Miten solut yhdistää useita kuviointi signaalit saavuttaa varhain Endodermi alueellistamista edelleen suurelta osin tuntemattomia. Välillä gastrulaation ja neurulaatio, retinoiinihappo (RA) signalointi tarvitaan, kun Wnt /β-kateniinin signalointi on tukahdutettu varten erittely haima, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen primordia in Xenopus Citation: Zhang T Guo X, Chen Y (2013) retinoiinihappo-aktivoitu Ndrg1a tukahduttaa Wnt /β-kateniinin Signaling Salli Xenopus Editor: Michael Schubert, Laboratoire de Biologie du Développement de Villefranche-sur-Mer, Ranska vastaanotettu: 29 joulukuu 2012; Hyväksytty: 22 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 31, 2013 Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään. Rahoitus: Tämä työ tukivat varat kansallisesta Basic Research Program of China (2009CB941200) ja National Natural Science Foundation of China (31271554). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole. alueellistaminen Endodermi tapahtuu samanaikaisesti sen muodostamisen aikana gastrulaation. Vuoden loppuun gastrulaation, laaja antero-posterior (AP) verkkotunnuksia sisällä endodermissä on perustettu, mikä heijastuu etummaisessa ilmaus Hhex Retinoiinihappoa (RA) signalointi näyttelee säilytetyn rooli AP kuviointi selkärankaisen Endodermi jo gastrulaation [9]. Studies in sammakko, linnun, ja hiiret osoittavat, että RA signalointi nimenomaisesti vaatii muodostumista selkä haiman, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen primordia [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Vuonna seeprakala, RA signalointi ennen loppua gastrulaation tarvitaan alkukehityksestä sekä maksan ja haiman Endodermi [16]. RA aktivoitu ilmentyminen RA-hajottavan entsyymin cyp26a1 Canonical Wnt signalointia myös tärkeä rooli AP kuviointi selkärankainen Endodermi. Hiirillä, yhdiste tyrmäys Tcf1 N-myc alavirtaan säännelty geenistä 1 (NDRG1) kuuluu NDRG proteiiniin perhe koostuu neljä jäsentä, NDRG1-4, joille on tunnusomaista, että se sisältää NDR domeeni ja α /β-hydrolaasi-kertainen motiivi [27]. NDRG1 tässä tutkimuksessa käytimme DNA-siru yhdessä koko vuori in situ seulomiseksi RA geenien in Xenopus tulokset ndrg1a osalta endodermaalinen organogeneesin, Xenopus edelleen todentamiseksi microarray data, analysoimme ndrg1a Vastatakseen jos RA voi suoraan säädellä ndrg1a Voit luoda ndrg1a voit testata Ndrg1a voi toiminnallisesti välittää RA signalointi täsmentää foregut Endodermi, me pistetään MO1, MO2 tai Como erikseen osaksi kasvi osa kaikkia neljää blastomeerien 4-cell vaiheessa alkiot, kerätty alkiot vaiheissa 36 ja 42, ja analysoitiin paneelin kanssa endodermaalisissa markkerigeeni. ptf1a Twitter / p48 Saadut mukaan MO1 ja MO2 yhtä tehokkaasti lakkautetaan insuliini Injection jopa 4 ng ndrg1a Mekanistisesti NDRG1 olla vuorovaikutuksessa Wnt reseptorin LRP6 ja estää Wnt /β-kateniinin signalointi syöpäsolulinjoissa [37]. Kysymään RA aktivoitu Ndrg1a voi tukahduttaa Wnt /β-kateniinin signalointi Xenopuksen Voit testata RA, Ndrg1a, ja Wnt /β-kateniinin signalointi ovat toiminnallisesti liittyvät samaan kaskadin kontrolloinnissa haimassa, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen erittely, teemme yhteistyötä pistetään ndrg1a täysin samaa mieltä aiemman tutkimuksen [22], aktivointi kanoninen Wnt signaloinnin Xenopus on osoitettu, että ATF3, joka on Wnt /β-kateniinin tavoite geeni syöpäsolulinjoissa [37], voivat joko kopiointia repressoivat Pdx1 keskustelu ndrg1a Useat tutkimukset ovat kuvattu microarray perustuva seulonta RA reagoivien geenien Xenopus Ndrg1a on Korvaamaton Xenopus Early endodermaalinen ilmaus cyp26a1 Useat