PLoS ONE: retinsyre-Aktivert Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin Signa å tillate Xenopus Pancreas, spiserøret, magesekk, og tolvfingertarm Spesifikasjon

Abstract

Hvordan celler integrere flere mønstrings signaler for å oppnå tidlig endoderm regionalisering fortsatt i stor grad ukjent. Mellom gastrulation og neurulation, er retinsyre (RA) signalering er nødvendig, mens Wnt /β-catenin signal må undertrykt for spesifikasjon av bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarm primordia i Xenopus
embryoer. I forsøk på å screene for RA regulerte gener i Xenopus
endoderm, identifiserte vi en direkte RA target genet, N-myc nedstrøms regulert gen 1a ( ndrg1a
) som viste til uttrykk tidlig på archenteron taket endoderm og sent i utviklings bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarm. Både antisense morfolino oligonukleotid-mediert knockdown av ndrg1a
i Xenopus laevis Kjøpe og transkripsjon aktivator lignende effektor nukleaser (Talen) mediert forstyrrelse av ndrg1
i Xenopus tropic
demonstrere at som RA signalering, er Ndrg1a spesielt nødvendig for spesifikasjon av Xenopus
bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarm primordia. Immunofluorescence data tyder på at RA-aktivert Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin signalisering i Xenopus
archenteron taket endoderm celler. Blokkering Wnt /β-catenin signal reddet Ndrg1a knockdown fenotype. Videre overekspresjon av den antatte Wnt /β-catenin målet genet Atf3 phenocopied knockdown av Ndrg1a eller hemming av RA signalering, mens Atf3 knockdown kan redde Ndrg1a knockdown fenotype. Til slutt, bukspyttkjertelen /mage /tolvfingertarm transkripsjonsfaktor Pdx1 var i stand til å redde Atf3 overekspresjon eller Ndrg1a knockdown fenotype. Sammen konkluderer vi med at RA aktivert Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin aliserte til at spesifikasjonen av bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarmen stamceller i Xenopus
embryoer

Citation. Zhang T Guo X, Chen Y (2013) retinsyre-Aktivert Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin Signaliser til Tillat Xenopus
Pancreas, spiserøret, magesekk, og tolvfingertarm spesifikasjon. PLoS ONE 8 (5): e65058. doi: 10,1371 /journal.pone.0065058

Redaktør: Michael Schubert, Laboratoire de Biologie du Développement de Villefranche-sur-Mer, Frankrike

mottatt: 29 desember 2012; Godkjent: 22 april 2013; Publisert: 31. mai 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra National Basic Research Program of China (2009CB941200) og Natural Science Foundation National of China (31271554). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

regionalisering av endoderm skjer samtidig med sin formasjon under gastrulation. Ved utgangen av gastrulation, har bred Antero-posterior (AP) domener innenfor endoderm er etablert, som reflekteres av den fremre uttrykk for Hhex
, vpp1
, Sox2
og Foxa2 Hotell og bakre uttrykk for hale typen homeobox
gener Cdx1
, 2
, og 4
[1], [2], [3]. Til slutt, den endoderm gir opphav til epitelet i luftveiene og gastrointestinale og tilhørende organer, slik som skjoldbruskkjertelen, lunger, bukspyttkjertel, lever og galleblæren. Slekten tracing for virveldyr endodermal organogeneseperioden er i stor grad avhengig av vitale dye merking-baserte skjebne kartlegging studier [4], [5], [6], [7], [8]. Den tidlige uttrykk for hhex Hotell og vpp1
i Xenopus
embryoer kan tjene til å reflektere forløpere for leveren og ventral bukspyttkjertelen, henholdsvis [3]. Så langt er det få konkrete markørgener rapportert, noe som kan avgrenser forløpere for rygg bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarmen under gastrulation og neurulation.

