PLoS ONE: retinsyreholdige Aktiveret Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin Signaling til Tillad Xenopus Pancreas, Spiserør, Mave, og duodenum Specification

Abstrakt

Hvordan celler integrere flere mønsterdannende signaler for at opnå tidlig endoderm regionalisering er stort set ukendt. Mellem gastrulation og neurulation er retinsyre (RA) signalering kræves, mens Wnt /β-catenin signalering skal undertrykkes for specifikation af bugspytkirtlen, spiserøret, mavesækken, og duodenum primordier i Xenopus
embryoner. I forsøg på at screene for RA regulerede gener i Xenopus
endoderm, vi identificeret en direkte RA target-gen, N-myc nedstrøms reguleret gen 1a ( ndrg1a
), der viste udtryk tidligt i archenteron tag endoderm og sent i udviklingslandene bugspytkirtlen, spiserøret, mavesækken, og tolvfingertarmen. Både antisense morpholino oligonukleotid medieret knockdown af ndrg1a
i Xenopus laevis
og transskription aktivator-lignende effektor nukleaser (Talen) medieret afbrydelse af ndrg1
i Xenopus tropicalis
demonstrere, at ligesom RA signalering, er Ndrg1a specifikt er nødvendigt for specifikation af Xenopus
bugspytkirtel, spiserør, mavesæk, og duodenum primordier. Immunofluorescens data antyder, at RA-aktiverede Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin signalering i Xenopus
archenteron tag endoderm celler. Blokering Wnt /β-catenin signalering reddet Ndrg1a knockdown fænotype. Endvidere overekspression af det formodede Wnt /β-catenin målgen Atf3 phenocopied knockdown af Ndrg1a eller inhibering af RA-signalering, mens Atf3 knockdown kan redde Ndrg1a knockdown fænotype. Endelig bugspytkirtlen /mave /duodenum transkriptionsfaktor Pdx1 var i stand til at redde Atf3 overekspression eller Ndrg1a knockdown fænotype. Sammen konkluderer vi, at RA aktiveret Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin signalering at tillade specifikationen af ​​bugspytkirtlen, spiserøret, maven, og duodenum stamceller i Xenopus
embryoner

Henvisning:. Zhang T Guo X, Chen Y (2013) retinsyreholdige Aktiveret Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin signalering til Tillad Xenopus
Pancreas, Spiserør, mave, og duodenum specifikation. PLoS ONE 8 (5): e65058. doi: 10,1371 /journal.pone.0065058

Redaktør: Michael Schubert, Laboratoire de Biologie du Développement de Villefranche-sur-Mer, Frankrig

Modtaget: December 29, 2012; Accepteret den 22. april 2013; Udgivet: 31. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra det nationale Basic Research Program Kina (2009CB941200) og National Natural Science Foundation of China (31.271.554). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

regionalisering af endoderm sker sideløbende med sin dannelse under gastrulation. Ved udgangen af ​​gastrulation, har bred antero-posterior (AP) domæner i endoderm blevet etableret, som afspejles i den forreste udtryk for Hhex
, vpp1
, Sox2
og Foxa2
og den bageste udtryk for caudale typen homeobox
gener Cdx1
, 2
, og 4
[1], [2], [3]. Til sidst, endodermen giver anledning til epiteler af de respiratoriske og gastrointestinale skrifter og deres tilknyttede organer, såsom skjoldbruskkirtlen, lunger, bugspytkirtel, lever og galdeblære. Den slægt sporing for hvirveldyr endodermal organogenesen er i høj grad afhængig af de vitale farvestof etikettering-baserede skæbne kortlægning undersøgelser [4], [5], [6], [7], [8]. Den tidlige udtryk for hhex
og vpp1
i Xenopus
embryoner kan tjene til at afspejle de prækursorer til leveren og ventrale pancreas henholdsvis [3]. Indtil videre er der kun få specifikke markørgener rapporteret, hvilket kan afgrænse prækursorer til dorsale bugspytkirtel, spiserør, mave og duodenum under gastrulation og neurulation.

