Genomická charakterizácia Helicobacter pylori izolovať od pacienta s rakovinou žalúdka v Číne

Genomická charakterizácia Helicobacter pylori
izolovať od pacienta s rakovinou žalúdka v Číne
abstraktné
pozadia
Helicobacter pylori
je dobre známy pre jeho vzťah k vzniku niekoľkých závažných žalúdočných chorôb. Mechanizmy patogenézy vyvolané H. pylori
sú menej dobre známe. V tejto štúdii sme správu sekvenciu genómu a genómovej charakterizácia H. pylori kmeňa
HLJ039 ktorá bola izolovaná od pacientov s rakovinou žalúdka v čínskej provincii Heilongjiang, kde je vysoký výskyt rakoviny žalúdka. Vyšetriť potenciálny genómovej funkcie, ktoré môžu byť zapojené do patogenézy karcinómu, genóm bol v porovnaní s tromi skôr sekvenovaných genómoch v tejto oblasti.
Výsledok
sme získali 42 contigs s celkovou dĺžkou 1,611,192 bp a predpokladanou 1,687 kódujúce sekvencie , V porovnaní s kmeňov izolovaných z žalúdka a vredy v tejto oblasti, 10 rôznych oblasti boli identifikované ako jedinečné pre HLJ039; sú kódované predovšetkým typu II reštrikcia-modifikácie enzýmu typu II M6A metyláza, DNA cytozín metyltransferázy DNA metyláza a hypotetické proteíny. Unikátny 547-bp fragment zdieľanie 93% identitu s hypotetickým proteínom Helicobacter cinaedi
ATCC BAA-847 nebol prítomný v iných predchádzajúcich kmeňov H. pylori
. Fylogeneticky analýza založená na kľúčových genómu jednonukleotidových polymorfizmov ukazuje, že HLJ039 je definovaný ako hspEAsia podskupiny, ktorá patrí do skupiny hpEastAsia.
Záver
DNA metylácie, variácie oblastiach genómu, zapojených do reštrikčných a modifikačných systémov, sú " horúce "oblasti, ktoré môžu byť spojené s mechanizmom H. pylori
indukovanej rakoviny žalúdka. Sekvencia genómu bude poskytovať užitočné informácie pre hlbinné ťažby potenciálnych mechanizmov súvisiacich s východoázijské rakoviny žalúdka.
Kľúčové
Helicobacter pylori
rakovina žalúdka Nová generácia sekvenovania genómovej k dispozícii pozadí
Helicobacter pylori
gram-negatívne baktérie, ktorá kolonizuje v ľudskom žalúdku, je všeobecne uznávaná ako patogénnych baktérií v súvislosti s patogenéze gastritídy, vredov, a karcinómu [1-3]. Vysoká genetická variabilita H. pylori
ženie svoju dramatickú schopnosť prispôsobiť sa žalúdočné výklenku [4-9]. Avšak, aj keď boli vykonané mnoho štúdií, jej mechanizmy sú stále nie je dobre objasnený.
S rýchlym rozvojom budúcej generácie sekvenovania technológií a zníženie nákladov, to stalo sa možné vykonávať veľké mierka sekvenovania genómu postupy, aby získal dostatočné informácie o biologické štruktúry obyvateľstva a choroby markery. Počas niekoľkých posledných rokov sa čím ďalej H. pylori
kmene z rôznych geografických oblastiach, etník a chorôb boli sekvenované [10-12], a najmenej 50 genómovej sekvencie sú v súčasnej dobe k dispozícii vo verejných databázach.
predchádzajúcej štúdii sme zverejnili genómovej sekvencie troch kmeňov získaných od pacientov s vredmi a atrofickú gastritídu v provincii Heilongjiang [13]. Je dobre známe, že H. pylori
kmene izolované z rôznych geografických oblastí ukazujú dramatický genomické rozmanitosti [14]. Tak na úrovni genómu, porovnávacia analýza medzi kmeňmi s rôznymi klinickými prejavmi by sa mali spočiatku odstrániť toto rušenie. Porovnávacia analýza genomické sekvenovanie kmeňov izolovaných od jednotlivých pacientov by mohla byť spoľahlivý spôsob, ako odstrániť toto rušenie [15-17]. Avšak, je zvyčajne veľmi ťažké sledovať pacienta a získanie kmeňov izolovaných z rôznych nepredvídateľných prejavov.