Retinsyre (RA) signalering spiller en konservert rolle i AP mønster av virveldyr endoderm så tidlig som gastrulation [9]. Studier hos frosk, avian, og mus indikerer at RA signalering er spesielt nødvendig for dannelsen av dorsal bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarm primordia [10], [11], [12], [13], [14], [15]. I sebrafisk, er RA signale før utgangen av gastrulation nødvendig for den første utviklingen av både lever- og bukspyttkjertel endoderm [16]. RA aktivert uttrykk for RA-enzym cyp26a1
i fremre bagasjerommet endoderm igjen modulerer RA signalisering og definerer fremre grensen av bukspyttkjertel feltet i sebrafisk embryoer [17]. mnx1
er identifisert som en RA nedstrøms gen som fremmer betacelledannelse i utviklingssebrafisk endokrin bukspyttkjertel [18], mens RA nedstrøms genet exdpf
regulerer fisk eksokrin pankreas utvikling [19]. De endodermal RA målgener som formidler de tidlige aktivitetene til RA signale å spesifisere bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarm anlagen riktig gjenstår å bli identifisert.

Canonical Wnt signal spiller også en viktig rolle i AP fordelingen av virveldyr endoderm. Hos mus, sammensatte knockout av Tcf1 Hotell og Tcf4
førte til en fremre transformasjon av tolvfingertarmen i magen med lite eller ingen tarmen utviklet [20]. Magen mesenchymale transkripsjonsfaktor Barx1-mediert sekresjon av Wnt antagonister SFRP1 og SFRP2 er nødvendig for å inhibere endodermal Wnt /β-catenin signalisering og derved å muliggjøre angivelse av magesekken epitelet [21]. Konsekvent, i Xenopus
, Wnt /β-catenin signal må undertrykt i fremre endoderm mellom gastrula og tidlige somitt stadier av utvikling for å tillate dannelsen av leveren samt bukspyttkjertelen, magesekk, og tolvfingertarm primordia [ ,,,0],22], [23]. Det skilles Wnt antagonist sfrp5
uttrykt i ventral forutgående endoderm koordinerer leveren og ventral bukspyttkjertelen spesifikasjonen ved å motvirke både kanoniske og noncanonical Wnt signal [24], [25]. I tillegg har det vist seg at RA kan undertrykke Xenopus
blastula Wnt /β-catenin signal [26].

N-myc nedstrøms regulert gen 1 (NDRG1) tilhører NDRG protein familie bestående av fire medlemmer, NDRG1-4, som kjennetegnes ved at den inneholder en NDR domene og et α /β hydrolase-gangers motiv [27]. NDRG1
er en RA-induserbar genet i forskjellige cellelinjer og humane pasienter [28], [29], [30], [31]. Ndrg1
mangel på mus fører til Schwann celle dysfunksjon, noe som tyder på at NDRG1 er viktig for vedlikehold av myelin hylser i perifere nerver [32], [33]. Ndrg1
-null mus viste også svekket mastcellemodning og degranulering og svekkede allergiske reaksjoner [34]. I Xenopus
, ndrg1
ble identifisert som et gen beriket for uttrykk i endoderm og pronephros [35], [36]. En fersk studie ved hjelp av kreftcellelinjer viser at metastase suppressor genet, NDRG1, undertrykker Wnt /β-catenin signal ved direkte interaksjon med Wnt reseptor, LRP6, dermed forårsaker undertrykkelse av Wnt /β-catenin target genet, ATF3
uttrykk [37]. Aktivering transkripsjonsfaktor 3 (ATF3) tilhører ATF /syklisk AMP responsive element binding familie av grunnleggende leucine glidelås transkripsjonsfaktorer. Det er en adaptiv respons gen og kan virke både som en transkripsjonen aktivator eller repressor, avhengig av celletype og stimulus [38], [39], [40]. ATF3
knockout mus utviklet seg normalt og viste ingen merkbar fenotyper under normale forhold [41]. I motsetning til dette, transgene mus som uttrykker ATF3 i lever, bukspyttkjertel ductal epitel, eller pankreas beta-celler førte til leverdysfunksjon, defekter i endokrin pankreas utvikling, eller holme dysfunksjon, henholdsvis [41], [42], [43].

i denne studien brukte vi DNA microarray i kombinasjon med hele mount in situ hybridisering for å skjerme RA regulerte gener i Xenopus
endoderm. ndrg1a
ble identifisert og bekreftet aktiveres direkte av RA i archenteron taket endoderm og sent i utviklings bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarm. Vi gir bevis implicating at RA-aktivert Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin signal i archenteron tak endoderm celler og dermed frigjør den hemmende effekten av Wnt /β-catenin signal aktiviteter på dannelsen av bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarm.