Retinsyre (RA) signalering spiller en konserveret rolle i AP mønster af hvirveldyr endoderm så tidligt som gastrulation [9]. Studier i frog, aviær, og mus viser, at RA signalering specielt kræves for dannelsen af ​​dorsale pancreas, spiserør, mave og duodenum primordier [10], [11], [12], [13], [14], [15]. I zebrafisk, er RA signalering inden udgangen af ​​gastrulation påkrævet for den oprindelige udvikling af både lever- og pancreascancer endoderm [16]. RA aktiveret ekspression af RA-nedbrydende enzym cyp26a1
i torsoens endoderm igen modulerer RA signalering og definerer den forreste grænse af pancreas banen zebrafisk embryoner [17]. mnx1
er identificeret som en RA nedstrøms gen, der fremmer beta celle dannelse i udviklingslandene zebrafisk endokrine bugspytkirtel [18], mens RA nedstrøms gen exdpf
regulerer fisk eksokrine pancreas udvikling [19]. De endodermal RA målgener, som medierer de tidlige aktiviteter RA signalering at angive bugspytkirtlen, spiserør, mave og duodenum Anlagen egentlig mangler at blive identificeret.

Canonical Wnt signalering spiller også en vigtig rolle i AP mønsterdannelse af hvirveldyr endoderm. Hos mus Forbindelse knockout af Tcf1

Tcf4 ført til en forreste transformation af duodenum i maven med ringe eller ingen tarmen udviklet [20]. Maven mesenchymal transkriptionsfaktor Barx1-medieret sekretion af Wnt antagonister SFRP1 og SFRP2 er påkrævet for at inhibere endodermal Wnt /β-catenin signalering og således til at anføre maven epitel [21]. Konsekvent, i Xenopus
, Wnt /β-catenin signalering skal undertrykkes i anterior endoderm mellem gastrula og tidlige somit udviklingstrin at tillade dannelse af leveren samt bugspytkirtlen, maven, og duodenum primordier [ ,,,0],22], [23]. Den udskilte Wnt antagonist sfrp5
udtrykt i den ventrale fortarm endoderm koordinerer leveren og ventrale pancreas specifikation ved antagonisering både kanoniske og noncanonical Wnt signalering [24], [25]. Desuden er det blevet vist, at RA kan undertrykke Xenopus
blastula Wnt /β-catenin signalering [26].

N-myc nedstrøms reguleret gen 1 (NDRG1) tilhører NDRG proteinet familie bestående af fire medlemmer, NDRG1-4, som er karakteriseret ved at indeholde en NDR domæne og et α /β hydrolase-fold motiv [27]. NDRG1
er en RA-inducerbart gen i forskellige cellelinjer og humane patienter [28], [29], [30], [31]. Ndrg1
mangel i mus fører til Schwann-celler dysfunktion, hvilket antyder, at NDRG1 er afgørende for opretholdelsen af ​​myelinskeder i perifere nerver [32], [33]. Ndrg1
-null mus viste også nedsat mast celle modning og degranulering og svækkede allergiske reaktioner [34]. I Xenopus
, ndrg1
blev identificeret som et gen beriget til ekspression i endoderm og pronephros [35], [36]. En nylig undersøgelse under anvendelse cancercellelinier afslører, at tumormetastase suppressor gen, NDRG1, undertrykker Wnt /β-catenin signalering ved direkte interaktion med Wnt receptor, LRP6, derfor medfører undertrykkelsen af ​​Wnt /β-catenin målgen, ATF3
udtryk [37]. Aktivering transkriptionsfaktor 3 (ATF3) tilhører ATF /cyklisk AMP responsive element binding familie af basiske leucin zipper transkriptionsfaktorer. Det er et adaptivt respons-gen og kan fungere både som en transkriptionel aktivator eller repressor afhængigt af celletypen og stimulus [38], [39], [40]. ATF3
knockout mus udviklede normalt og viste ingen mærkbar fænotyper under normale forhold [41]. I modsætning hertil transgene mus, der udtrykker ATF3 i leveren, pancreas duktalt epitel, eller pankreatiske p-celler førte til leverdysfunktion, defekter i endokrine pancreas udvikling eller islet dysfunktion, henholdsvis [41], [42], [43].

i denne undersøgelse brugte vi mikromatrice i kombination med hele mount in situ hybridisering til at screene RA regulerede gener i Xenopus
endoderm. ndrg1a
blev identificeret og verificerede bliver direkte af RA i archenteron tag endoderm og sent i udviklingslandene bugspytkirtlen, spiserøret, mavesækken, og tolvfingertarmen. Vi giver beviser implicerer, at RA-aktiverede Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin signalering i archenteron tag endoderm celler og følgelig frigiver den inhiberende virkning af Wnt /β-catenin signalering aktiviteter på dannelsen af ​​pancreas, spiserør, mave og duodenum.