V tejto štúdii sme popísali návrh sekvenciu genómu kmeňa HLJ039, ktorá bola izolovaná od pacienta s rakovinou žalúdka v provincii Heilongjiang. Po integrácii s ďalšími tromi genómov z rovnakej oblasti, počiatočné komparatívna genomická analýza bola vykonaná vyšetrovať genetické znaky rakoviny žalúdka izoláty.
Metódy
Strain výber
HLJ039 bol izolovaný z 84-ročný muž sa zle diferencovaným karcinómom žalúdka tela. Hoci niektoré ďalšie žalúdočné H. pylori
kmene karcinóm súvisiace izolované z rôznych oblastí, etník, a populácie vo svete sú prítomné vo verejných databázach, sme nemali vybrať tieto kmene pre naše porovnávaciu analýzu. Komplex kmeň pozadie bude robiť to veľmi ťažké identifikovať spoľahlivé genómovej vlastnosti, ktoré môžu byť prispeli k určitému ochorení, ako je rakovina žalúdka. Ako taký, analyzovať konkrétne geografickej oblasti, etnický pôvod, alebo populácii môže byť rozumnejšie spôsob, ako nájsť potenciálnych stopy spojené s konkrétnymi chorobami. Preto sa v tejto štúdii sme zvolili iba tri kmeňov izolovaných z provincii Heilongjiang pre porovnávacie analýzy. Tieto kmene sú veľmi reprezentatívne, pretože provincia Heilongjiang má vysoký výskyt žalúdočných chorôb v Číne, a to najmä pre rakovinu žalúdka. Okrem toho provincie Heilongjiang čínskej a je blízko Kórey a Japonska. Tieto východoázijského krajiny údajne majú najvyšší výskyt rakoviny žalúdka po celom svete [18, 19].
Schválenie Ethics
Tento výskum bol schválený na zasadnutí etickou komisiou Národného inštitútu pre prenosné kontrolu chorôb a prevenciu, Čína CDC, podľa čínskych etických zákonov a predpisov. NO :. ICDC-2013001
sekvenovania genómu a anotácia
kmeň bol izolovaný z žalúdočnej sliznice a kultivované na Columbia Agar Base doplnenom 5% ovčej krvi. DNA bola extrahovaná ako bolo opísané skôr [20]. Pre každý kmeň, celý genóm sekvenovania bolo vykonané pomocou Illumina Hiseq 2000 generovaním spárovanie-end knižníc (500 bp a 2 kb), podľa inštrukcií výrobcu. Dĺžky čítanie bolo 90 bp a 50 bp na každej knižnice, z ktorého bol generovaný viac ako 100 MB údajov vysokej kvality. Párované-end číta tieto dve knižnice boli de novo zostavené do lešenie za použitia SOAPdenovo (http: ... //Mydlo genomika org CN). predikcie génu bola vykonaná za použitia Glimmer. Gény tRNA boli vyhľadávané podľa tRNAScan-SE2, zatiaľ čo gény rRNA boli vyhľadávané podľa RNAmmer3. Proteín BLAST4 bola vykonaná pomocou preložené kódujúcich sekvencií ako dotaz voči referenčnej sekvencii (H. pylori
kmeň 51).
Genóm bol ďalej komentovaný a funkčne rozdelené do kategórií podľa Rapid Anotácia pomocou technológie subsystému (RAST). Subsystém je sada funkčných rolí, že anotátor rozhodla spolu súvisia. Subsystémy často predstavujú kolekciu funkčných rolí, ktoré tvoria metabolickú dráhu, komplex, alebo trieda proteín [21].
Počiatočná komparatívne genomické a fylogeneticky analýza
k identifikácii možných oblastí, ktoré môžu byť zapojené do patogenézy rakoviny žalúdka, MAUVE bol použitý na porovnanie HLJ039 s troma ďalšími izolátoch získaných z rovnakej oblasti [22]. Ako bolo popísané vyššie, HLJ271 bol získaný od pacienta s žalúdočný vred. HLJ193 a HLJ256 boli získané od pacientov s atrofickú gastritídou. Rôzne regióny (DRS) z HLJ039 boli označené pozdĺž jeho umiestnenia chromozómu. DRS pozri kódovanie sekvencie (CDS), vloženie a vymazanie v HLJ039 v porovnaní s ostatnými tromi genómov.
