In silico elemzése és ellenőrzése S100 génexpresszió gyomorrák

In silico katalógusa elemzése és ellenőrzése S100 génexpresszió gyomorrák katalógusa Abstract katalógusa Háttér katalógusa Az S100 protein család tartalmaz 22 tag, amelynek fehérje szekvenciák kiterjed legalább egy EF-hand Ca 2 + kötő motívum. Részt vettek a szabályozásában számos celluláris folyamatok, mint például a sejtciklus progresszióját és differenciálódását. Azonban a kifejezés állapotát S100 családtagok gyomorrák nem volt ismert még.
Módszerek
Kombinálva elemzésével sorozat analízis a génexpresszió, a virtuális Northern-blot és microarray adatok, az expressziós szintek S100 családtagok normális és rosszindulatú gyomor szöveteket szisztematikusan vizsgáltuk. A kifejezés a S100A3 tovább értékeltük kvantitatív RT-PCR-rel.
Eredménye
Legalább 5 S100 gént találtunk, hogy fokozódik a gyomor kancia in silico analízis. Közülük négy gén, beleértve S100A2, S100A4, S100A7 és S100A10, számoltak be, túltermelõdik gyomorrák korábban. A kifejezés a S100A3 nyolcvan betegek gyomorrák alaposabban megvizsgálták. Az eredmények azt mutatták, hogy az átlagos expressziós szintje S100A3 gyomorkarcinómában szövetekben, 2,5-szer olyan magas, mint a szomszédos, nem-daganatos szövetekben. S100A3 expresszió korrelált a tumor differenciálódásának és TNM (tumor-node-metastasis) szakaszában gyomorrák, amely viszonylag erősen expresszálódik a rosszul differenciált és előrehaladott gyomorrák szövetekben (p
< 0,05).
Következtetés
tudomásunk szerint ez az első olyan jelentés rendszeres értékelése S100 gén kifejezések gyomorrák többszörös in silico analízis. Az eredmények azt mutatták, hogy a túlzott mértékű expressziója S100 géncsalád tagjai jellemzőit gyomor rák és S100A3 lehet fontos szerepet játszanak a differenciálás és progressziójában gyomorrák.
Alapon
gyomorrák a második leggyakoribb rákos halálok világszerte. Környezeti és genetikai tényezők egyaránt fontosak a gyomor karcinogenezis [1, 2]. Az elmúlt két évtizedben sok előrelépés történt azonosítása részt vevő gének a fejlesztés a gyomorrák. Ezeket az azonosított gének megértésében hasznosak patogenezisében gyomorrák és meghatározó molekuláris aláírását. Ők is szolgálnak biomarkerek korai diagnózis és célokat gyógyszerfejlesztés. Katalógusa közelmúltban nagyszabású génexpressziós vizsgálatok merültek fel, mint fontos eszközök kiszűrésére kapcsolatos gének rákos [3]. A két kísérleti rendelkezésre álló technológiák nagyléptékű génexpressziós analízis a következők: 1) a DNS szekvenálás-alapú soros analízis a génexpresszió (SAGE), és kifejezhető szekvencia tag (EST) megközelítések és 2) dot-blot alapú microarray. Több bioinformatikai infrastruktúra jött létre, hogy állítsa össze az adatokat ezekből a technikákat. Ezek közül a Cancer Genome Anatomy Project (CGAP) és Gene Expression Omnibus (GEO) két fontos hálózatok [4, 5]. Korábbi alkalmazások adatbányászati ​​segítségével CGAP és GEO erőforrás vezettek azonosítása számos új vagy ismert rákkal összefüggő gének [6, 7].
A S100 protein család tartalmaz 22 tag, amelynek fehérje szekvenciák kiterjed legalább egy EF-kéz Ca2 + kötő motívum [8]. S100 proteinek lokalizálódnak a citoplazmában és /vagy sejtmagban széles körének a sejtek, és szabályozásában részt vevő számos celluláris folyamatok, mint például a sejtciklus progresszióját és differenciálódását. Tizenhét S100 család tagok találhatók, mint a klaszter kromoszómán 1q21-22, a régió gyakran átrendezett számos daganat. Ezen túlmenően, a molekuláris analízis azt mutatta, hogy számos S100s, beleértve S100A2, S100A4, S100A7 és S100A10 mutatnak megváltozott expressziós szintet gyomorrák [9, 10]. Tehát érdemes rendszeresen vizsgálja a kifejezés a többi tagjának S100 család normál és gyomorrák szövetekben.
Ebben a vizsgálatban felhasználtuk az adatbázisok és analitikai módszerek ről Gene Expression Omnibus és Cancer Genome Project Anatomy szisztematikusan elemezni a kifejezés a 22 S100 gének normális és rákos gyomor szövetekben. A független SAGE és microarray adatállományok szkríneltünk S100 génexpressziós. Vizsgálataink kimutatták, hogy legalább öt S100 géneket túlszabályozott gyomorrák és további kísérletileg igazolták a túlszabályzását S100A3 kvantitatív RT-PCR. Katalógusa Methods katalógusa SAGE elemzés katalógusa SAGE számát méri címkék, hogy képviselje a transzkripciós termékek egy gén. Által szolgáltatott adatok SAGE technológia a címkéket és az azokhoz tartozó szám értékeknek. Minden nyilvánosan elérhető SAGE gyűjtött adatok GEO weboldal akár 2008. január elemzésére használtuk S100 génexpresszió. Mindkét NlaIII és Sau3A címkéket SAGEmap http: //www. NCBI. NLM. NIH. Gov /SAGE /vannak hozzárendelve Unigene klaszterek http: //www. NCBI. NLM. NIH . gov /Unigene /. A megbízható Unigene klaszterek illeszkedik S100 címkék fogadtak el. Ezek a szekvencia címkék ezután használták, hogy meghatározzák az expressziós szint 22-S100 gének 2 normál és 8 gyomorrák könyvtárak. A listát a címkék felhasznált elemzés az 1. táblázatban és ezekről a könyvtárak állnak rendelkezésre a GEO honlapján. Az analíziseket összehasonlításával átlagos száma S100 címkék a könyvtárakban a normális nyálkahártya azzal a könyvtárakban a gyomorrák. Különbség a > 3-szoros változást fog minősülni positive.Table 1 SAGE elemzése S100 gének expressziója normál és gyomorrák könyvtárak katalógusa Gene neve
katalógusa Unigene klaszter Matton SAGE tag
Normal (TPM *) Matton Rák (tpm*)