tutkimukset osoittavat, että yli-ilmentyminen NDRG1 syöpäsolulinjoissa synnyttää näkyvään fenotyypit [27]. On myös kerrottu, että yliekspressio Ndrg1a in Xenopuksen aikana alkionkehityksen solut on jatkuvasti yhdistää useita signalointireittien saavuttamaan erilliset kohtalo oikeaan aikaan ja paikkaan. Integroitu rooli FGF, RA, ja Wnt signaalireaktioteissä täsmennetään keuhkojen primordium ja valvoa keuhkojen alkuunsa kasvu määritellään hiirillä [65] on konservoitunut Xenopus Täällä tarjoamme vakuuttavia todisteita, jotka osoittavat ensimmäistä kertaa, että tietomme, että RA aktivoitu endodermaalinen ilmaus Ndrg1a tukahduttaa Wnt /β kateniinin signalointi ja siten vapauttaa suppressioaktiivisuutta Wnt /β-kateniinin signalointia Xenopus
alkioita. Yrittäessään seuloa RA geenien in Xenopus
Endodermi, olemme tunnistaneet suoraan RA kohdegeeni, N-myc alavirtaan säädellä geenin 1a ( ndrg1a
), joka osoitti ekspressiota aikaisin archenteron katon Endodermi ja myöhään kehittämisessä haima, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen. Molemmat antisense morfolino oligonukleotidikohde- knockdovvn ndrg1a
in Xenopus laevis
ja transkriptio aktivaattori kaltainen efektori nukleaasien (kielet) välittämää häiriöitä ndrg1
in Xenopus tropicalis
osoittavat, että kuten RA signalointi, Ndrg1a vaatii nimenomaan määrittelystä Xenopus
haima, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen primordia. Immunofluoresenssikoe tiedot viittaavat siihen, että RA-aktivoitu Ndrg1a tukahduttaa Wnt /β-kateniinin signalointi Xenopus
archenteron katto Endodermi soluja. Esto Wnt /β-kateniinin signalointi pelastettu Ndrg1a knockdown fenotyyppi. Lisäksi yli-ilmentyminen oletetun Wnt /β-kateniinin kohdegeenin Atf3 phenocopied knockdovvn Ndrg1a tai estämiseksi RA signaloinnin, kun taas Atf3 pudotus voi pelastaa Ndrg1a pudotus fenotyyppi. Lopuksi haima /vatsa /pohjukaissuoli transkriptiotekijä Pdx1 pystyi pelastamaan Atf3 yli-ilmentymisen tai Ndrg1a knockdown fenotyyppiä. Yhdessä voimme päätellä, että RA aktivoitu Ndrg1a tukahduttaa Wnt /β-kateniinin signalointia, jotta erittely haima, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen kantasolujen Xenopus
alkioita.
haima, ruokatorvi, mahalaukku, ja pohjukaissuoli Specification. PLoS ONE 8 (5): e65058. doi: 10,1371 /journal.pone.0065058
Johdanto
, vpp1
, Sox2
, ja Foxa2
ja takaosan ilmaus caudal tyyppi homeobox
geenien Cdx1
, 2
, ja 4
[1], [2], [3]. Lopulta endodermistä aiheuttaa epiteelissä hengitys- ja mahasuolikanavaa ja niihin liittyvät elimet, kuten kilpirauhasen, keuhkojen, haiman, maksan ja sappirakon. Perintölinjan jäljityksen selkärankaisten endodermaalinen organogeneesin on pitkälti riippuvainen vitaaliväriaineen merkintöjä perustuva kohtalo kartoitus tutkimuksissa [4], [5], [6], [7], [8]. Varhainen ilmaus hhex
ja vpp1
in Xenopuksen
alkioiden saattaisi palvella heijastaa esiasteita maksassa ja ventraaliseen haiman vastaavasti [3]. Toistaiseksi on olemassa muutamia erityisiä markkerigeeni ilmoiteta, joka voi rajata esiasteita selkä haima, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen aikana gastrulaation ja neurulaatio.
etummaisessa runko endodermissä puolestaan moduloi RA signalointia ja määrittelee eturaja haiman kentän seeprakala alkioiden [17]. mnx1
tunnistetaan RA alavirran geenin, joka edistää beeta solujen muodostumista kehittyvissä zebrafish haiman [18], kun taas RA alavirtaan geenistä exdpf
säätelee kalan haimassa kehitys [19]. Endodermaalinen RA kohdegeenien jotka välittävät varhainen toimintaa RA signaloinnin määritellä haima, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen anlagen asianmukaista vielä tunnistamatta.