Resultater

ndrg1a
, en RA regulert Gene, er Uttrykt Tidlig i endodermal archenteron Roof

Med hensyn til endodermal organogeneseperioden, Xenopus
embryoer behandlet med en RA-antagonist, BMS453, før slutten av gastrulation viste spesifikk tap av dorsal bukspyttkjertel og en del av ventral bukspyttkjertel, mage, duodenum og [10]. For å identifisere RA-regulerte gener i endoderm, vi først gjorde microarray analyse som sammenligner genekspresjon nivåer mellom villtype og RA-manglende embryoer, som ble behandlet med BMS453 ved begynnelsen av gastrulation og ble samlet opp ved trinn 12, 23, og 34, respektivt . De oppnådde data indikerer at genene nedregulert mer enn to ganger ved tre forskjellige stadier viste begrenset overlapping (fig. S1 og tabell S1). I embryoer som er samlet i trinn 23, er det 138 gener som ble ned-regulert mer enn 2-ganger etter BMS453 behandling. I henhold til de 138 genene 'strukturell og funksjonell informasjon som er tilgjengelig i NCBI-databasen, ga vi prioriteter til transkripsjonsfaktorer, kinaser, RNA-bindende proteiner, transmembrane proteiner, så vel som gener som viser endodermal uttrykk, og således valgte 9 gener (tabell S1) til ytterligere analysere sine embryonale uttrykk mønstre av hele mount in situ hybridisering. En av dem, ndrg1a
viste spesifikk ekspresjon tidlig i archenteron taket endoderm (Fig. 1B), som ikke ble påvist ved tidligere studier, antagelig på grunn av utilstrekkelig følsomhet av hele monterings in situ hybridisering teknikk i foregå publikasjoner [35], [36]. Etter avtale med rapporten fra laboratoriet Zorn [35], våre data tyder på at ndrg1a
transkripsjoner ble påvist i rygg endoderm på tidlig halen knopp utviklingsstadium (Fig. 1C, D, E, G). På slutten av halen knopp og rumpetroll stadier av utvikling, i tillegg til sitt uttrykk i øynene, proctodaeum forløpere, og pronephros, ndrg1a
viste konkret uttrykk i svelg, spiserør, bukspyttkjertel, mage og tolvfingertarm (Fig. 1E , F, H, I, J). Vi klarte ikke å påvise ndrg1a
uttrykk i leveren [35]. I stedet, en klar ndrg1a
signal ble observert i å utvikle galleblæren (Fig. 1I, J).

ndrg1a
Expression i archenteron Roof endoderm celler blir direkte aktivert av RA

For ytterligere å verifisere microarray data, analyserte vi ndrg1a
uttrykk i BMS453 og RA behandlet embryoer av hele mount in situ hybridisering. Ved BMS453 behandling, ingen ndrg1a
transkripsjoner ble oppdaget i archenteron tak endoderm celler (fig. 2E) og bare spor av ndrg1a
mRNA forble i rygg endoderm av scenen 22 embryoer (Fig. 2H) . Senere, ndrg1a
uttrykk ble fullstendig undertrykt i rygg bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarm og ble delvis hemmet i ventral bukspyttkjertelen (Fig. 2K, N). I kontrast, kan en annen RA antagonist BMS493 bare delvis hemme ndrg1a
uttrykk i bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarmen [11]. I tillegg ndrg1a
uttrykk i pronephric proksimale tubuli ble også alvorlig hemmet av BMS453 (fig. 2 N). Det bør bemerkes at ndrg1a
uttrykk i øynene, hjernen og galleblæren ble mindre påvirket ved BMS453 behandling (Fig. 2K, N). Det er et vanlig fenomen at for genene uttrykker i bukspyttkjertelen samt i øyet og sentralnervesystemet, slik som ndrg1a
, esr10
, neurod
, og ptf1a /P48
, bare deres bukspyttkjertelen uttrykk hemmes ved BMS453 behandling (fig. 2K, N og [10]). Motsatt, anvendelse av RA til Xenopus
embryoer indusert betydelig utvidelse av ndrg1a
uttrykk domener i archenteron taket endoderm (Fig. 2F), rygg endoderm (Fig. 2I), bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarmen (fig. 2 l, O). Dermed er RA signale nødvendig og tilstrekkelig for å aktivere ndrg1a
uttrykk i archenteron tak endoderm celler.

