caratterizzazione genomica di un Helicobacter pylori isolare da un paziente con cancro gastrico in Cina

caratterizzazione genomica di un Helicobacter pylori
isolare da un paziente con cancro gastrico in Cina
Abstract
sfondo
Helicobacter pylori
è ben noto per la sua relazione con l'insorgenza di molte malattie gastriche gravi. I meccanismi di patogenesi innescato da H. pylori Quali sono meno ben noti. In questo studio, riportiamo la sequenza del genoma e caratterizzazioni genomici di H. pylori
HLJ039 ceppo che è stato isolato da un paziente con cancro gastrico nella provincia cinese di Heilongjiang, in cui vi è un'alta incidenza di cancro gastrico. Per studiare i potenziali caratteristiche genomiche che possono essere coinvolte nella patogenesi del carcinoma, il genoma è stato confrontato con tre genomi sequenziati in precedenza in questo settore.
Risultato
Abbiamo ottenuto 42 contigs con una lunghezza totale di 1.611.192 bp e predetto 1.687 sequenze codificanti . Rispetto ai ceppi isolati di gastrite e ulcere in questo settore, 10 regioni differenti sono stati identificati come essere unico per HLJ039; essi principalmente codificati di tipo II enzima di restrizione-modificazione, di tipo II M6A methylase, DNA metiltransferasi-citosina, methylase DNA e proteine ​​ipotetiche. Un unico frammento di 547 bp condivisione 93% di identità con un ipotetico proteine ​​di Helicobacter cinaedi
ATCC BAA-847 non era presente in tutte le altre H. pylori
ceppi precedenti. L'analisi filogenetica basata sul core genoma polimorfismi a singolo nucleotide mostra che HLJ039 è definito come hspEAsia sottogruppo, che appartiene al gruppo hpEastAsia.
Conclusione
metilazioni DNA, le variazioni delle regioni genomiche coinvolte nei sistemi di restrizione e di modifica, sono il " regioni calde "che possono essere correlati al meccanismo di H. pylori
carcinoma gastrico indotta. La sequenza del genoma fornirà informazioni utili per la profonda estrazione di potenziali meccanismi relativi a cancro gastrico orientale.
Parole
Helicobacter pylori
cancro gastrico nuova generazione sequenziamento genomico dispone Sfondo
Helicobacter pylori
, un batterio gram-negativo che colonizza nello stomaco umano, è stato ampiamente riconosciuto come batteri patogeni legati alla patogenesi della gastrite, ulcere, e il carcinoma [1-3]. L'elevata variabilità genetica di H. pylori
spinge la sua drammatica capacità di adattarsi alla nicchia gastrica [4-9]. Tuttavia, anche se sono stati effettuati molti studi, i suoi meccanismi non sono ancora ben chiarito.
Con il rapido sviluppo della prossima generazione di tecnologia di sequenziamento e riduzione dei costi, è diventato possibile per eseguire le procedure di grandi genoma scala di sequenziamento per ottenere ampie informazioni su struttura della popolazione e la malattia marcatori biologici. Nel corso degli ultimi anni, sempre più H. pylori
ceppi provenienti da diverse regioni geografiche, etnie, e le malattie sono stati sequenziati [10-12], e almeno 50 sequenze del genoma sono attualmente disponibili nelle banche dati pubbliche.
In uno studio precedente, abbiamo pubblicato sequenze del genoma di tre ceppi recuperati da pazienti con ulcere e gastrite atrofica in provincia di Heilongjiang [13]. È ben noto che H. pylori
ceppi isolati da differenti aree geografiche mostrano drammatico diversità genomico [14]. Così, a livello genomico, analisi comparativa tra ceppi con differenti manifestazioni cliniche dovrebbe inizialmente eliminare tali interferenze. Analisi comparativa sequenziamento genomico dei ceppi isolati da pazienti singoli potrebbe essere un modo affidabile per eliminare tali interferenze [15-17]. Tuttavia, di solito è difficile seguire un paziente e di ottenere ceppi isolati da varie manifestazioni imprevedibili.
