Kolmen geenin allekirjoitus mahdollisina ennustavan biomarkkerina irinotekaanin herkkyyttä mahan cancer

Kolmen geenin allekirjoitus mahdollisina ennustavan biomarkkerina irinotekaanin herkkyyttä mahasyövässä
Abstract
Tavoite
Henkilökohtainen kemoterapia perustuu molekyylien biomarkkerit voivat maksimoida syövän vastaisen tehokkuutta. Pyrimme tutkimaan ennustava biomarkkerit voidaan ennustaa vastaus irinotekaania perustuvan hoidon mahasyövän. Tool Menetelmät
Tutkimme geenin ilmentymistä APTX, BRCA1, ERCC1, ISG15, Topo1 ja metylaatio SULF2 in formaliinikiinnitetyt parafiini- upotettu mahasyövän kudokset 175 potilasta ja arvioi yhdistyksen välillä geeniekspressiotasot tai metylaatiostatuksen ja in vitro
herkkyys irinotekaania. Käytimme useita regressioanalyysi kehittää geenien ilmentymisen malli ennustaa irinotekaani herkkyyttä mahasyövän ja validoitu tätä mallia vitro
ja vivo
.
Tulokset
Geenien ilmentyminen tasoilla APTX, BRCA1 ja ERCC1 olivat merkitsevästi vähemmän irinotekaania herkillä mahasyövän näytteistä kuin irinotekaani kestävä näytteet (P
< 0,001 kaikissa geenit), kun taas ISG15 (P
= 0,047) ja Topo1 (P
= 0,002) olivat merkittävästi korkeammat. Niiden perusteella geenejä, kolmen geenin allekirjoitus perustettiin, joka laskettiin seuraavasti: Indeksi = 0,488-0,020 × ilmentymistason APTX + 0,015 × ilmentymistason Topo1 - 0,011 × ilmentymistason BRCA1. Kolmen geeni allekirjoitusta merkitsevästi yhteydessä irinotekaanin herkkyys (rho = 0,71, P
< 0,001). Herkkyys ja ennustamiseen irinotekaanin herkästi kolmen geenin allekirjoituksen saavutti 73% ja 86%, vastaavasti. Toisessa riippumattoman testauksen asettaa, irinotekaani inhibiitionopeudet mahalaukun näytteiden herkkä allekirjoituksiin olivat paljon suurempia kuin ne, joilla on kestävä allekirjoituksiin (65% vs. 22%, P
< 0,001). Irinotekaanihoitoa 20 mg /kg viikossa immuunivajaisiin hiirillä kuljettavat ksenografteissa arkaluontoisia allekirjoituksiin dramaattisesti pidätettiin kasvainten kasvua (P
< 0,001), mutta ei ollut vaikutusta hiirillä kuljettavat ksenografteissa resistenteillä-allekirjoitus.
johtopäätökset
kolmen geenin allekirjoitus perustettiin tässä on mahdollinen ennakoiva biomarkkeri irinotekaanin herkkyyttä mahasyövässä.
avainsanat
Henkilökohtainen kemoterapiaa Irinotecan mahasyöpää HDRA immuunivajaisiin hiirillä Johdanto
mahasyöpää edelleen yksi tärkeimmistä syistä syöpäkuolemien maailmanlaajuisesti [1, 2]. Ei ole mitään "kultainen standardi" kemoterapiaa edennyt mahasyöpä asti. Viime vuosina uuden sukupolven solunsalpaajiin, kuten doketakselin, oksaliplatiini, irinotekaania, kapesitabiini ja S-1 on tutkittu faasin III tutkimuksissa [3]. Kuitenkin mediaanielossaolosta jäi alle vuoden [2], ja vastausprosentti oli vain noin 30% -50% [4]. Irinotekaani (CPT-11) on puolisynteettinen kamptotekiinin (CPT), joka häiritsee DNA: n replikaatiota ja solunjakautumisen kautta voimakas vuorovaikutus entsyymin topoisomeraasi I (Topo1). Sekä irinotekaanin ja CPT kuuluvat Topo1 estäjiä. Irinotekaani käytetään pääasiassa peräsuolen syövän ja myös käytetään usein hoitoon mahasyövän, esittää vasteen hinnat vaihtelevat 14%: sta 23% monoterapialla ja noin 50% yhdistettynä [5].