Resultater

ndrg1a
, en RA Reguleret Gene, udtrykkes Tidligt i endodermal archenteron tag

med hensyn til endodermal organogenese, Xenopus
embryoer behandlet med en RA-antagonist, BMS453, inden udgangen af ​​gastrulation viste specifik tab af den dorsale pancreas og en del af ventrale pancreas, mave og duodenum [10]. For at identificere RA regulerede gener i endoderm, vi først gjorde microarray analyse sammenligner genekspression niveauer mellem vildtype og RA-manglende embryoner, der blev behandlet med BMS453 ved begyndelsen af ​​gastrulation og blev indsamlet ved trin 12, 23 og 34, henholdsvis . De opnåede data indikerer, at gener nedreguleret mere end 2-fold ved tre forskellige stadier viste begrænset overlapning (fig. S1 og tabel S1). I embryoner i trin 23, er der 138 gener, der blev nedreguleret mere end 2-fold upon BMS453 behandling. Ifølge de 138 gener 'strukturel og funktionel information til rådighed i NCBI-databasen, gav vi prioriteter transkriptionsfaktorer, kinaser, RNA-bindende proteiner, transmembrane proteiner, såvel som gener, der viser endodermal ekspression, og dermed valgte 9 gener (Tabel S1) til yderligere analyse af de embryonale ekspressionsmønstre ved hele mount in situ hybridisering. En af dem, ndrg1a
, viste specifik ekspression tidligt i archenteron tag endoderm (fig. 1B), som ikke blev påvist ved tidligere undersøgelser, formodentlig på grund af utilstrækkelig følsomhed af hele mount in situ hybridisering teknik i tidligere publikationer [35], [36]. Efter aftale med rapporten fra Zorn laboratorium [35], vores data viser, at ndrg1a
udskrifter blev påvist i dorsale endoderm ved tidlige hale opløbet udviklingsstadie (Fig. 1C, D, E, G). Ved slutningen hale opløbet og Tadpole udviklingstrin, ud over sit udtryk i øjnene, proctodaeum forstadier, og pronephros, ndrg1a
viste særligt udtryk i svælg, spiserør, bugspytkirtel, mave, og duodenum (fig. 1 E , F, H, I, J). Vi var i stand til at opdage ndrg1a
udtryk i leveren [35]. I stedet en klar ndrg1a
signal blev observeret i at udvikle galdeblære (fig. 1I, J).

ndrg1a
Expression i archenteron Roof endoderm Cells er direkte af RA

for yderligere at verificere microarray data, vi analyserede ndrg1a
udtryk i BMS453 og RA behandlet embryoner ved hele mount in situ hybridisering. Efter BMS453 behandling, ingen ndrg1a
udskrifter blev påvist i archenteron tag endoderm celler (fig. 2E) og kun spor af ndrg1a
mRNA forblev i dorsale endoderm af fase 22 embryoner (fig. 2H) . Senere, ndrg1a
ekspression blev fuldstændig undertrykt i dorsale pancreas, spiserør, mave og duodenum og blev delvist inhiberet i ventrale pancreas (fig. 2K, N). I modsætning hertil kan en anden RA antagonist BMS493 kun delvist inhiberer ndrg1a
ekspression i pancreas, spiserør, mavesæk, duodenum og [11]. Desuden ndrg1a
ekspression i pronephric proksimale tubuli blev også alvorligt inhiberet af BMS453 (fig. 2 N). Det skal bemærkes, at ndrg1a
ekspression i øjet, hjernen, og galdeblære var mindre påvirket ved BMS453 behandling (fig. 2K, N). Det er et almindeligt fænomen, at for gener, som udtrykker i bugspytkirtlen samt i øjet og centrale nervesystem, såsom ndrg1a
, esr10
, NeuroD
, og ptf1a /P48
, kun deres bugspytkirtlen udtryk hæmmes på BMS453 behandling (fig. 2K, N og [10]). Omvendt anvendelse af RA til Xenopus
embryoner inducerede betydelig udvidelse af ndrg1a
udtryk domæner i archenteron tag endoderm (fig. 2F), dorsal endoderm (fig. 2I), bugspytkirtel, spiserør, mavesæk og duodenum (fig. 2L, O). Således RA signalering er nødvendig og tilstrækkelig til at aktivere ndrg1a
udtryk i archenteron tag endoderm celler.