ja TCF4
johti etummainen muutosta pohjukaissuoli osaksi mahan vähän tai ei lainkaan suolen kehittynyt [20]. Vatsa Mesenkymaaliset transkriptiotekijä Barx1 välittämää eritys Wnt antagonistien SFRP1 ja SFRP2 tarvitaan estämään endodermaalinen Wnt /β-kateniinin signalointi ja siten mahdollistamaan erittely mahalaukun epiteelin [21]. Johdonmukaisesti, in Xenopus
, Wnt /β-kateniinin signalointi on tukahdutettu etulohkon Endodermi välillä gastrula ja varhaisessa somiitti kehitysvaiheissa muodostamisen mahdollistamiseksi maksan sekä haima, vatsa, ja pohjukaissuoli primordia [ ,,,0],22], [23]. Erittynyt Wnt antagonisti sfrp5
ilmaistu vatsanpuoleisissa foregut Endodermi koordinoi maksassa ja vatsanpuoleinen haima erittely vastavaikuttamalla sekä kanonisen ja noncanonical Wnt signalointia [24], [25]. Lisäksi on osoitettu, että RA voi tukahduttaa Xenopus
blastula Wnt /β-kateniinin signalointi [26].
on RA-geenin, erilaisissa solulinjoissa ja ihmisen potilaille [28], [29], [30], [31]. Ndrg1
puute hiirillä johtaa Schwannin solujen toimintahäiriö, mikä viittaa siihen, että NDRG1 on välttämätöntä ylläpito myeliinieristettä ääreishermoissa [32], [33]. Ndrg1
-null hiirillä osoittivat myös heikentynyt syöttösolujen kypsymisen ja degranulation ja heikennettyjä allergisia vasteita [34]. In Xenopus
, ndrg1
tunnistettiin geenin rikastettu ilmentämistä varten endodermi ja pronephros [35], [36]. Tuoreessa tutkimuksessa käyttäen syöpäsolulinjoissa paljastaa, että kasvaimen etäpesäkkeiden estävä geeni, NDRG1, tukahduttaa Wnt /β-kateniinin signaloinnin suoraan vuorovaikutuksessa Wnt-reseptorin, LRP6 näin ollen aiheuttaa tukahduttaminen Wnt /β-kateniinin kohdegeenin, ATF3
ilme [37]. Aktivoiva transkriptiotekijä 3 (ATF3) kuuluu ATF /syklisen AMP reagoiva elementti sitova perheen perus leusiinivetoketjun transkriptiotekijöitä. Se on adaptiivinen vaste-geeni ja voi toimia sekä transkription aktivaattori tai repressorin riippuen solutyypistä ja ärsykkeen [38], [39], [40]. ATF3
hiirten kehittyi normaalisti ja eivät osoittaneet havaittavaa fenotyyppiä normaaliolosuhteissa [41]. Sen sijaan, siirtogeenisiä hiiriä, jotka ekspressoivat ATF3 maksassa, haimatiehyen epiteelin tai haiman β-solujen johti maksan vajaatoimintaa, viat haiman kehittämiseen, tai islet toimintahäiriö, vastaavasti [41], [42], [43].
Endodermi. ndrg1a
tunnistettiin ja tarkasti sitä suoraan aktivoida RA on archenteron katon endodermi ja myöhään kehittämisessä haima, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen. Tarjoamme todisteita syytetään, että RA-aktivoitu Ndrg1a tukahduttaa Wnt /β-kateniinin signalointia archenteron katon endodermi soluja ja näin ollen vapauttaa estävää vaikutusta Wnt /β-kateniinin signaloinnin toiminnan muodostumista haiman, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen.