For å løse hvis RA kan direkte regulere ndrg1a
uttrykk, vi behandlet Xenopus
embryoer med cycloheximide (CHX), et proteinsyntese inhibitor, 15 minutter før påføring av RA. Våre data tyder på at RA indusert utvidelse av ndrg1a
uttrykk i archenteron taket endoderm ble ikke påvirket av CHX (Fig. 2S), støtter forestillingen om at RA aktiverer direkte ndrg1a
uttrykk i archenteron taket endoderm celler. Faktisk ble en RA respons element identifisert i Xenopus tropic ndrg1
promoter-regionen (AGTTCAacAGTTCA -1496bp til -1509bp). I motsetning til Xenopus laevis
, diploid Xenopus tropic
har en ndrg1
genet.

ndrg1a
knockdown i Xenopus
Embryoet Phenocopies BMS453 Behandling

For å generere ndrg1a
morphants, vi kjøpte to ndrg1a
anti morfolino oligo (MO) fra genet verktøy. En dekker ATG startkodonet (MO1) og den andre (MO2) finner i fem utranslaterte område av ndrg1a
cDNA. Effektiviteten ble testet av en in vivo-undersøkelse, der GFP kodingssekvensen ble smeltet til en MO er bindingssetet og den resulterende mRNA ble co-injisert med MO i Xenopus
befruktede egg for å evaluere levende GFP oversettelse i embryoer . Både MO1 (Fig. 3B) og MO2 (Fig. 3F) var i stand til effektivt hemme oversettelsen av GFP åpen leseramme etter den tilsvarende MO1 eller MO2 bindende sekvenser, henholdsvis, mens kontroll MO (Como) ikke klarte å gjøre det (fig. 3A, E).

for å teste om Ndrg1a kan funksjonelt megle RA signale å spesifisere forutgående endoderm, vi injisert MO1, MO2, eller Como separat i vegetal del av alle fire blastomeres av 4-cellers stadium embryoer, samlet embryoene ved trinn 36 og 42, og analysert med et panel av endodermal markørgener. ptf1a Twitter / P48
er spesifikk for bukspyttkjertel forløper celler under tidlig embryo og senere blir begrenset til eksokrin pankreas [10], [44], [45]. pdx1
spesifikt avgrenser utvikle bukspyttkjertel, mage og tolvfingertarmen [46]. insulin
, en endokrin markør genet, er utelukkende uttrykt i rygg bukspyttkjertelen knopp av Xenopus
halen knopp scenen embryoer [47], [48]. PDIP
er en eksokrine pankreas spesifikk markør genet [49]. sox2
markerer spiserør, magesekk og en fremre del av tolvfingertarmen [50]. darmin
er en tarmen spesifikk markør genet [35], [51]. hhex
fungerer som en lever og skjoldbruskmarkørgenet [52]. nkx2
. 1
merkene utviklings lunge og skjoldbrusk [53].

De oppnådde data indikerer at MO1 og MO2 like effektivt avskaffet insulin
, ptf1a Twitter / P48
, PDIP
, pdx1
, og sox2
uttrykk i bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarmen, men hadde liten påvirkning på darmin
, hhex
, og nkx2
. en
uttrykk i tarm, lever, skjoldbruskkjertelen, og lunge, som er meget lik effekten av BMS453 (fig. 4A og [10]). Den eneste forskjellen er at ingen ventral bukspyttkjertelen uttrykk for ptf1a Twitter / P48
, PDIP
, eller pdx1
ble observert i ndrg1a
morphants, men spor av ptf1a Twitter / P48
, PDIP
, og pdx1
uttrykk i ventral bukspyttkjertelen knopper ble opprettholdt i BMS453 behandlet embryoer (fig. 4A og [10]). Den morfologiske fenotype av ndrg1a
knockdown ligner også at av BMS453 behandling. Embryoet injisert med MO1 eller MO2 dukket normal før scenen 40 og senere vist alvorlige mage misdannelser med et tap på gut kveiling og dannelse av ødem (Fig. 4B og [10]). Som MO1 og MO2 forårsaket identiske fenotyper, brukte vi MO1 å gjennomføre resten studiene. Sammen tyder disse data på at RA og Ndrg1a er i samme genetiske hierarkiet i å kontrollere bukspyttkjertel, spiserør, mage, duodenum og utvikling.