For at løse, hvis RA direkte kan regulere ndrg1a
udtryk, vi behandlede Xenopus
fostre med cycloheximid (CHX), en proteinsyntese inhibitor, 15 minutter før anvendelsen af ​​RA. Vores data viser, at RA-induceret udvidelse af ndrg1a
udtryk i archenteron tag endoderm blev ikke påvirket af CHX (fig. 2S), støtter tanken om, at RA direkte aktiverer ndrg1a
udtryk i archenteron tag endoderm celler. Faktisk blev en RA respons element identificeret i Xenopus tropicalis ndrg1
promoter region (AGTTCAacAGTTCA -1496bp at -1509bp). I modsætning til Xenopus laevis
, det diploide Xenopus tropicalis
har en ndrg1
gen.

ndrg1a
Knockdown i Xenopus
Embryoner fænokopier BMS453 Behandling

For at generere ndrg1a
morphants, vi købte to ndrg1a
antisense morpholino oligoer (MO) fra Gene Tools. One dækker ATG-startkodonen (MO1) og den anden (MO2) lokaliserer i den 5'-utranslaterede region af ndrg1a
cDNA. Deres effektivitet blev testet ved et in vivo-assay, hvori GFP-kodende sekvens blev fusioneret til et MO bindingssted og den resulterende mRNA blev co-injiceret med MO i Xenopus
befrugtede æg til at evaluere levende GFP translation i embryoner . Både MO1 (fig. 3B) og MO2 (fig. 3F) var i stand til effektivt at hæmme oversættelse af GFP åben læseramme efter den tilsvarende MO1 eller MO2 bindende sekvenser henholdsvis mens kontrol MO (Como) undlod at gøre det (fig. 3A, E).

for at teste, om Ndrg1a funktionelt kan mægle RA signalering at angive fortarm endoderm, vi injicerede MO1, MO2 eller Como separat i vegetal del af alle fire blastomererne af 4-celle embryoer, indsamlet embryonerne på trin 36 og 42, og analyseres med et panel af endodermale markørgener. ptf1a
/ P48
er specifik for pancreas precursorceller under tidlig embryogenese og senere bliver begrænset til exokrine pancreas [10], [44], [45]. Pdx1
specifikt afgrænser udvikle bugspytkirtlen, mave og duodenum [46]. insulin
, en endokrin markør-gen, er udelukkende udtryk i dorsale pancreas knop af Xenopus
hale opløbet embryoer [47], [48]. PDIP
er en eksokrine pancreas specifik markør-gen [49]. Sox2
markerer spiserøret, maven og en forreste del af duodenum [50]. Darmin
er en tarm specifik markør-gen [35], [51]. hhex
fungerer som en lever og skjoldbruskkirtel markør gen [52]. nkx2
. 1
mærker udvikler lunge og skjoldbruskkirtel [53].

De opnåede data indikerer, at MO1 og MO2 lige så effektivt afskaffet insulin
, ptf1a
/ P48
, PDIP
, Pdx1
, og Sox2
udtryk i bugspytkirtlen, spiserøret, mavesækken, og duodenum, men havde mindre indflydelse på Darmin
, hhex
, og nkx2
. 1
udtryk i tarmen, leveren, skjoldbruskkirtlen, og lunge, som er meget lig virkningen af ​​BMS453 (fig. 4A og [10]). Den eneste forskel er, at ingen ventrale pancreas udtryk for ptf1a
/ P48
, PDIP
, eller Pdx1
blev observeret i ndrg1a
morphants, men spor af ptf1a
/ P48
, PDIP
, og Pdx1
udtryk i de ventrale pancreas knopper blev opretholdt i BMS453 behandlet embryoner (fig. 4A og [10]). Den morfologiske fænotype af ndrg1a
knockdown ligner også, at af BMS453 behandling. Embryoner injiceret med MO1 eller MO2 forekom normale før trin 40 og efterfølgende vises alvorlige gut misdannelser med et tab af tarm coiling og dannelse af ødem (fig. 4B og [10]). Som MO1 og MO2 forårsagede identiske fænotyper, vi brugte MO1 at gennemføre resten undersøgelser. Sammen antyder disse data, at RA og Ndrg1a er i samme genetiske hierarki ved styring pancreas, spiserør, mave og duodenum udvikling.