S100A2
516484
GATCTCTTGG
0.0
98.1
S100A3
433168
TCTCCCACAC
0.0
2.8
S100A4
81256
ATGTGTAACG
0.0
207.8
S100A6
275243
CCCCCTGGAT
245.9
865.9
S100A7
112408
GAGCAGCGCC
0.0
143.8
S100A8
416073
TACCTGCAGA
0.0
549.2
S100A9
112405
GTGGCCACGG
0.0
637.0
S100A10
143873
AGCAGATCAG
263.6
1890.5
S100A12
19413
GATTTTTAAA
0.0
13.9
S100A16
515714
AGCAGGAGCA
0.0
130.6
Csak S100s azt mutatják, hogy a pozitív mérkőzések jelennek meg a táblázatban. * Címkék per millió; katalógusa Virtuális Észak katalógusa A CGAP adatbázis, virtuális Northern blot analízis lehetővé teszi a kutatók, hogy megtekinthesse a kifejezés egy adott gén minden EST és SAGE könyvtárak [4]. Keresztül a Gene kereső eszköz http: //cgap. NCI. NIH. Gov /Gének /GeneFinder, valamilyen szervezett információt egy bizonyos gén megtalálható lekérdezésével vagy az egyedi gén azonosító vagy kulcsszó. Tartalmazza a rendelkezésre álló információ az EST és SAGE vNorthern kifejezési minták az összes rendelkezésre álló könyvtárak szerint osztályozott szöveti eredetét. A SAGE gyűjtött adatok CGAP közé 5 szövet könyvtárak és 2 xenograft könyvtárak gyomorrák, valamint 3 normál könyvtárak gyomor, amelyet részben eltér gyűjtött GEO említettük. S100 gének, amelyek expressziója EST és zsálya könyvtárak gyomorrák volt mindkét g 3 szor annyi, mint a normális gyomor jelölték pozitív is.
Microarray analízis
Jelenleg öt microarray adathalmazok (2. táblázat), amely adatokat a szokásos és a gyomorrák szöveteket rendelkezésre GEO honlapján http: //www. NCBI. NLM. NIH. gov /projektek /geo /. Az adatbázisba GSE2669, GSE2701 és GSE3438 hozzájárult Boussioutas A [11], Chen X [12] és Kim S [13], illetve választották vezetésére microarray mert ez a három adatsor tartalmazta a viszonylag nagyobb számban normál és gyomorrák (10 normális társaik és 64 rákok számára Boussioutas A. és munkatársai; 22 normálisak és 90 daganatos Chen X 50 normálisak és 50 daganatos Kim S). További részletek a minták és microarray elemzés található a GEO honlapján. Különbséget tekintettük szignifikánsnak, ha p katalógusa < 0.05. S100 géneket, melyek expressziója mind nagyon három csoportba a gyomorrák szövetek jelölték pozitív ones.Table 2 microarray adatállományok gyomorrák gyűjtött Gene Expression Omnibus honlapján. Katalógusa katalógusa esetek
Array
Spot
Szállító Matton
katalógusa Normál Matton Cancer Matton katalógusa katalógusa katalógusa GSE2637 katalógusa 3 katalógusa 55
cDNS katalógusa 13 k /17 K katalógusa Aggarwal A et al katalógusa GSE2685 katalógusa 8 katalógusa 22 katalógusa oligo- nukleotid katalógusa ~ 7,2 K katalógusa Hippo Y et al
GSE2669 katalógusa 10 katalógusa 64 katalógusa cDNS katalógusa ~ 7,4 K katalógusa Boussioutas A et al katalógusa GSE2701 katalógusa 22 katalógusa 90 katalógusa cDNS katalógusa 44 K
Chen X munkatársai katalógusa GSE3438 katalógusa 50 katalógusa 50 katalógusa cDNS katalógusa 14 K katalógusa Kim S. és munkatársai katalógusa Tissue Collection katalógusa Nyolcvan gyomorrákos betegeknél, akiknél a műtét Kórházunk 2004 szeptemberétől a 2007 márciusában került be a vizsgálatba. A kimetszett tumort és a szomszédos, nem tumoros szövetekben mintákat azonnal lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, és tartottuk 70 ° C-ig RNS kivonása. A diagnózis a mind a gyomorrák és a normál gyomornyálkahártya klinikailag és patológiailag bizonyult. A beteg neme, kora, a daganat mérete, TNM-beosztása, mélysége fal invázió, mikroszkopikus altípus és állapot nyirokcsomó-metasztázis nyerték sebészeti és patológiai rekordokat. A jegyzőkönyvek ebben a tanulmányban alkalmazott hagyta jóvá a Kórház Emberi alanyok bizottság. A betegeket, hogy friss sebészeti szövet a tanulmány aláírt informált hozzájárulását.
Kvantitatív RT-PCR