Useat molekyyli biomarkkereita kykenee ennustaa todennäköisyys vastaus kemoterapeuttisia aineita on tutkittu viime vuosikymmeninä [6]. Aikaisemmat tutkimukset ovat tunnistaneet rintasyöpä alttius geeni 1 (BRCA1) mahdollisina ennustavan biomarkkerina sisplatiinin ja doketakselin herkkyys [7, 8], tymidylaattisynteesin (TS) 5-FU ja raltitreksedi [9, 10], ja Leikkauskorjauksessa rajat täydennetään 1 (ERCC1) platinan [11]. Kuitenkin on ollut rajallista edistystä tunnistamisessa biomarkkerit voidaan ennustaa vastaus irinotekaania sisältävien hoitoa syöpään. Topo1 säätelee DNA ylikeloutumisen aikana replikaatiota tapa aiheuttaa yhden säikeen katkoksia ja uudelleenligaatiolla [12]. Irinotekaani ja sen aktiivisen metaboliitin SN-38 aiheuttaa DNA-vaurioita stabiloimalla ohimenevän kovalenttikompleksia välillä DNA ja Topo1, joka sitten johtaa DNA-säikeen katkoksia, replikointi pidätys, ja apoptoosin [13]. Korkea kasvain tasot Topo1 proteiinia on äskettäin raportoitu tunnistamaan alaryhmään metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaalla on hyvä vaste irinotekaani [14]. Korjaus irinotekaania liittyvien ja Topo1 välittämän DNA vaurioita vaatii poistamisen pysähtynyt Topo1 ja tarkkuus liittyy DNA tauko. Tämän prosessin aikana, erilaisia ​​korjaus- proteiinien, mukaan lukien aprataxin (APTX), BRCA1 ja ERCC1, ovat mukana, joista osa voi olla kliinistä potentiaalia ennustavan biomarkkereita [15].
Lisäksi ehdokas biomarkkerit edellä mainittiin, viimeaikaisissa tutkimuksissa ehdotti, että metylointi heparaanisulfaattiproteoglykaani 6-O-endosulfatase (SULF2) promoottori oli liittynyt herkkyys Topo1 inhibiittoreita Non-Small-Cell Lung Cancer (NSCLC) [16]. INF-indusoituvaa säätelijänä ubikinaa- (ISG15) voi tukkia ubikitiinipromoottori /26S proteasomaalisten johtava väylä kertymiseen CPT aiheuttaman DNA-vaurioita, mikä johti lisääntyneeseen apoptoosin [17]. SULF2 metylaatio (SULF2M) ja korkea ISG15 ilmentävien NSCLC solulinjat osoittivat 134-kertainen herkkyyden CPT kuin SULF2 unmethylation (SULF2U) ja alhainen ISG15 ilmentäviä solulinjoja [16].
Edellä esitetyn perusteella todisteita, me arveltu, että APTX, BRCA1 , ERCC1, ISG15, SULF2 ja Topo1 tai niiden yhdistelmä voisi olla tärkeä rooli ennustettaessa irinotekaanin herkkyys mahasyövässä. Nykyisessä tutkimuksessa selvitimme kukin geenin ennakoiva biomarkkerina itsestään, ja sitten perustettu algoritmi yhdistämällä nämä geenit yhdessä tarkemmin ennustaa irinotekaania herkkyys. Olemme myös validoitu mallin toisessa riippumaton joukko mahasyövän näytteitä ja kaksi kohortteja immunopuutoksesta hiirten malleja. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää kliinisesti hyödyllinen luokitus allekirjoitus, joka voisi ennustaa irinotekaanin herkkyyttä mahasyövässä.