Injektion af selv 4 ng ndrg1a
mRNA til Xenopus
embryoner forårsaget hverken morfologiske abnormitet eller udtryk ændringer af markørgener analyseret (fig. S2A, B). Co-injektion af ndrg1a
mRNA med dens MOS kunne ikke redde MO fænotype enten (data ikke vist). Det ser ud til, at vi ikke kunne få funktionelt Ndrg1a protein i Xenopus
embryoner gennem den rutinemæssige mRNA injektion protokol, der virker for de fleste, hvis ikke alle andre gener analyseret. En Ndrg1a-GFP konstruktion viste, at proteinet blev produceret (Fig. S3) .Vi har for nylig etableret Talen medieret gen targeting i Xenopus
[54]. For yderligere at verificere MO fænotype, vi designet ndrg1
Talens inden den tredje exon af Xenopus tropicalis ndrg1
gen (fig. 5A), som effektivt forårsaget somatiske mutationer ved målrettede loci (fig. 5B). I overensstemmelse med MO fænotype opnået i Xenopus laevis
embryoner, insulin
Pdx1
udtryk var alvorligt hæmmet i ndrg1
Talen mRNA injiceres Xenopus tropicalis
embryoner (fig. 5C), om end med en lavere frekvens i forhold til MO injicerede dem, som også skete for anvendelsen af ​​ ptf1a /P48
Talens i vores tidligere undersøgelse [54]. En stabil ndrg1
knockout frøen linje er endnu ikke fastlagt. Vi dissekeret 25 froglets der viste bugspytkirtel, mave og duodenum hypoplasi eller endda aplasi, men med normal lever og galdeblære udviklet (Fig. 5D). Således er disse data bekræftede ndrg1a
MO fænotype opnået i Xenopus laevis
.

RA Aktiveret Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin signalering i archenteron tag endoderm Celler at tillader Pancreas , spiserøret, mave, og duodenum Specifikation

Mekanistisk, NDRG1 kan interagere med Wnt receptor LRP6 og blokere Wnt /β-catenin signalering i kræft cellelinjer [37]. At spørge, om RA aktiveret Ndrg1a kan undertrykke Wnt /β-catenin signalering i Xenopus
embryoner, vi sammenlignet nukleare β-catenin niveauer i ndrg1a
positive archenteron tag endoderm celler stadie 20 embryoner, der var underkastes RA, BMS453 behandling, eller MO1 injektion. Immunolokalisering af nuklear β-catenin er en pålidelig metode til at karakterisere Wnt /β-catenin signaleringsaktivitet i Xenopus
embryoner [55]. I det valgte område af archenteron tag endoderm, viste nogle få celler nuklear β-catenin-farvning under normale forhold, som blev yderligere mindre ved RA behandling. I modsætning hertil antallet af nukleare β-catenin-positive celler i archenteron tag endoderm steget betydeligt upon BMS453 behandling, eller MO1 injektion (fig. 6A, B). Sammen antyder disse data, at RA og Ndrg1a undertrykke Wnt /β-catenin signalering i Xenopus
archenteron tag endoderm celler.