Na definovanie fylogenetický charakterizáciu HLJ039 použitie verejne dostupné H. pylori
genómovej sekvencie, 53 celého genómu sekvencie boli získané z GenBank pre fylogenetický strom stavebníctvo (ďalší súbor 1). P12 bol použitý ako referenčný genómu. Porovnanie boli vykonané s použitím nucmer program z MUMMER3 implementovaná Panseq [23]. Genómy boli roztrieštené do 500 bp segmentov, ktoré museli byť prítomné vo všetkých 54 genómy majú byť zahrnuté do jadra genómu. Horizontálne prenášané gény majú zvyčajne vysokú genetickú rozmanitosť medzi jednotlivými kmeňmi, napríklad plasticita zóny, aký typ kódujú systémy sekrečnú IV, systémy R-M, alebo prevoditeľných genómovej ostrovy. Podľa princípu viacnásobnej zarovnanie použitím Panseq, tieto potenciálne horizontálne gény by byť odstránené z hlavných génov. Jednonukleotidových polymorfizmy (SNP) v jadre genómov sú určené a použité na generovanie Phylip súbor vo formáte. Kaskádové SNP v dĺžke 29,259 bp boli použité ku konštrukcii fylogenetický strom pomocou metódy sused-spojenia v MEGA5. Bootstrap metóda bola použitá na posúdenie stability fylogenetických vzťahov.
Depozície genomických dát
celého genómu brokovnice projekt bol uložený v DDBJ /EMBL /GenBank pod prístupovým číslom JAAA00000000, zatiaľ čo verzia JAAA01000000 je popísaná v tomto dokumente.
zabezpečenie kvality
genomická DNA bola extrahovaná z čistého kultivované baktérie H. pylori kmeňa stroje a potvrdzuje, že sa za použitia obvyklých biochemických testov (pozitívny pre ureázu, katalázy a oxidázy). Server RAST sa na ohodnotenie potenciálnych heterogénnych nečistôt.
Úvodných zistenie
sme nakoniec získala 42 contigs s celkovou dĺžkou 1,611,192 bp a predpovedaná 1,687 CDS v rámci návrhu genóme kmeňa HLJ039. Ďalšie informácie sú obsiahnuté v správach sekvenovania HLJ039 (ďalší súbor 2). Obsah G + C bola 38,72%. Distribúcia subsystém a všeobecné informácie o potenciálnej funkčné rozdelenie HLJ039 sú znázornené na obrázku 1. V porovnaní s ďalšími tromi HLJ genómov, HLJ039 má 10 rôznych oblastí (DRS). Podrobné informácie o týchto fragmentov je uvedený v tabuľke 1. Poloha týchto DRS sú označené v celom genóme (obrázok 2). Približne polovica z týchto sekvencií kódovaný hypotetické proteíny. Väčšina DR sekvencií kódovaných proteínov zapojených do DNA metyláza a obmedzení modifikácie enzýmu. Najmä bolo zistené, unikátny fragment 547 bp (DR9) zdieľanie 93% identitu s hypotetickým proteínom Helicobacter cinaedi
ATCC BAA-847, ktoré sa nikdy prítomná v iných kmeňoch baktérie H. pylori
skôr, čo je uvedené možný prenos horizontálnej génový medzi H. pylori stroje a H. cinaedi
. DR9, ktorý sa nachádza v lešenia 5, vloží do 1371 bp génu kódujúceho typu III reštrikčné endonukleázy, ktorá je zodpovedná za adenín špecifická modifikácie DNA metyláza. Obrázok 1 subsystém štatistika distribúcia Helicobacter pylori kmeňa HLJ039 vytvoreného rýchlym anotácie s použitím technológie subsystém servera.
Tabuľka 1 Základné informácie o rôznych regiónoch (DRS) v HLJ039
DR
Začiatok
Koniec
Gene popis
DR1
145736 180926
25 hypotetické proteíny, VirB4, DNA topoizomerázy I, para, mobilné element bielkovina, prvý ORF v transpozómami ISC1904
DR2
618752 619703
fukosyltransferáza
DR3
740131 740654
hypotetickú proteínu
DR4
1200420 1202309
hypotetický proteín
DNA cytozín metyltransferáza
Dr5
1254233 1256053

Hypotetický proteín
DR6
1335551 1337398
typu II M6A metyláza (hinFIM)
hypAIVR
DR7
1393932 1394805
Hypotetický proteín
DR8
1443251 1445196
Type II DNA modifikačné enzým
hypotetického proteínu
DR9
1484058 1484604
zdieľa 93% identitu s fragmentom Helicobacter cinaedi hypotetický proteín
ATCC BAA-847
DR10
1538060 1539662
obmedzenia Type IIG a modifikácie enzýmu
Obrázok 2 Genome vyrovnanie karcinómu žalúdka izolovať HLJ039 s non-karcinóm izoláty.