In questo studio, abbiamo riportato un progetto di sequenza del genoma del ceppo HLJ039 che è stato isolato da un paziente con cancro gastrico nella provincia di Heilongjiang. Dopo l'integrazione con le altre tre genomi della stessa area, prima analisi genomica comparativa è stata effettuata per studiare le caratteristiche genetiche del cancro gastrico isolate.
Metodi
Strain selezione
HLJ039 è stato isolato da un 84-year-old uomo con il cancro allo stomaco corpo scarsamente differenziato. Anche se alcuni altri H. pylori
ceppi gastrici carcinoma legati isolati da aree diverse, etnie, e le popolazioni nel mondo sono presenti in banche dati pubbliche, non abbiamo selezioniamo questi ceppi per la nostra analisi comparativa. Lo sfondo ceppo complesso renderà molto difficile l'identificazione caratteristiche genomiche affidabili che possono essere contribuito ad una specifica malattia come il cancro gastrico. In quanto tale, analizzando una specifica geografica regione, etnia, o di una popolazione può essere un modo più sensato per trovare potenziali indizi relativi a malattie specifiche. Pertanto, in questo studio, abbiamo selezionato solo tre ceppi isolati da provincia Heilongjiang per l'analisi comparativa. Questi ceppi sono molto rappresentativo perché provincia di Heilongjiang ha un'alta incidenza di malattie gastriche in Cina, in particolare per il cancro gastrico. Inoltre, la provincia cinese di Heilongjiang è vicina Corea e Giappone. Questi paesi dell'Asia orientale hanno riferito la più alta incidenza di cancro gastrico in tutto il mondo [18, 19].
Approvazione etica
Questa ricerca è stata approvata dalla riunione del comitato etico dell'Istituto Nazionale per il controllo delle malattie trasmissibili e la prevenzione, la Cina CDC, secondo le leggi ei regolamenti etica cinesi. NO:. ICDC-2013001
Il sequenziamento del genoma e annotazione
Il ceppo è stato isolato da mucosa gastrica e coltivate su Columbia base di agar arricchito con sangue di pecora 5%. DNA è stato estratto come precedentemente descritto [20]. Per ogni ceppo, con tutto il sequenziamento del genoma è stata effettuata utilizzando un Illumina Hiseq 2000 generando librerie abbinato-end (500 pb e 2 kb) seguito le istruzioni del produttore. Le lunghezze di lettura erano 90 bp e 50 bp per ogni libreria, da cui è stato generato più di 100 MB di dati di alta qualità. La fascia abbinato legge da due librerie erano de novo assemblati in ponteggi utilizzando SOAPdenovo (http:... //Sapone genomica org cn). Gene previsione è stata effettuata utilizzando Glimmer. I geni tRNA sono stati cercati dal tRNAScan-SE2, mentre i geni rRNA sono stati cercati dal RNAmmer3. Proteine ​​BLAST4 è stato eseguito utilizzando le sequenze codificanti tradotto come una query sulla sequenza di riferimento (H. pylori
ceppo 51).
Il genoma è stato ulteriormente annotato e funzionalmente classificato da Rapid Annotazione utilizzando Subsystem Technology (RAST). Un sottosistema è un insieme di ruoli funzionali che un commentatore ha deciso sono correlati. I sottosistemi rappresentano spesso la raccolta dei ruoli funzionali che compongono una via metabolica, complesso o una classe di proteine ​​[21]
. Iniziale comparativa analisi genomica e filogenetica
per identificare possibili aree che possono essere coinvolte nella patogenesi del cancro gastrico, MAUVE è stato utilizzato per confrontare HLJ039 con tre isolati aggiuntivi recuperati dalla stessa zona [22]. Come descritto in precedenza, HLJ271 è stato recuperato da un paziente con un'ulcera gastrica. HLJ193 e HLJ256 sono stati recuperati da pazienti con gastrite atrofica. Diverse regioni (DRS) di HLJ039 sono stati etichettati lungo la sua posizione cromosomica. DR riferimento alla sequenza codificante (CDS) inserimento e la cancellazione in HLJ039 rispetto agli altri tre genomi.