For at teste, om RA, Ndrg1a, og Wnt /β-catenin signalering er funktionelt forbundet i samme kaskade kontrollere bugspytkirtlen, spiserøret, mavesækken og tolvfingertarmen specifikation, vi co-injicerede ndrg1a
MO1 med GR-ΔNTcf3, en dominerende negativ form for Tcf3 fusioneres med det hormon-bindende domæne af glucocorticoidreceptor tjener til at undertrykke Wnt /β-catenin signalering ved dexamethason induktion [56]. Vore data viser, at undertrykke Wnt /β-catenin signalering reddet ndrg1a
knockdown fænotype (Fig. 7A, B). Ektopisk aktivering af nkx2
. 1 Hotel (fig. 7B44, 45), Sox2
(fig. 7A19, 20 og B24, 25), og foxa1
(fig. 7B14, 15), en forkhead transkriptionsfaktor mærkning mave, duodenum, og proctodaeum [44], er korreleret med tab af Darmin
ekspression (fig. 7A24, 25, 7B29, 30 ) efter injektion af 0,25 ng GR-ΔNTcf3 mRNA. I overensstemmelse med den tidligere undersøgelse [22], højere dosis (0,8 ng) af GR-ΔNTcf3 mRNA er forpligtet til at inducere ektopisk udtryk for Pdx1
for1
, en lever specifik markør-gen [ ,,,0],22], [57], i Xenopus
embryoner (data ikke vist).

i fuld overensstemmelse med den tidligere undersøgelse [22], aktivering af kanoniske Wnt signalering i Xenopus
endoderm ved vegetal injektion af 0,5 ng GR-LEFΔN-βCTA mRNA indeholdende LEF1 DNA-bindende domæne og det β-catenin transaktiveringsdomænet [58] i 4 blastomerer af de 4-celle embryoer resulterede i identisk fænotype forårsages af Ndrg1a knockdown i forbindelse med pancreas, spiserør, mave og duodenum udvikling (fig. 7A, B). Undertrykkelsen effekt af Wnt /β-catenin signalering på dannelsen af ​​leveren (fig. 7A27, 32, B32, 37) og lunge (Fig. 7A37, B42), blev ikke set i Ndrg1a morphants, hvilket tyder på, at den tidlige undertrykkelse af Wnt /β-catenin signalering i det område af leveren og lungerne danner endoderm udføres af faktorer end RA aktiverede Ndrg1a. Taget sammen antyder disse data at Wnt /β-catenin signalering er nedstrøms for Ndrg1a og undertrykkes af Ndrg1a at tillade specifikationen af ​​pancreas, spiserør, mave og duodenum.

Atf3, en formodet Wnt /β- catenin target Gene i Xenopus
embryoner, specifikt hæmmer Xenopus
Pancreas, Spiserør, mave, og Aduodenum Specifikation

Det blev vist, at ATF3, en Wnt /β-catenin mål gen i cancer cellelinjer [37], kan enten transskriptionelt undertrykke Pdx1
udtryk [59] eller fysisk interagerer med PDX1 at blokere PDX1 medieret transaktivering i en muse β-cellelinje [60]. Under Xenopus
embryogenese, atf3
næppe opdaget af hele mount in situ hybridisering (fig. S4). RT-PCR-analyse viste, at atf3
udtryk blev opreguleret på ndrg1a
knockdown eller β-catenin overekspression i Xenopus
embryoner (Fig. 8A). Vi fandt tre core Tcf /LEF bindingssteder (5'-A /TA /T CAAAG-3 ') i Xenopus tropicalis atf3
promoter region, der finde på -1467 bp (TACAAAG), -5591 bp ( AACAAAG) og -8889 bp (AACAAAG) hhv. Sammen antyder disse data, at atf3
er også en Wnt /β-catenin target-gen i Xenopus
embryoner. Slående, overekspression af Atf3 i Xenopus
endoderm ført til fuldstændig tab af insulin
, ptf1a
/ P48
, PDIP
, Pdx1
, foxa1
, og Sox2
udtryk i bugspytkirtlen, spiserøret, mavesækken, og duodenum, men havde ingen indlysende effekt på Darmin
, hhex
, og nkx2
. 1
udtryk (fig. 8B, C), som er lige identisk med ndrg1a
knockdown fænotype (fig . 4A). Endnu vigtigere er, atf3
MO, som alene forårsagede en mindre indvirkning på ekspression af markørgener analyserede, var i stand til at redde insulin
, ptf1a
/ P48
, PDIP
, foxa1
, og Sox2
udtryk hæmmet af ndrg1a
MO (fig. 9A, B). Desuden Pdx1 var i stand til at redde Atf3 overekspression eller Ndrg1a knockdown fænotype med hensyn til ptf1a
/ P48
, PDIP
, foxa1
, og Sox2
udtryk undtagen insulin
(fig. 9A, B). Det vides, at Pdx1 hverken er nødvendig eller tilstrækkelig til aktivering af tidlig insulin
udtryk i Xenopus
embryoner [44]. Sammenlagt vore data tyder en epistasis at RA aktiveret Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin signalering og følgelig frigiver undertrykkelse aktivitet af Wnt /β-catenin signalering aktiviteter, som kan være delvist medieret af Atf3, på bugspytkirtlen, spiserør, mave og duodenum formation.