, RA Säännellyt Gene, on ilmaistuna Aikaisin endodermaalinen Archenteron Katto
alkiot käsitelty RA antagonisti, BMS453, ennen loppua gastrulaation näytetään tiettyjä menetys selkä haima ja osa ventraalisten haiman, mahalaukun ja pohjukaissuolen [10]. Tunnistaa RA geenien in Endodermi, ensin ei microarray-analyysillä vertaamalla geenin ilmentymisen tasojen villityypin ja RA-puutteellisia alkioita, jotka käsiteltiin BMS453 alussa gastrulaation ja kerättiin vaiheissa 12, 23, ja 34, vastaavasti . Saadut osoittavat, että geenit alassäädetty yli 2-kertainen kolmessa eri vaiheessa osoitti rajoitettu päällekkäisyys (Fig. S1 ja taulukko S1). Vuonna alkiot kerätään vaiheessa 23, on 138 geeniä, jotka olivat alassäädetty yli 2-kertainen, kun BMS453 hoitoa. Mukaan 138 geenit "rakenteellisia ja toiminnallisia tietoja saatavilla NCBI tietokantaan, annoimme painopisteet transkriptiotekijät, kinaasit, RNA sitovia proteiineja, transmembraaniproteiineja, sekä geenit osoittavat endodermaalinen ilmaisun, ja siten valitsi 9 geenejä (taulukko S1) ja analysoida tarkemmin niiden alkion ilmaisua kuvioita koko vuori in situ. Yksi heistä, ndrg1a
, osoitti erityinen ilmaus aikaisin archenteron katon endodermissä (Fig. 1 B), joka ei havaittu aikaisemmissa tutkimuksissa, oletettavasti riittämättömän herkkyyden koko mount in situ -hybridisaatiotekniikkaa aiemmissa julkaisuista [35], [36]. Yhteisymmärryksessä raportti Zorn laboratorio [35], meidän tiedot osoittavat, että ndrg1a
transkriptit havaittiin selkä Endodermi varhaisessa hännän alkuunsa kehitysvaiheessa (Fig. 1 C, D, E, G). Myöhään hännän alkuunsa ja tadpole kehitysvaiheissa, lisäksi sen ilmentymistä silmä, proctodaeum esiasteita, ja pronephros, ndrg1a
osoitti erityismääräys nielu, ruokatorvi, haima, vatsa, ja pohjukaissuolen (Fig. 1 E , F, H, I, J). Emme pystyneet havaitsemaan ndrg1a
ilmentymistä maksassa [35]. Sen sijaan, selkeä ndrg1a
signaali havaittiin kehittämisessä sappirakko (Fig. 1I, J).
ndrg1a
ilmentäminen Archenteron Katto Endodermi Cells aktivoituu suoraan RA
ilmaisun BMS453 ja RA käsiteltiin alkioiden koko vuori in situ. Kun BMS453 hoito, ei ndrg1a
transkriptit havaittiin archenteron katto Endodermi soluja (Kuva. 2E) ja vain hyvin pieniä määriä ndrg1a
mRNA pysyi selkä Endodermi vaiheen 22 alkioiden (Fig. 2 H) . Myöhemmin, ndrg1a
ilmentyminen oli täysin tukahdutettu selkä haimassa, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen ja osittain inhiboitui ventral haimassa (kuvio. 2K, N). Sen sijaan toinen RA-antagonisti BMS493 voi vain osittain estää ndrg1a
ekspressiota haimassa, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen [11]. Lisäksi, ndrg1a
ilmentymisen pronephric proksimaalitiehyeet myös vakavasti inhiboi BMS453 (Fig. 2 N). On syytä huomata, että ndrg1a
ilmentymistä silmä, aivoissa, ja sappirakon kärsivät vähemmän, kun BMS453 hoitoon (Fig. 2K, N). Se on yleinen ilmiö, että geenejä haimassa sekä silmien ja keskushermostoon, kuten ndrg1a
, esr10
, NeuroD
, ja ptf1a /P48
, vain niiden haiman ilmentyminen inhiboituu BMS453 hoitoon (Fig. 2K, N ja [10]). Toisaalta soveltaminen RA Xenopuksen
alkioiden indusoi merkittävän laajentamisen ndrg1a
ilmaisun verkkotunnuksia archenteron katto Endodermi (Fig. 2F), selkä Endodermi (Fig. 2 I), haima, ruokatorvi-, maha- ja pohjukaissuoli (Fig. 2 I, O). Niinpä RA signalointi on välttämätön ja riittävä aktivoimaan ndrg1a
ilmaisun archenteron katon endodermissä soluja.
ilme, käsittelimme Xenopus
alkioiden sykloheksimi- (CHX), proteiinisynteesin estäjää, 15 minuuttia ennen soveltamista RA. Tuloksemme osoittavat, että RA aiheuttama laajeneminen ndrg1a
ilmaisun archenteron katto Endodermi ei vaikuttanut CHX (Fig. 2S), tukee käsitystä, että Ra aktivoi suoraan ndrg1a
ilmaisun archenteron katon Endodermi solut. Todellakin, RA vaste-elementin todettiin Xenopus tropicalista ndrg1
promoottorialue (AGTTCAacAGTTCA -1496bp on -1509bp). Toisin kuin Xenopus laevis
, diploidinen Xenopus tropicalista
on yksi ndrg1
geeni.