Injeksjon av til og med 4 ng ndrg1a
mRNA inn i Xenopus
embryoer forårsaket ingen morfologiske abnormitet eller ekspresjons endringer av markørgener analysert (fig. S2A, B). Samtidig injeksjon av ndrg1a
mRNA med sine Mos kunne ikke redde MO fenotype enten (data ikke vist). Det virker som vi ikke var i stand til å få funksjonelle Ndrg1a protein i Xenopus
embryo gjennom rutinen mRNA injeksjon protokoll som fungerer for de fleste om ikke alle andre gener analysert. En Ndrg1a-GFP konstruksjonen viste at proteinet ble produsert (Fig. S3) .Vi har nylig etablert TALEN mediert genet targeting i Xenopus product: [54]. For ytterligere å verifisere MO fenotype, designet vi ndrg1
Talens i tredje ekson av Xenopus tropic ndrg1
genet (Fig. 5A), som effektivt forårsaket somatiske mutasjoner ved målrettet loci (Fig. 5B). I samsvar med den MO fenotype oppnådd i Xenopus laevis
embryoer, insulin Hotell og pdx1
uttrykk var sterkt hemmet i ndrg1
TALEN mRNA injisert Xenopus tropic
embryoer (fig. 5C), om enn med en lavere frekvens i forhold til MO injiserte de, som skjedde også til anvendelsen av ptf1a /P48
Talens i vår tidligere studie [54]. En stabil ndrg1
knockout frosk linjen er ennå ikke etablert. Vi dissekert 25 froglets som viste bukspyttkjertel, mage og tolvfingertarm hypoplasi eller enda aplasia men med normal lever og galleblære utviklet (Fig. 5D). Dermed disse dataene bekreftet ndrg1a
MO fenotype oppnådd i Xenopus laevis
.

RA Aktivert Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin signale i archenteron Roof endoderm celler til tillater Pancreas , spiserøret, mage og tolvfingertarmen Spesifikasjon

Mekanistisk NDRG1 kan samhandle med Wnt reseptor LRP6 og blokkere Wnt /β-catenin signalisering i kreftcellelinjer [37]. Å spørre om RA aktivert Ndrg1a kan undertrykke Wnt /β-catenin signalisering i Xenopus
embryoer, vi sammenlignet kjernefysisk β-catenin nivåer i ndrg1a
positive archenteron taket endoderm celler av scenen 20 embryo som var utsatt for RA, BMS453 behandling, eller MO1 injeksjon. Immunolocalization av kjernefysisk β-catenin er en pålitelig metode for å karakterisere Wnt /β-catenin signalaktivitet i Xenopus
embryoer [55]. I det valgte området av archenteron taket endoderm, noen få celler viste kjernefysisk β-catenin flekker under normale tilstand, som ble ytterligere mindre på RA behandling. I motsetning til dette antall atom β-catenin positive celler i archenteron taket endoderm økte signifikant ved BMS453 behandling, eller MO1 injeksjon (fig. 6A, B). Sammen utgjør disse data tyder på at RA og Ndrg1a undertrykke Wnt /β-catenin signalisering i Xenopus
archenteron tak endoderm celler.

