DNA restrictie modificatie systemen in H. pylori
genomische recombinatie. Een totaal van 29.259 kern SNPs werden gevonden onder de 54 geanalyseerde genoomsequenties. Gebaseerd op een kern genoom SNP analyse van 54H.
pylori stammen verdeeld in verschillende gebieden wereldwijd, werd een fylogenetische boom gegenereerd om de HLJ039 subtype tonen. Alle stammen werden ingedeeld in verschillende groepen gedefinieerd door eerdere studies volgens multilocus sequentie typen [24, 25]. Figuur 3 toont dat HLJ039 werd gedefinieerd als behorende tot de hspEAsia subgroep, die behoorde tot de hpEastAsia groep. Figuur 3 Fylogenetische analyse van 54 Helicobacter pylori-stammen, gebaseerd op hun core-genoom single nucleotide polymorphisms.
Opmerking: Verschillende regio (DRS) betreft coderende sequentie insertie en deletie in HLJ039 vergelijking met de andere drie genomen
Vervolgonderzoek
De incidentie van maagcarcinoom in Aziatische landen vrij hoog [18, 19. ]. Om het potentieel pathogene mechanismen die kunnen bijdragen aan dit fenomeen te verkennen, meer Oost-Aziatische H. pylori
stammen moet eerst worden gesequenced. De voor sequencing stammen moeten representatief zijn en te elimineren geografische variatie. Onze toekomstige richtingen zal zich richten op grootschalige genome sequencing van verschillende klinische isolaten uit gebieden met een hoge incidentie van maagkanker. Verdere analyses betrokken bij DNA methylering en restrictie en modificatie systemen zouden de meest aantrekkelijke aanwijzingen voor studies van H. pylori geïnduceerde
maagkanker.
Toestemming
Schriftelijke toestemming werd verkregen van de patiënt de publicatie van dit verslag en eventuele begeleidende beelden.
beschikbaarheid van ondersteunende gegevens
Aanvullende gegevens ter ondersteuning van de resultaten die hier worden gerapporteerd zijn opgenomen in de aanvullende bestanden.
verklaringen
Dankwoord
dit werk werd ondersteund door een fonds voor China Mega-Project for Infectious Disease (2011ZX10004-001) en een subsidie ​​van de National Technology R &. D-programma in de 12e Vijfjarenplan van China (2012BAI06B02)
Electronic aanvullend materiaal
13099_2014_126_MOESM1_ESM. doc Extra file 1: Algemene informatie voor het publiek beschikbaar genomen (DOC 60 KB) 13099_2014_126_MOESM2_ESM.doc Extra file 2:.. Assembly informatie HLJ039 (DOC 27 KB) Authors 'originele ingediende dossiers voor afbeeldingen
Hieronder staan ​​de links naar origineel van de auteurs ingediende dossiers voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 13099_2014_126_MOESM4_ESM.tiff Authors' 13099_2014_126_MOESM3_ESM.tiff Auteurs originele bestand voor figuur 2 13099_2014_126_MOESM5_ESM.tiff Authors 'originele bestand voor figuur 3 Concurrerende belangen Ondernemingen De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen.
Authors' bijdragen
YY voerde de bioinformatica analyse en schreef het manuscript; MZ en LH waren verantwoordelijk voor bacteriën isolatie en identificatie; LL, XH en YZ uitgevoerd genome sequencing; JZ en PN ontwierp de studie en de financiële steun voor dit werk. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Adjuvante chemo-straling voor adenocarcinoom van de maag: een institutionele experience
• Een geval van uitgezaaide leptomeningeale carcinomatosa vanaf begin gastric carcinoma