ndrg1a
Knockdown in Xenopus
Alkiot Phenocopies BMS453 Treatment
morphants, ostimme kaksi ndrg1a
antisense morfolino oligot (MO) päässä Gene työkalut. Yksi kattaa ATG-aloituskodoni (MO1) ja toinen (MO2) etsii transloimattoman 5'-alueen ndrg1a
cDNA. Niiden tehokkuus testattiin in vivo määritys, jossa GFP koodaava sekvenssi fuusioitiin MO: n sitoutumiskohdan ja tuloksena mRNA yhteistyössä ruiskutetaan MO osaksi Xenopus
hedelmöittynyt munat arvioida elävien GFP käännös alkioiden . Molemmat MO1 (Fig. 3B) ja MO2 (Fig. 3F) pystyivät tehokkaasti estämään translaatiota GFP: n avoimen lukukehyksen jälkeen vastaavan MO1 tai MO2 sitoutuvat sekvenssit, vastaavasti, kun taas ohjaus MO (Como) ei tehdä niin (Fig. 3A, E).
on spesifinen haiman esiastesolujen alkuvuodesta sikiönkehityksen ja myöhemmin tulee rajoitettu haimassa [10], [44], [45]. pdx1
erityisesti rajataan kehittää haimassa, mahassa, ja pohjukaissuoli [46]. insuliini
, hormonitoimintaa markkerigeeni, on yksinomaan ilmaistaan selkäpuoli haiman alkuunsa Xenopus
tail nuppuasteella alkioiden [47], [48]. PDIP
on haimassa erityisiä markkerigeeni [49]. Sox2
merkitsee ruokatorven, mahalaukun ja etummainen osa pohjukaissuolesta [50]. darmin
on suolistossa erityinen markkerigeeni [35], [51]. hhex
toimii maksan ja kilpirauhasen markkerigeeni [52]. nkx2
. 1
markkaa keuhko- ja kilpirauhasen [53].
, ptf1a Twitter / P48
, PDIP
, pdx1
, ja Sox2
ilmaisun haimassa, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen, mutta oli vähäinen vaikutus darmin
, hhex
, ja nkx2
. 1
ilmentymisen suolistossa, maksan, kilpirauhasen, ja keuhko, joka on hyvin samanlainen vaikutus BMS453 (Fig. 4A ja [10]). Ainoa ero on, että ei ole ventraalinen haiman ilmentymistä ptf1a
/ p48
, PDIP
, tai pdx1
havaittiin ndrg1a
morphants, mutta jälkiä ptf1a Twitter / P48
, PDIP
, ja pdx1
ilmaisun vatsanpuoleisissa haiman silmut pidettiin BMS453 käsitelty alkioiden (Fig. 4A ja [10]). Morfologiset fenotyyppi ndrg1a
Knockdown myös muistuttaa BMS453 hoitoa. Alkiot pistetään MO1 tai MO2 näyttivät normaaleilta ennen vaihetta 40 ja sen jälkeen näytetään vaikea suolen epämuodostumia menetyksen kanssa suoliston coiling ja alaraajan turvotusta (Fig. 4B ja [10]). Kuten MO1 ja MO2 aiheutti samanlaisia fenotyyppejä, käytimme MO1 suorittaa loput tutkimuksia. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että RA ja Ndrg1a ovat samassa geneettinen hierarkian säätelyssä haimassa, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen kehittämiseen.
mRNA Xenopus
alkioiden aiheuttama ole morfologisia poikkeavuuksia tai ilmentymisen muutoksia markkerin geenejä analysoitiin (kuvio. S2A, B). Co-injektio ndrg1a
mRNA sen MOS voinut pelastaa MO fenotyyppiä joko (tuloksia ei ole esitetty). Näyttää siltä, että emme voineet saada toiminnallinen Ndrg1a proteiinia Xenopuksen
alkioiden läpi rutiini mRNA injektio protokolla, joka toimii useimpien, ellei kaikkien muiden geenien analysoitiin. Ndrg1a-GFP konstrukti osoitti, että proteiini tuotettiin (Fig. S3) Meillä on äskettäin perustettu Talen välittämä geenin kohdentaminen Xenopus
[54]. Edelleen todentamiseksi MO fenotyyppi, suunnittelimme ndrg1
Talens sisällä kolmas eksoni Xenopus tropicalista ndrg1
geenin (Fig. 5A), joka tehokkaasti aiheutti somaattiset mutaatiot kohteena loci (Fig. 5B). Yhdenmukainen MO fenotyyppi saatu Xenopus laevis
alkioita, insuliinin
ja pdx1
ilmentyminen oli pahasti lukittuna ndrg1
Talen mRNA pistetään Xenopus tropicalista
alkioiden (Fig. 5C), joskin harvemmin verrattuna MO pistetään niitä, mikä tapahtui myös soveltamiseen ptf1a /p48
Talens edellisessä tutkimuksessa [54]. Vakaa ndrg1
tyrmäys sammakko linja on vielä perustettava. Me leikataan 25 froglets joka osoitti haiman, mahalaukun ja pohjukaissuolen hypoplasiaa tai jopa aplasia mutta joilla oli normaali maksan ja sappirakon kehittynyt (Fig. 5D). Siten nämä tiedot vahvistivat ndrg1a
MO fenotyyppi saatu Xenopus laevis
.