For å teste om RA, Ndrg1a, og Wnt /β-catenin signal er funksjonelt koblet på samme kaskade i å kontrollere bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarm spesifikasjon, vi co-injisert ndrg1a
MO1 med GR-ΔNTcf3, en dominerende negativ form for Tcf3 smeltet sammen med hormonet-bindende domene av glukokortikoid reseptor som tjener til å undertrykke Wnt /β-catenin signal på deksametason induksjon [56]. Våre data indikerer at undertrykke Wnt /β-catenin signale reddet ndrg1a
knockdown-fenotype (Fig. 7A, B). Ektopisk aktivering av nkx2
. en product: (Fig. 7B44, 45), sox2 plakater (Fig. 7A19, 20 og B24, 25), og foxa1 product: (fig. 7B14, 15), en gaffelhodetranskripsjonsfaktor merking magen, tolvfingertarmen, og proctodaeum [44], er korrelert med tap av darmin
ekspresjon (fig. 7A24, 25, 7B29, 30 ) ved injeksjon av 0,25 ng av GR-ΔNTcf3 mRNA. I tråd med forrige undersøkelse [22], høyere dose (0,8 ng) av GR-ΔNTcf3 mRNA er nødvendig for å indusere ektopisk uttrykk for pdx1 Hotell og for1
, en lever spesifikk markør genet [ ,,,0],22], [57], i Xenopus
embryoer (data ikke vist).

i full forståelse med tidligere studie [22], aktivering av kanoniske Wnt signalering i Xenopus
endoderm av vegetabilsk injeksjon av 0,5 ng av GR-LEFΔN-βCTA mRNA inneholdende Lef1 DNA-bindende domene og den β-catenin trans domene [58] inn i 4 blastomeres av 4-celle trinns embryoer resulterte i identisk fenotype forårsaket av Ndrg1a knockdown i sammenheng med bukspyttkjertel, spiserør, mage, duodenum og utvikling (fig. 7A, B). Undertrykkelsen Effekten av Wnt /β-catenin signalering på dannelsen av leveren (fig. 7A27, 32, B32, 37) og lungen (fig. 7A37, B42), ble det ikke sett i Ndrg1a morphants, noe som tyder på at den tidlige undertrykkelse av Wnt /β-catenin signal på territoriet til lever og lunge forming endoderm utføres av faktorer andre enn RA aktivert Ndrg1a. Samlet utgjør disse data tyder på at Wnt /β-catenin signal er nedstrøms Ndrg1a og er undertrykt av Ndrg1a å tillate spesifikasjon av bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarm.

Atf3, en antatt Wnt /β- catenin Target Gene i Xenopus
Embryoet, hemmer Spesielt Xenopus
Pancreas, spiserøret, magesekk, og Aduodenum Spesifikasjon

Det ble vist at ATF3, en Wnt /β-catenin mål gen i kreftcellelinjer [37], kan enten transcriptionally undertrykke Pdx1
uttrykk [59] eller fysisk samhandle med PDX1 å blokkere PDX1 mediert trans i en murine β-cellelinje [60]. Under Xenopus
embryogenese, atf3
er neppe oppdaget av hele mount in situ hybridisering (Fig. S4). RT-PCR-analyse viste at atf3
uttrykk ble oppregulert på ndrg1a
knockdown eller β-catenin overekspresjon i Xenopus
embryoer (Fig. 8A). Vi fant tre kjerne Tcf /LSF bindingsseter (5'-A /TA /T CAAAG-3 ') i Xenopus tropic atf3
promoter-regionen, som finne på -1 467 bp (TACAAAG), -5591 bp ( AACAAAG) og -8889 bp (AACAAAG), henholdsvis. Sammen utgjør disse data tyder på at atf3
er også en Wnt /β-catenin target genet i Xenopus
embryoer. Påfallende, overekspresjon av Atf3 i Xenopus
endoderm førte til fullstendig tap av insulin
, ptf1a Twitter / P48
, PDIP
pdx1
, foxa1
, og sox2
uttrykk i bukspyttkjertelen, spiserøret, magesekken, og tolvfingertarmen, men hadde ingen åpenbar effekt på darmin
hhex
, og nkx2
. en
uttrykk (fig. 8B, C), som er akkurat identisk med ndrg1a
knockdown fenotype (fig . 4A). Enda viktigere, atf3
MO, som alene skyldes mindre effekter på uttrykket av markørgener analysert, var i stand til å redde insulin
, ptf1a Twitter / P48
, PDIP
, foxa1
, og sox2
uttrykk hemmet av ndrg1a
MO (fig. 9A, B). Videre Pdx1 var i stand til å redde Atf3 overekspresjon eller Ndrg1a knockdown fenotype med hensyn til ptf1a Twitter / P48
, PDIP
, foxa1
, og sox2
uttrykk bortsett insulin plakater (fig. 9A, B). Det er kjent at Pdx1 er verken nødvendig eller tilstrekkelig for aktivering av tidlig insulin
uttrykk i Xenopus
embryoer [44]. Alt i alt har våre data tyder på en epistasis som RA aktivert Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin signalering og følgelig frigjør undertrykkelse aktiviteten av Wnt /β-catenin signaleringsaktiviteter, som kan være delvis mediert ved Atf3, på bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarm formasjon.