Per definire la caratterizzazione filogenetica HLJ039 utilizzando il H. pylori pubblicamente disponibile
sequenze genomiche, 53 sequenze genomiche intere sono stati estratti da GenBank per la costruzione dell'albero filogenetico (sui file 1). P12 è stato utilizzato come genoma di riferimento. I confronti sono stati realizzati utilizzando il programma nucmer da MUMMER3 implementato in Panseq [23]. Genomi sono stati frammentati in segmenti da 500 bp che dovevano essere presenti in tutti i 54 genomi da inserire nel genoma nucleo. geni orizzontalmente trasferiti solito hanno alta diversità genetica tra i diversi ceppi, ad esempio, le zone di plasticità, quali sistemi di tipo codifica secrezione IV, sistemi R-M, o isole genomiche trasferibili. Secondo il principio di allineamento multiplo con l'uso di Panseq, questi potenziali geni orizzontali verrebbero rimossi dai geni essenziali. polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) nel genoma di base sono determinati e utilizzati per generare un file Phylip-formattato. SNP concatenati lunghezza di 29.259 bp sono stati usati per costruire un albero filogenetico utilizzando il metodo vicina-giunzione in MEGA5. metodo Bootstrap è stato utilizzato per valutare la stabilità delle relazioni filogenetiche.
deposizione dati genomici
L'intero progetto del genoma fucile è stato depositato presso DDBJ /EMBL /GenBank con il numero di adesione JAAA00000000, mentre la versione JAAA01000000 è descritto in questo articolo.
garanzia di qualità
Il DNA genomico è stato estratto da una colta H. pylori
ceppo puro e confermata con test biochimici convenzionali (positivi dell'ureasi, catalasi e ossidasi). Il server RAST è stato utilizzato per valutare i potenziali contaminazioni eterogenee.
I primi risultati
Abbiamo infine ottenuti 42 contigs con una lunghezza totale di 1.611.192 bp e ha previsto 1.687 CDS all'interno del progetto genoma del ceppo HLJ039. Ulteriori informazioni sono contenute nelle relazioni di sequenziamento di HLJ039 (file supplementare 2). Il contenuto di G + C era 38.72%. La distribuzione sottosistema e le informazioni generali sul potenziale distribuzione funzionale degli HLJ039 sono mostrati in Figura 1. Rispetto alle altre tre genomi HLJ, HLJ039 dispone di 10 regioni diverse (DRS). Informazioni dettagliate su questi frammenti è riportata nella Tabella 1. Le posizioni di queste DRs sono etichettati in tutto il genoma (Figura 2). Circa la metà di queste sequenze codificate proteine ​​ipotetiche. La maggior parte delle sequenze DR proteine ​​coinvolte nella methylase DNA e un enzima di restrizione modifica codificati. In particolare, un frammento di 547 bp unico (DR9) che condividono 93% di identità con un ipotetico proteine ​​di Helicobacter cinaedi
ATCC BAA-847 è constatato che non era mai stato presente in tutte le altre H. pylori
ceppi in precedenza, che indicava un possibile trasferimento genico orizzontale tra H. pylori
e H. cinaedi
. DR9, situato in scaffold 5, inserisce in un gene codificante 1.371 bp tipo III endonucleasi di restrizione, che è responsabile per modifiche methylase specifico DNA-adenina. Figura 1 statistiche di distribuzione del sottosistema di Helicobacter pylori HLJ039 ceppo generato dalla rapida annotazione utilizzando il server tecnologia del sottosistema.
Tabella 1 Informazioni di base delle diverse regioni (DRS) a HLJ039
DR
Manager Inizia