RA Aktivoidut Ndrg1a tukahduttaa Wnt /β-kateniinin Signaling in Archenteron Katto Endodermi Solut Salli haima , ruokatorvi, mahalaukku, ja pohjukaissuoli Specification
alkioita, vertasimme ydin- β-kateniinin tasoilla ndrg1a
positiivinen archenteron katto Endodermi soluja vaiheessa 20 alkioita, jotka olivat altistetaan RA, BMS453 hoitoa tai MO1 injektio. Immunolokalisoinnissa ydinaseiden β-kateniinin on luotettava tapa luonnehtia Wnt /β-kateniinin signalointi aktiivisuutta Xenopuksen
alkioita [55]. Valitulla alueella archenteron katto Endodermi, muutaman solut osoittivat ydin- β-kateniinin värjäys normaaliolosuhteissa, josta tuli vielä vähemmän kun RA hoitoa. Sen sijaan, useita ydin- β-kateniinin positiivisten solujen archenteron katon endodermissä kasvoi merkittävästi, kun BMS453 hoitoon, tai MO1 injektio (Fig. 6A, B). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että RA ja Ndrg1a tukahduttaa Wnt /β-kateniinin signalointi Xenopus
archenteron katto Endodermi soluja.
MO1 kanssa GR-ΔNTcf3, dominantti negatiivinen muoto Tcf3 fuusioitiin hormonia sitovan domeenin glukokortikoidireseptorin palvelevat tukahduttamiseksi Wnt /β-kateniinin signalointi upon deksametasoni induktion [56]. Meidän tiedot osoittavat, että tukahduttaa Wnt /β-kateniinin signalointi pelastettiin ndrg1a
taintumisen fenotyypin (Fig. 7A, B). Kohdunulkoinen aktivointi nkx2
. 1
(Fig. 7B44, 45), Sox2
(Fig. 7A19, 20 ja B24, 25), ja foxa1
(Fig. 7B14, 15), joka on forkhead transkriptiotekijän merkintä mahalaukku, pohjukaissuoli, ja proctodaeum [44], korreloi menetys darmin
ilmentymistä (Fig. 7A24, 25, 7B29, 30 ) injektoimalla 0,25 ng GR-ΔNTcf3 mRNA. Linjassa edellisessä tutkimuksessa [22], suurempi annos (0,8 ng) GR-ΔNTcf3 mRNA tarvitaan aiheuttamaan ektooppinen ilmentymisen pdx1
ja for1
, maksan erityinen markkerigeeni [ ,,,0],22], [57] ja Xenopuksen
alkioiden (tuloksia ei ole esitetty).
Endodermi mukaan kasviperäistä injektoimalla 0,5 ng GR-LEFΔN-βCTA mRNA, joka sisältää Lef1 DNA: ta sitova domeeni ja β-kateniinin transaktivaatiodomeenin [58] otetaan 4 blastomeerien 4-solu vaiheen alkioiden johti identtisiä fenotyypin aiheuttama Ndrg1a pudotus yhteydessä haiman, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen kehitys (Fig. 7A, B). Tukahduttaminen vaikutus Wnt /β-kateniinin signalointi muodostumista maksassa (Kuva. 7A27, 32, B32, 37) ja keuhkojen (Fig. 7A37, B42), ei todettu Ndrg1a morphants, mikä viittaa siihen, että varhainen tukahduttaminen Wnt /β-kateniinin signalointi alueella maksan ja keuhkojen muodostava Endodermi suoritetaan muut tekijät kuin RA aktivoitu Ndrg1a. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että Wnt /β-kateniinin signalointi on alavirtaan Ndrg1a ja repressoituu Ndrg1a jotta erittely haima, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen.