Diskusjoner

ndrg1a
er direkte aktivert av RA i archenteron taket endoderm celler av Xenopus
neurulae. Nuclear β-catenin nivået er svært lavt i archenteron tak endoderm celler, og det ser ut til at RA aktivert Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin signalisering i disse cellene. Knockdown av ndrg1a
ligner inhibering av RA signalering eller aktivering av Wnt /β-catenin signalisering i Xenopus
embryoer med hensyn til bukspyttkjertel, spiserør, mage, duodenum og utvikling, noe som fører til en nesten fullstendig tap av spesifikasjonen av disse organ primordia. Blokkering Wnt /β-catenin signal kan redde ndrg1a
knockdown fenotype. Dermed koordinerer Ndrg1a RA og Wnt /β-catenin signal i spesifikasjonen av Xenopus
bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarm.

ndrg1a
kan være en spesifikk markør Gene for Dorsal Pancreas, spiserøret, magesekk, og tolvfingertarm Forløpere i Xenopus
Neurulae

Flere studier har beskrevet microarray basert screening av RA responsive gener i Xenopus product: [61] eller sebrafisk [17], [18], [62] embryoer. Ved hjelp av microarray i kombinasjon med hele mount in situ hybridisering, vi var i stand til å identifisere archenteron taket endoderm bestemt gen ndrg1a., En vital fargestoff flekker basert skjebne kartleggingsstudie har vist at archenteron taket endoderm celler senere gi opphav til dorsal bukspyttkjertelen , spiserør, mage, duodenum og [5]. Shirin
ser ut til å bli uttrykt i Xenopus
archenteron tak endoderm, men i mellomtiden er det også uttrykt i mesoderm og ektoderm [63]. fetuinish
spesifikt angir archenteron taket endoderm i Xenopus
tidlig neurulae, men senere viser den ekspresjon i lever og tarm, med ingen ekspresjon i bukspyttkjertel, spiserør, mage, duodenum og [35]. Bare ndrg1a
viser konsistent uttrykk tidlig i archenteron taket endoderm og senere i bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarm. Vi spekulerer i at ndrg1a
kan tjene som en spesifikk rygg bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarm forløper markørgenet i Xenopus
som gjenstår å bli bekreftet av genetiske avstamning sporing studier.

Ndrg1a er uunnværlig for Xenopus
Pancreas, spiserøret, magesekk, og tolvfingertarm Spesifikasjon

Tidlig endodermal uttrykk for cyp26a1 Hotell og cdx4
i sebrafisk embryoer ser ut til å motvirke RA signalering fra mesoderm å sette fremre og bakre grensene for pankreatisk område henholdsvis [17], [64]. ndrg1a
er den første genet er identifisert som blir direkte aktivert av RA i tidlig Xenopus
archenteron tak endoderm celler, og det medierer RA signalering til positivt mønster endoderm celler i bukspyttkjertel, spiserør, mage, duodenum og . Både MO basert knockdown av ndrg1a Hotell og TALEN mediert forstyrrelse av ndrg1a
vise at Ndrg1a aktiviteten i Xenopus
endoderm mønster er uunnværlig, som ikke ble observert i Ndrg1
knockout mus [32], [33], [34]. En forklaring på dette avviket er at den essensielle rollen Ndrg1a i Xenopus
endodermal mønster ikke er konservert hos pattedyr. Alternativt, ingen endodermal organskader rapportert i mus Ndrg1
gene targeting studier kan skyldes utett uttrykk for NDRG1 i Ndrg1
mangelfull mus [32], [33] eller på grunn av funksjonell redundans blant NDRG familiemedlemmer 1-4 i mus.