diskussion

ndrg1a
direkte aktiveres af RA i archenteron tag endoderm celler Xenopus
neurulae. Nuklear β-catenin niveau er meget lavt i archenteron tag endoderm celler og det fremgår, RA aktiveret Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin signalering i disse celler. Knockdown af ndrg1a
efterligner inhibering af RA-signalering eller aktivering af Wnt /β-catenin signalering i Xenopus
embryoner med hensyn til pancreas, spiserør, mave og duodenum udvikling, hvilket fører til en næsten komplet tab af specifikationen af ​​disse orgel primordier. Blokering Wnt /β-catenin signalering kan redde ndrg1a
knockdown fænotype. Således Ndrg1a koordinerer RA og Wnt /β-catenin signalering i specifikationen af ​​ Xenopus
bugspytkirtel, spiserør, mavesæk, og tolvfingertarmen.

ndrg1a
kunne være en specifik markør Gene for Dorsal Pancreas, Spiserør, mave, og duodenum Forstadier i Xenopus
Neurulae

Flere undersøgelser har beskrevet microarray baseret screening af RA responsive gener i Xenopus
[61] eller zebrafisk [17], [18], [62] embryoner. Brug microarray i kombination med hele mount in situ hybridisering, vi var i stand til at identificere archenteron tag endoderm specifikt gen ndrg1a.
En vital farvestof farvning baseret skæbne kortlægning undersøgelse har vist, at archenteron tag endoderm celler senere give anledning til dorsal bugspytkirtel , spiserør, mavesæk, duodenum og [5]. Shirin
synes at blive udtrykt i Xenopus
archenteron tag endoderm, men i mellemtiden er det også til udtryk i mesoderm og ektoderm [63]. fetuinish
specifikt markerer archenteron tag endoderm i Xenopus
tidlige neurulae, men senere viser udtryk i leveren og tarmen uden udtryk i bugspytkirtlen, spiserøret, mavesækken, og duodenum [35]. Kun ndrg1a
viser konsekvent ekspression tidligt i archenteron tag endoderm og senere i pancreas, spiserør, mave og duodenum. Vi spekulere, at ndrg1a
kan tjene som en specifik dorsal bugspytkirtel, spiserør, mavesæk, og duodenum forløber markør gen i Xenopus
, som endnu ikke er verificeret af genetiske afstamning sporing studier.

Ndrg1a er Uundværlig for Xenopus
Pancreas, Spiserør, mave, og duodenum Specifikation

Tidlig endodermal udtryk for cyp26a1
cdx4
i zebrafisk embryoner lader til at modvirke RA signalering fra mesoderm at indstille anteriore og posteriore grænser pancreas område henholdsvis [17], [64]. ndrg1a
er det første gen identificeret som er direkte aktiveret ved RA tidligt i Xenopus Salg archenteron tag endoderm celler og det medierer RA signalering til positivt mønster endoderm celler i pancreas, spiserør, mavesæk, duodenum og . Både MO baseret knockdown af ndrg1a
og Talen medieret afbrydelse af ndrg1a
påvise, at Ndrg1a aktivitet i Xenopus
endoderm mønster er uundværlig, som ikke blev observeret i Ndrg1
knockout-mus [32], [33], [34]. En forklaring på denne forskel er, at den væsentlige rolle Ndrg1a i Xenopus
endodermal mønster er ikke bevaret i pattedyr. Alternativt ingen endodermal orgel defekter rapporteret i mus Ndrg1
gen-targeting undersøgelser kan skyldes utætte ekspression af NDRG1 i Ndrg1
deficiente mus [32], [33] eller som følge af funktionel redundans blandt NDRG familiemedlemmer 1-4 i mus.