End
Gene descrizione
DR1
145.736
180926
25 ipotetiche proteine, VirB4, DNA topoisomerasi I, Para, proteine ​​elemento mobile, prima ORF in trasposoni ISC1904
DR2
618.752
619.703
Fucosyltransferase
DR3
740.131
740.654
ipotetica proteina
DR4
1.200.420 1.202.309

ipotetica proteina
DNA-metiltransferasi citosina
DR5
1.254.233 1.256.053

ipotetica proteina
DR6
1.335.551 1.337.398

tipo II M6A methylase (hinFIM)
hypAIVR
dr7
1.393.932 1.394.805

proteina ipotetica
DR8
1.443.251 1.445.196

tipo II DNA modificazione enzimatica
ipotetica proteina
DR9
1.484.058 1.484.604

proteina ipotetica condivisione 93% di identità con un frammento di Helicobacter cinaedi
ATCC BAA-847
DR10
1.538.060 1.539.662

restrizione Tipo IIG e l'enzima modifica
Figura 2 allineamento del genoma del carcinoma gastrico isolare HLJ039 con i non-carcinoma isolati.
Tutti i risultati di cui sopra sottolineano il ruolo importante dei sistemi di modifica di restrizione del DNA in H. pylori
ricombinazione genomica. Un totale di 29,259 SNP fondamentali sono stati trovati tra i 54 sequenze del genoma analizzati. Sulla base di un'analisi di base del genoma SNP di 54H. pylori
ceppi distribuiti in varie regioni del mondo, un albero filogenetico è stato generato per mostrare il sottotipo HLJ039. Tutti i ceppi sono stati classificati in diversi gruppi definiti da studi precedenti in base alla tipizzazione sequenza multilocus [24, 25]. La figura 3 mostra che HLJ039 è stata definita come appartenente al sottogruppo hspEAsia, che apparteneva al gruppo hpEastAsia. Figura 3 L'analisi filogenetica di 54 ceppi di Helicobacter pylori in base alle loro nucleo genoma polimorfismi a singolo nucleotide.
Nota: le regioni diverse (DRS) si riferisce alla codifica inserimento sequenza e l'eliminazione in HLJ039 rispetto agli altri tre genomi
direzioni future
L'incidenza del carcinoma gastrico nei paesi dell'Asia orientale è piuttosto elevata [18, 19. ]. Per esplorare i potenziali meccanismi patogenetici che possono contribuire a questo fenomeno, più orientale H. pylori
ceppi devono prima essere sequenziato. I ceppi selezionati per il sequenziamento devono essere rappresentativi ed eliminare variazione geografica. I nostri orientamenti futuri si concentreranno su larga scala sequenziamento genomico di diversi isolati clinici da zone ad alta incidenza di cancro gastrico. Analisi più dettagliate coinvolti nella metilazione del DNA così come i sistemi di restrizione e modificazione sarebbero le direzioni più interessanti per gli studi di H. pylori
cancro gastrico indotta.
Consenso
consenso informato scritto è stato ottenuto dal paziente per la pubblicazione di questo rapporto e qualsiasi immagini allegate.
Disponibilità dei dati di supporto
dati addizionali che supportano i risultati qui riportati sono compresi all'interno dei file aggiuntivi
dichiarazioni
Ringraziamenti.
questo lavoro è stato sostenuto da un fondo per la Cina Mega-Progetto per malattie infettive (2011ZX10004-001) e una borsa di studio dal National Technology R &. D programma nel 12 ° piano quinquennale della Cina (2012BAI06B02)
materiale supplementare elettronica
13099_2014_126_MOESM1_ESM. doc file aggiuntive 1: informazioni generali per i genomi disponibili al pubblico (DOC 60 KB) 13099_2014_126_MOESM2_ESM.doc sui file 2:.. informazioni di montaggio per HLJ039 (DOC 27 KB) Autori 'iniziale ha presentato i file per le immagini
di seguito sono riportati i link ai originale degli autori presentato file per le immagini. 'file originale per la figura 1 13099_2014_126_MOESM4_ESM.tiff Autori 13099_2014_126_MOESM3_ESM.tiff autori file originale per la figura 2 13099_2014_126_MOESM5_ESM.tiff Autori file originale per gli interessi figura 3 Competere
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
Autori' contributi
YY eseguite l'analisi bioinformatica e scrisse il manoscritto; MZ e LH sono stati responsabili per l'isolamento dei batteri e di identificazione; LL, XH e YZ eseguite sequenziamento genomico; JZ e PN progettato lo studio e ha fornito sostegno finanziario per questo lavoro. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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