En rekke studier viser at overekspresjon av NDRG1 i kreftcellelinjer genererer iøynefallende fenotyper [27]. Det er også rapportert at overekspresjon av Ndrg1a i Xenopus
embryoer fører til et redusert pronephros og uorganiserte somites [36]. For ukjente grunner, kan vi ikke få ektopisk Ndrg1a i funksjon i Xenopus
embryoer. Det bør påpekes at en forkortet versjon av Ndrg1a med de første 48 aminosyrer i den N-terminale mangler ble benyttet for både mRNA injeksjon og MO utforming i den tidligere studie [36]. Vi prøvde også mRNA injeksjon med denne korte versjonen og de injiserte embryoene var sunn, selv ved høy dose (4 ng av mRNA). Vi kunne ikke redde våre ndrg1a
MO fenotype med denne forkortet versjon av Ndrg1a heller. Til slutt, den sterke endodermal uttrykk for ndrg1a
illustrert i vår studie og beskrevet av Costa et al. [35] ble ikke påvist i denne studien [36].

Ndrg1a mediert Høring mellom RA og Wnt /β-catenin Signa er begrenset til Xenopus
Pancreas, spiserøret, magesekk, og tolvfingertarm Forming celler

Under embryogenesen må cellene stadig integrere flere signalveier for å oppnå sine distinkte skjebne til rett tid og sted. Den integrerte rolle FGF, RA, og Wnt signalveier i spesifisere lunge primordium og kontrollerende lunge knopp vekst definert i mus [65] er bevart i Xenopus product: [66]. Hos mus, ser det ut til at RA undertrykker Wnt antagonist DKK1
uttrykk i den potensielle lunge endoderm av E8.5-E9.5 embryoer, kan dermed kanoniske Wnt signal mediert lunge spesifikasjonen [65]. RA og Wnt trasé er forbundet med RA nedstrøms målgener osr1 Hotell og OSR2
å opprettholde brystfinnen utvikling i sebrafisk [67]. Sammen utgjør disse sakene avslører en omstendighet som RA fremmer Wnt /β-catenin signalering.

Her gir vi overbevisende bevis som viser for første gang, så vidt vi vet, at RA aktivert endodermal uttrykk for Ndrg1a undertrykker Wnt /β -catenin signalering og frigjør dermed undertrykkelse aktiviteten av Wnt /β-catenin signalering på Xenopus
bukspyttkjertel, spiserør, magesekk og tolvfingertarm formasjon, noe som ikke gjelder for leveren og lungene spesifikasjon. Til støtte for våre funn, kan overekspresjon av en utskilt Wnt antagonist Sfrp5 erstatte RA i forhold til induksjon av eksokrin pankreas differensiering i Vegt injisert dyre caps i Xenopus product: [24]. De skadelige effektene av tidlig ektopisk Wnt /β-catenin signalaktivering på lever og lunge knopp formasjon sett i denne studien, samt i en tidligere studie [22] er ikke motstridende til den positive rollen som kanoniske Wnt signal fremme lever og lunge utvikling, som ble observert når Wnt /β-catenin signal ble aktivert i Xenopus
embryoer fra trinn 30 til 42 for lever og fra trinn 28 til 35 for lunge, henholdsvis [22], [66]. Undertrykkelsen effekten av RA på Xenopus
blastula Wnt /β-catenin signal [26] er usannsynlig formidlet av Ndrg1a, siden ndrg1a
er ikke matern gitt og dens zygotiske uttrykk er ikke aktivert før neurulation Slik det er åpenbart av både hel montere in situ hybridisering og RT-PCR-analyser (fig. 1 A, [36], og data ikke vist). Det gjenstår å bli undersøkt om Ndrg1a kan samhandle med Lrp6 og hvordan Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin signalisering i Xenopus
embryoer.

Materialer og metoder

Etikk erklæringen

Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health.

• PLoS ONE: Kirurgisk behandling for pasienter med Krukenberg Tumor av magen Origin: klinisk utfall og prognostiske faktorer analyse
• PLoS ONE: Cathepsin E er en markør for Gastric Differensiering og Signet-Ring Cell Carcinoma av magen: A Novel forslag på Gastric Tumorigenesis