Všetky vyššie uvedené zistenia zdôrazňujú dôležitú úlohu systémov reštrikčných DNA modifikácie v H. pylori
genómovej rekombinácie. Bolo zistené, medzi 54 analyzovaných sekvencií genómu celkom 29,259 základných SNP. Na základe analýzy genómu jadro SNP z 54H na báze. pylori
kmene distribuované v rôznych regiónoch po celom svete, je fylogenetický strom bol vytvorený ukázať HLJ039 podtyp. Všetky kmene boli rozdelené do rôznych skupín definovaných skorších štúdií podľa multilokusovou sekvenčné typizácie [24, 25]. Obrázok 3 ukazuje, že HLJ039 bola definovaná ako patriaci do hspEAsia podskupiny, ktorý patril k skupine hpEastAsia. Obrázok 3 fylogeneticky analýza 54 Helicobacter pylori kmeňov na základe ich jadro genómu jednonukleotidových polymorfizmov.
Poznámka: Rôzne oblasti (DRS) sa vzťahuje na kódovanie vloženie sekvencie a vymazanie v HLJ039 v porovnaní s ostatnými tromi genómov
ďalšom smerovaní
incidencia karcinómu žalúdka vo východoázijských krajinách je pomerne vysoká [18, 19. ]. Ak chcete preskúmať potenciálne patogénne mechanizmy, ktoré môžu prispieť k tomuto javu, viac východnej Ázie H. pylori
kmeňov musí byť najskôr sekvencovania. Kmene vybrané pre sekvencovanie by mali byť reprezentatívne a odstránenie geografické rozdiely. Naše budúce smery sa zameria na veľkoplošné genómovej sekvenovania rôznych klinických izolátov z oblastí s vysokým výskytom rakoviny žalúdka. Podrobnejšie analýzy zapojené do metylácie DNA, rovnako ako obmedzenie a modifikačné systémy by najatraktívnejšie smery pre štúdium H. pylori
indukovanej rakoviny žalúdka.
Súhlas
písomný informovaný súhlas bol získaný od pacienta pre zverejnenie tejto správy a akékoľvek sprievodné obrázky.
Dostupnosť podporných dát
Dodatočné údaje, ktoré podporujú výsledky reportovali tu sú zahrnuté do ďalších súborov.
deklarácia
Poďakovanie
Táto práca bola podporená fond pre Čínu Mega-Project pre infekčné choroby (2011ZX10004-001) a grantom z Národného Technology R &d. Program v 12. päťročný plán Číny (2012BAI06B02)
elektronický doplnkový materiál
13099_2014_126_MOESM1_ESM. doc Ďalší súbor 1: Všeobecné informácie o verejne dostupných genómov (doc 60 KB) 13099_2014_126_MOESM2_ESM.doc Ďalší súbor. 2 :. informácie o zhromaždení pre HLJ039 (dOC 27 KB) Autori ďalej len "pôvodné predložený súbory obrazov
Nižšie sú uvedené odkazy na pôvodné autorov predložený súbory obrazov. "Pôvodný súbor na obrázku 1 13099_2014_126_MOESM4_ESM.tiff autorského 13099_2014_126_MOESM3_ESM.tiff autorov pôvodného súboru na obrázku 2 13099_2014_126_MOESM5_ESM.tiff autorského pôvodného súboru pre obrázok 3 protichodnými záujmami
Autori vyhlasujú, že nemajú žiadne protichodné záujmy.
Autori" príspevky
YY vykonaná analýza bioinformatiky a napísal rukopis; MZ a LH boli zodpovedné za izoláciu a identifikáciu baktérií; LL, XH a YZ vykonaná genómovej sekvenovania; JZ a PN navrhol štúdium a poskytla finančnú podporu pre túto prácu. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Adjuvantná chemo-žiarenia pre adenokarcinóm žalúdka: inštitucionálne experience
• Prípad metastatický leptomeningeal karcinosou od včasného karcinómu žalúdka