Az összes RNS-t (mRNS) t extraháltunk a gyomorrák és a szomszédos, nem daganatos szövetek szerint a gyártó ajánlásai Trizol reagens (Invitrogen, Carisbad , CA). 1 ug minta teljes RNS-t reverz transzkripcióval a komplementer DNS (cDNS) oligo (dT) primereket. A szensz és antiszensz primerek S100A3 terveztünk szerint az mRNS szekvencia (GenBank hozzáférési szám NM_002960.1). Szoktuk amplifikált fragmentumok átívelő különböző exonok megelőzésére erősítés szennyezett genomi DNS-t. A szensz láncindító 5'-GACCATCTGGTTCAGGTTCC-3 'és az antiszensz láncindító volt 5'-ACATTCCCGAAACTCAGTCG-3'. A PCR-termékeket a 200 bp méretű. A housekeeping gén GAPDH használtuk belső kontrollként. A szensz láncindító 5'-CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT-3 'és az antiszensz láncindító volt 5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'. A PCR-termékeket a 130 bp méretű.
A standard görbét állítottunk elő mérésével a keresztezési pont minden standard érték (6-szor sorozatban hígított cDNS szívizom, amelyben a tartalmát S100A3 volt viszonylag bőséges) és nyomtatására ellen a logaritmikus értéke a koncentrációt. Standard görbe mintákat tartalmaz minden távon. Kvantitatív, valós idejű RT-PCR-t végeztünk ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Az RT-PCR-t végeztünk összesen 30 ml térfogatban. A reakcióelegyet tartalmazza 1 × puffert, 200 umol /l dezoxi-ribonukleozid trifoszfátok (dNTP-k) (Invitrogen), 0,3 nmol /liter szensz és antiszensz primerek, 1 U Takara ExTaq Hotstart Taq (TaKaRa Biotechnology), 0,6 ul 5 -karboxi-X-rodamin (ROX) referencia festék, és 2 ul cDNS-t. A PCR-ciklus részt 2 percig 95 ° C-on, majd 40 amplifikációs ciklus követett denaturálással 94 ° C-on 30 másodpercig, lánckapcsolódás 58 ° C-on (kimutatására GAPDH), illetve 55 ° C-on (kimutatására S100A3) 30 másodpercig, és lánchosszabbítás 72 ° C-on 1 percig. A relatív mennyiségi mind S100A3 és GAPDH úgy határoztuk meg, az összehasonlító CT (termikus ciklus) módszerrel. Az értékek a S100A3 mRNS expressziójának normalizáltuk szerint a kifejezés a GAPDH. Minden vizsgálatot háromszor megismételjük, hogy ellenőrizze az eredményeket, és az arány a mRNS expressziójának értéke gyomorrák szövetek szomszédos, nem daganatos szövetek használtuk a későbbi elemzéshez.
Statisztikai analízis
a folyamatos változók, az adatokat fejeztük eszközeként +/- SD. Expression adatai S100 gének microarray adathalmazok sikerült megmenteni, és a különbségek expressziós szint a normál és a gyomorrák szövetekben határoztuk Student t-teszt. Az egyesület közötti relatív expressziós arányai S100A3 és klinikai jellemzői elemeztük Mann-Whitney tesztet. Az összes adatot elemeztük a SPSS11.0 szoftver (SPSS, Chicago, USA), és a különbséget tekintettük szignifikánsnak, ha P < 0.05.
Eredménye
1. SAGE és virtuális Northern-blot elemzése S100 gének expressziójának gyomorrák
Vannak 2 SAGE könyvtárak normál gyomornyálkahártya és 8. SAGE könyvtárak gyomorrák szövetek rendelkezésre GEO honlapján (GSE545 és GSE14). Ezeket a könyvtárakat, amelyek két különböző laboratóriumokban [14, 15]. A megbízható tag 20 S100 géneket kivont SAGEmap weboldalt, és a használt keresni az SAGE adatokat. 10 gént találtak, hogy erősen expresszálódik gyomorrák szövetekben beállításának megfelelően kritériumainak > 3-szoros különbség (1. táblázat). Ezekben 10 gén, csak S100A6 és S100A10 is kimutatható a normál gyomornyálkahártya szövetekben, ami szintén legmagasabb átlagos sűrűsége a gyomorrák (865,9 TPM és 1890,5 TPM -kal). A többi 8 géneket, beleértve S100A2, S100A3, S100A4, S100A7, S100A8, S100A9, S100A12 és S100A16 volt más átlagos sűrűsége kezdve 2.8 TPM 637,0 TPM, amelyek egyike sem volt kifejezett normál gyomornyálkahártya szövetekben. Nincs szignifikáns különbség a kifejezés a normális és a rákos szövetekben lehet találni S100A11, S100A14 és S100P (az adatokat nem mutatjuk). Ezután használt virtuális Northern-blot-elemzése expresszióját S100 gének (3. táblázat). Hat gének esetében igazolták a túlszabályozott gyomorrák szövetekben. A pozitív S100A6, S100A8, és S100A16 azonosított SAGE elemzés során kimutatták, hogy nincs szignifikáns különbség a kifejezés a normális és gyomorrák könyvtárak lefolytatása során EST virtuális Northern-blottal. S100A13, nem mutatható SAGE könyvtárak, kimutatták, hogy erősen expresszálódik a gyomorrák szövetekben EST virtuális Northern-blot. S100A3 és az S100A12 nem lehetett kimutatni virtuális Northern blot.Table 3 Virtuális Northern-blot elemzése S100 gének expresszióját a normális és a gyomorrák könyvtárak