Atf3, otaksutun Wnt /β- kateniinin Target Gene in Xenopus
Alkiot, inhiboi spesifisesti Xenopus
haima, ruokatorvi, mahalaukku, ja Aduodenum Specification
ilmaisun [59] tai fyysisesti vuorovaikutuksessa PDX1 estää PDX1 välittämää transaktivaatiota hiiren β-solulinjassa [60]. Aikana Xenopus
alkionkehityksen atf3
tuskin havaitsee koko vuori in situ -hybridisaatio (kuva. S4). RT-PCR-analyysi osoitti, että atf3
ilmentyminen up-säädellään ndrg1a
Knockdown tai β-kateniinin yliekspressio Xenopuksen
alkioiden (Fig. 8A). Olemme löytäneet kolme keskeistä Tcf /Lef sitoutumiskohtia (5'-A /TA /T CAAAG-3 ') on Xenopus tropicalis atf3
promoottorialueen, joka paikantaa -1467 bp (TACAAAG), -5591 bp: n ( AACAAAG) ja -8889 bp (AACAAAG), vastaavasti. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että atf3
on myös Wnt /β-kateniinin kohdegeenin Xenopus
alkioita. Silmiinpistävän, yliekspressio Atf3 in Xenopus
Endodermi johti täydellinen menetys insuliini
, ptf1a Twitter / P48
, PDIP
pdx1
, foxa1
, ja Sox2
ilmentymistä haimassa, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen, mutta ei ollut selvää vaikutusta darmin
hhex
, ja nkx2
. 1
ilmentymistä (Fig. 8B, C), joka on vain identtinen ndrg1a
taintumisen fenotyypin (kuvio . 4A). Vielä tärkeämpää on, atf3
MO, joka yksin aiheutti vähäisiä vaikutuksia markkerigeenien ilmentyminen analysoitiin pystyi pelastamaan insuliini
, ptf1a Twitter / P48
, PDIP
, foxa1
, ja Sox2
ilmaisu estyy ndrg1a
MO (Fig. 9A, B). Lisäksi Pdx1 pystyi pelastamaan Atf3 yli-ilmentymisen tai Ndrg1a Knockdown fenotyypin suhteen ptf1a Twitter / P48
, PDIP
, foxa1
, ja Sox2
lauseke paitsi insuliini
(Fig. 9A, B). Tiedetään, että Pdx1 ei ole tarpeen eikä riittävää aktivointia varhaisen insuliinia
ilmaisun Xenopuksen
alkioita [44]. Kaikkiaan tietomme viittaavat epistasia että RA aktivoitu Ndrg1a tukahduttaa Wnt /β-kateniinin signalointi ja siten vapauttaa suppressioaktiivisuutta Wnt /β-kateniinin signalointiaktiivisuuksiaan, joka voi olla osittain välittämä Atf3, haiman, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen muodostumista.
aktivoituu suoraan RA on archenteron katon endodermissä soluissa Xenopus
neurulae. Nuclear β-kateniinin taso on hyvin alhainen archenteron katon endodermi solut ja näyttää siltä, että RA aktivoitu Ndrg1a tukahduttaa Wnt /β-kateniinin signalointi näissä soluissa. Knockdovvn ndrg1a
jäljittelee inhibitiota RA signaloinnin tai aktivaation Wnt /β-kateniinin signalointi Xenopus
alkioiden suhteen haima, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen kehitys, joka johtaa lähes täydellinen menetys erittely näiden elimen primordia. Esto Wnt /β-kateniinin signalointi voi pelastaa ndrg1a
knockdown fenotyyppi. Siten Ndrg1a koordinoi RA ja Wnt /β-kateniinin signaloinnin erittely Xenopus
haima, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen.
ndrg1a
saattaa olla Specific Marker geeni Selän haima, ruokatorvi, mahalaukku, ja pohjukaissuoli esiasteiden Xenopus
Neurulae
[61] tai seeprakala [17], [18], [62] alkioita. Käyttämällä microarray yhdistettynä koko vuori in situ, pystyimme tunnistamaan archenteron katolle Endodermi geenistä ndrg1a.