En række undersøgelser viser, at overekspression af NDRG1 i cancer cellelinjer genererer iøjnefaldende fænotyper [27]. Det er også rapporteret, at overekspression af Ndrg1a i Xenopus
embryoner resulterer i en reduceret pronephros og uorganiserede somitter [36]. Af ukendte årsager, kunne vi ikke få ektopisk Ndrg1a i funktion i Xenopus
embryoner. Det skal bemærkes, at en trunkeret version af Ndrg1a med de første 48 aminosyrer i den N-terminale mangler var anvendt til både mRNA injektion og MO design i den tidligere undersøgelse [36]. Vi forsøgte også mRNA injektion med denne korte version, og de injicerede embryoner var sunde, selv ved høj dosis (4 ng mRNA). Vi kunne ikke redde vores ndrg1a
MO fænotype med denne afkortede version af Ndrg1a enten. Endelig den stærke endodermal ekspression af ndrg1a
illustreret i vores undersøgelse og beskrevet af Costa et al. [35] blev ikke påvist i denne undersøgelse [36].

Ndrg1a Mediated Crosstalk mellem RA og Wnt /β-catenin Signaling er begrænset til Xenopus
Pancreas, Spiserør, Mave, og duodenum Danner celler

Under embryogenese, celler konstant integrere flere signalveje at nå deres særskilte skæbne på det rigtige tidspunkt og sted. Den integrerede rolle FGF, RA, og Wnt signalveje i specificere lunge primordium og styre væksten lunge opløbet defineret i mus [65] er bevaret i Xenopus
[66]. Hos mus, ser det ud til, at RA undertrykker Wnt antagonist DKK1
udtryk i prospektive lunge endoderm af E8.5-E9.5 embryoer, giver således mulighed kanoniske Wnt signalering medieret pulmonal specifikation [65]. RA og Wnt veje er forbundet af RA nedstrøms målgener OSR1
og OSR2
at opretholde brystfinnen udvikling i zebrafisk [67]. Tilsammen udgør disse sager afslører en omstændighed, som RA fremmer Wnt /β-catenin signalering.

Her giver vi overbevisende beviser for første gang, at vi ved, at RA aktiveret endodermal udtryk for Ndrg1a undertrykker Wnt /β catenin signalering og dermed frigiver undertrykkelse aktivitet Wnt /β-catenin signalering på Xenopus
bugspytkirtel, spiserør, mavesæk, og duodenum dannelse, som ikke finder anvendelse på lever og lunge specifikation. Til støtte for vores konklusion, kan overekspression af et udskilt Wnt antagonist Sfrp5 erstatte RA med hensyn til induktion af eksokrine pancreas differentiering i Vegt injicerede dyr caps i Xenopus
[24]. De skadelige virkninger af tidlig ektopisk Wnt /β-catenin signalering aktivering på leveren og lungerne opløbet dannelse set i denne undersøgelse såvel som i en tidligere undersøgelse [22] er ikke i modstrid med den positive rolle, kanoniske Wnt signalering i fremme lever og lunge udvikling, der blev observeret, når Wnt /β-catenin signalering blev aktiveret i Xenopus
embryoner fra trin 30 til 42 for lever og fra trin 28 til 35 for lunge-, henholdsvis [22], [66]. Undertrykkelsen effekt af RA på Xenopus
blastula Wnt /β-catenin signalering [26] er usandsynligt medieret af Ndrg1a, da ndrg1a
ikke maternelt leveres og dens zygotisk udtryk er ikke aktiveret før neurulation som afsløret af både hele mount in situ hybridisering og RT-PCR-analyser (fig. 1A, [36] og data ikke vist). Det er endnu ikke undersøgt, om Ndrg1a kan interagere med Lrp6 og hvordan Ndrg1a undertrykker Wnt /β-catenin signalering i Xenopus
embryoner.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health.

• PLoS ONE: Kirurgisk behandling for patienter med Krukenberg Tumor af mave Oprindelse: Klinisk Outcome og prognostiske faktorer Analyse
• PLoS ONE: Cathepsin E er en markør af gastrisk Differentiering og Signet-Ring celle karcinom af mave: A Novel forslag om Gastric tumorigenese