EST tag (TPM *) Matton SAGE címkék (TPM *) Matton
Normal

Cancer

Normal

Cancer

S100A2
0.0
25.9
0.0
200.5
S100A3
0.0
0.0
0.0
0.0
S100A4
52.3
293.7
0.0
168.4
S100A7
0.0
0.0
0.0
304.8
S100A9
0.0
8.6
0.0
1339.4
S100A10
0.0
181.4
272.3
1483.7
S100A12
0
0
0
0
S100A13
0.0
43.2
0.0
0.0
Csak S100s azt mutatják, hogy a pozitív mérkőzések jelennek meg a táblázatban. * Címkék per millió;
2. Microarray elemzése S100 gének expressziójának gyomorrák
Microarray analízist végeztünk annak további igazolására a overexpressziója S100 gének gyomorrák. 8., 11. és a 7. S100 gének találhatók GSE2669, GSE2701 és GSE3438 adatkészletek volt (4. táblázat). Mindkét S100A2 és S100A10 géneket kimutatták, hogy fokozódik a gyomorrák mindhárom adatállományok. S100A3 kimutatták, hogy túl expresszálódik gyomorrák adatállomány GSE2669 és GSE2701, ami nem létezett adatbázisba GSE3438. S100A4, S100A6 és S100A7 kimutatták, hogy van szabályozva az gyomorrák egyetlen adatbázisba, de nem létezik a másik két adatsor. Azonban kifejezése S100A8 és S100A9 nem volt szignifikáns különbség a normál és a daganatos szövetek adatbázisba GSE2701. Az eltérő expressziója tendenciája S100A12 GSE2701 ellentétes volt, hogy a SAGE elemzés (1. táblázat) .table 4 microarray analízise S100 gének expressziója normál és gyomorrák szövetek katalógusa katalógusa GSE3438 Matton GSE2669 Matton GSE2701 Matton katalógusa normál * Matton Rák * Matton p
normál * Matton Rák * Matton p Matton
Normál * Matton Rák * Matton P katalógusa