Vitaaliväri värjäys perustuu kohtalo kartoituksen tutkimus on osoittanut, että archenteron katto Endodermi solujen myöhemmin aiheuttaa selkä- haima , ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen [5]. shirin
näyttää ilmaistaan Xenopus
archenteron katto Endodermi, mutta samalla se on myös ilmaistu Mesodermi ja ektodermi [63]. fetuinish
nimenomaan kuluneeksi archenteron katon endodermissä in Xenopus
aikaisin neurulae, mutta myöhemmin se näyttää ilmentymistä maksassa ja suolistossa ilman ilmaisua haimassa, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen [35]. Vain ndrg1a
osoittaa johdonmukaisesti ilmaisua aikaisin archenteron katon endodermi ja myöhemmin haimassa, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen. Me spekuloida, että ndrg1a
voi toimia tietyn selkä haima, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen esiaste markkerigeeni Xenopus
, joka vielä tarkastettava geneettisen linjaa jäljitys tutkimuksia.
haima, ruokatorvi, mahalaukku, ja pohjukaissuoli Specification
ja cdx4
seeprakalasta alkioiden näyttää vastapainoksi RA signaloinnin mesodermistä asettaa etu- ja taka rajat haiman alueen osalta [17], [64]. ndrg1a
on ensimmäinen geeni tunnistettiin, että aktivoituu suoraan RA alussa Xenopus
archenteron katon endodermi soluja ja se välittää RA signaloinnin positiivisesti kuvio Endodermi solujen haima, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen . Molemmat MO pohjainen knockdovvn ndrg1a
ja Talen välittämää häiriöitä ndrg1a
osoittavat, että Ndrg1a aktiivisuus Xenopus
Endodermi kuviointi on välttämätöntä, mikä ei havaittu Ndrg1
hiirten [32], [33], [34]. Yksi selitys tälle ero on, että olennainen rooli Ndrg1a in Xenopus
endodermaalinen kuviointi ei säilynyt nisäkkäillä. Vaihtoehtoisesti ei endodermaalinen urut vikoja raportoidaan hiiri Ndrg1
geenikohdistus tutkimukset saattavat johtua vuotavat ilmentymisen NDRG1 in Ndrg1
hiirissä [32], [33] tai johtuen funktionaalisen redundanssin keskuudessa NDRG perheenjäsenet 1-4 hiirillä.
alkioiden johtaa alennettua pronephros ja sekavaa somiitit [36]. Tuntemattomasta syystä emme saaneet kohdunulkoinen Ndrg1a toimivat myös Xenopus
alkioita. On syytä huomauttaa, että katkaistun version Ndrg1a ensimmäisen 48 aminohappoa N-terminaalista puuttuu käytettiin sekä mRNA injektiota ja MO suunnittelun aikaisemmassa tutkimuksessa [36]. Olemme myös yrittäneet mRNA injektio tällä lyhyt versio ja pistetään alkiot olivat terveitä suurillakin annoksella (4 ng mRNA). Emme voineet pelastamaan ndrg1a
MO ilmiasuun tämän katkaistun version Ndrg1a myöskään. Lopuksi vahva endodermaalinen ilmaus ndrg1a
havainnollistettu tutkimuksessamme ja kuvanneet Costa et al. [35] ei ole havaittu, että tutkimuksessa [36].
Ndrg1a välittämä Ylikuuluminen välillä RA ja Wnt /β-kateniinin Merkinanto on rajoitettu Xenopus
haima, ruokatorvi, mahalaukku, ja pohjukaissuoli Muotoilu solut
[66]. Hiirillä, näyttää siltä, että RA tukahduttaa Wnt antagonisti Dkk1
ilmaisun mahdollinen keuhkoissa endodermissä of E8.5-E9.5 alkiot, mikä mahdollistaa kanoninen Wnt signalointia välittämän keuhkojen erittely [65]. RA ja Wnt reitit yhdistävät RA alavirran kohdegeenien OSR1
ja OSR2
säilyttää rintalihas fin kehitystä zebrafish [67]. Yhdessä nämä tapaukset osoittavat Tilanne joka RA edistää Wnt /β-kateniinin signalointi.
haima, ruokatorven, mahalaukun ja pohjukaissuolen muodostuminen, joka ei koske maksan ja keuhkojen erittely. Tueksi Meidän havainto, yliekspressio erittyvän Wnt antagonisti Sfrp5 voi korvata RA suhteen induktioon haimassa erilaistumisen VegT injektoidaan eläimen maaottelua Xenopus
[24]. Haitallisia vaikutuksia aikaisin kohdunulkoisen Wnt /β-kateniinin signaloinnin aktivointi maksaan ja keuhkojen alkuunsa muodostuminen nähdään tässä tutkimuksessa sekä aiemmassa tutkimuksessa [22] ei ole ristiriidassa myönteistä roolia kanoninen Wnt signalointia edistämisessä maksan ja keuhkojen kehitys, joka havaittiin, kun Wnt /β-kateniinin signalointi aktivoitiin Xenopuksen
alkioiden vaiheista 30-42 maksan ja vaiheista 28-35 keuhko-, vastaavasti [22], [66]. Tukahduttaminen vaikutus RA on Xenopus