S100A2
-0.22
0.00
0.00
1.03
1.35
0.01
-0.95
-0.36
0.00
S100A3
#
#
#
0.84
1.55
0.03
-0.14
0.05
0.03
S100A4
-0.23
0.30
0.00
#
#
#
#
#
#
S100A6
-0.43
0.27
0.00
#
#
#
#
#
#
S100A7
#
#
#
#
#
#
-1.00
-0.35
0.00
S100A8
#
#
#
0.32
0.69
0.01
0.66
0.70
0.81
S100A9
#
#
#
1.25
3.48
0.00
0.42
0.79
0.13
S100A10
-0.50
0.42
0.00
0.46
1.36
0.00
0.19
1.22
0.00
S100A12
#
#
#
#
#
#
0.50
0.21
0.01
Csak S100s azt mutatják, hogy a pozitív mérkőzések láthatók a táblázatban. * Kinyert adatokat microarray adatállományok; # Adatok nem léteznek a adatbázisba.
Együttesen 5 géneket kimutatták, hogy erősen kifejezett gyomorrák mindhárom in silico analízis módszerek. Ők voltak S100A2, S100A3, S100A4, S100A7 és S100A10. Ezek közül 5 gén, S100A3 volt az egyetlen, amely még nem számoltak be, hogy kapcsolatban áll a gyomorrák korábban. Továbbá megvizsgáltuk expresszióját S100A3 gyomorrákban szövetekben kvantitatív RT-PCR. Katalógusa 3. ellenőrzése S100A3 túltermelése gyomorrák kvantitatív RT-PCR
Annak vizsgálatára, hogy S100A3 volt túltermelõdik gyomorrák, megvizsgáltuk a mRNS expressziója S100A3 gyomorkarcinómában szövetekben és a megfelelő szomszédos, nem-daganatos szövetekben 80 beteg által kvantitatív RT-PCR-rel. A viszonylag jelenti expressziós szintjének S100A3 gyomorrákban volt 2,52 ± 1,45, összehasonlítva a szomszédos, nem daganatos szövetekben (p katalógusa = 0.01). Összefüggéseit S100A3 mRNS a klinikai tovább elemezzük. Az eredmények azt mutatták, hogy S100A3 mRNS expressziója nem korrelál a nem, életkor, a tumor mérete, mélysége fal invázió, mikroszkopikus altípusú nyirokcsomómetastasis egy statisztika p > 0.05 minden paramétert (5. táblázat). Ugyanakkor azt találtuk, hogy a kifejezés a S100A3 mRNS korrelált a tumor differenciálódásának és Tumor-node-Metastasis szakaszban. Az S100A3 expressziós szintek jól és mérsékelt differenciált tumor szövetekben egyaránt lényegesen alacsonyabb, mint a gyengén differenciálódott is (p
< 0,05). S100A3 expresszió TNM I. és II is alacsonyabb, mint a szakaszban a III és IV (p
= 0,04). Mindezek az adatok azt mutatják, hogy a S100A3 volt túltermelõdik gyomorrák példányok és összefüggésben lehet a differenciálódás és fejlődés a gyomor cancer.Table 5 korrelációja S100A3 mRNS expresszió clinicalpathological paraméterek betegeknél gyomorrák. Katalógusa változó Matton mRNS expresszió Matton P
katalógusa száma katalógusa
N /T > 4
N /T 4/2 Matton N /T 2/1 Matton N /T < 1 katalógusa
katalógusa Gender katalógusa Férfi katalógusa 61 katalógusa 11 katalógusa 34 katalógusa 9 katalógusa 8 katalógusa 0.17 fiatal női katalógusa 19 katalógusa 3
5 katalógusa 8 katalógusa 2

• Metiléntetrahidrofolát reduktáz C677T polimorfizmus betegeknél gyomor- és colorectalis rák koreai population
• Az életminőség javítása a betegek gyomorrák: fordítás és pszichometriai értékelése az iráni változata EORTC QLQ-STO22