Materiaalit ja menetelmät
Potilasnäytteet
Kaikki yksilöt ja kliiniset tiedot saatiin Syöpätautien ja kirurgia, Rumputorni.Lähistöllä sairaala Affiliated Medical School of Nanjingin yliopiston aikana elokuusta 2010 kesäkuu 2012. näytteet sisältävät 175 tuoretta poistetun mahalaukun kasvaimet, jotka oli satunnaisesti luokiteltu joko koulutus asettaa (n = 100) tai testaamalla sarja (n = 75) käyttämällä tietokoneella luotuja satunnaisia ​​numeroita. Jokainen kasvain kudos jaettiin kahteen osaan, kun se poistetaan leikkaus: (1) yksi osa pidettiin 4 ° C Hanksin tasapainotettu suolaliuos 1% penisilliini /streptomysiiniä ja havaittu kemosensitiivisyys in vitro
by histoculture huumeiden vastemääritystä (HDRA); (2) loput osa jätettiin formaliiniin ja siitä tehtiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) kasvain lohkoissa patologinen havainto ja geenin havaitseminen. Diagnoosi sairastavien potilaiden mahakasvaimen varmistettiin histopatologisesti. Kliiniset ja histopatologiset tulokset, kuten ikä, sukupuoli, histologia, kasvainpaikkaa, vaihe, histologisia laatu ja imusolmuke etäpesäke olivat kaikki kerätty. Kliiniset ominaisuudet potilasta yhteenveto taulukossa 1. Tietoon perustuva suostumus saatiin kaikilta potilailta ja protokollat ​​tätä tutkimusta hyväksyttiin Tutkijavoimavarojen Suojaava komitean Rumputorni sairaalan Affiliated Medical School of Nanjingin yliopisto. Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaisesti Kiinan koordinointikomitea Cancer Research säännöistä eläinten hyvinvointia koskeva ja eläinsuojelulain Law.Table 1 Potilasominaisuudet
Ominaisuus
Training setti (N = 100)

Independent testaus sarja (N = 75)
yhteensä (N = 175)
ikä, y mediaani (alue)
63 (29-83) B 63 (29-83)
63 (29-83) B ≥ 63
51 (51%) B 40 (53%) B 91 (52%) B < 63
49 (49%) B 35 (47%) B 84 (48%)
Sukupuoli
Mies
74 (74%) B 57 (76%)
131 (75%) B Nainen
26 (26%) B 18 (24%) B 44 (25%) B kasvainpaikkaa
Distal mahaan
34 ( 34%) B 28 (37%) B 62 (35%) B proksimaalinen mahan
41 (41%) B 29 (39%) B 70 (40%)
Koko vatsa
25 (25%) B 18 (24%) B 43 (25%) B-vaihe
I
13 (13%) B-7 (9% )
20 (11%) B II
20 (20%) B 21 (28%) B 41 (23%) B III
65 (65%)
45 (60%) B 110 (63%) B IV
2 (2%) B 2 (3%) B 4 (3%) B Histologinen laatu
2
20 (20%) B 16 (21%) B 36 (21%) B-3
47 (47%) B 34 (46%)
81 (46%) B Mixed 1-2
3 (3%) B 3 (4%) B 6 (3%) B Mixed 2-3
30 (30%)
22 (29%) B 52 (30%) B Imusolmuke etäpesäke
Ei
21 (21%) B 19 (25%) B 40 (23%)
Kyllä
79 (79%)
56 (75%)
135 (77%)
HDRA
HDRA suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [18]. Lyhyesti, tuore kasvaimen kudokset pestiin ja jauhettiin pieniksi palasiksi noin 0,5 mm halkaisijaltaan, jotka sijoitettiin sitten valmis kollageenia (Health Design, Rochester, NY) pinnat 24-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä. Oli 8 rinnakkaista viljelykuoppia irinotekaanin herkkyyden testaus ja 8 rinnakkaista viljelykuoppiin valvontaa. Inkubaation jälkeen 7 päivää 37 ° C: ssa (kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 95% ilmaa 5% CO 2), kun läsnä lääkkeiden liuotetaan RPMI 1640-alustassa, joka sisälsi 20% vasikan sikiön seerumia, 100 ui tyypin I kollagenaasilla ( 0,1 mg /ml, Sigma) ja MTT: tä (5 mg /ml, Sigma) lisättiin kuhunkin viljelmään ja inkuboitiin vielä 16 tunnin ajan. Pitoisuus irinotekaanin oli 20 ug /ml mukaan sen huippupitoisuus plasmassa (PPC) potilailla [19]. Kun oli uutettu dimetyylisulfoksidiin (DMSO, Sigma), liuoksen absorbanssi kussakin luettiin 540 nm: ssä. Absorbanssi per gramma viljellään kasvainkudoksen laskettiin keskiarvo absorbanssi kudosta 8 rinnakkaista viljelykuoppiin ja kasvaimen kudoksen paino määritettiin ennen kulttuuriin. Esto laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: esto
rate
%
=
1
-
T
/
C
x
100
%
T on keskimääräinen absorbanssi kasvaimen /paino
C on keskimääräinen absorbanssi ohjaus kasvaimen /paino
mRNA: n ekspression tason havaitseminen
Kokonais-RNA uuttamalla FFPE kudoksesta
Kuuden 7 um leikkeet valmistettiin FFPE kasvaimen lohkoja, jotka sisälsivät ainakin 80% kasvainsoluja. Sen jälkeen kun värjäys hematoksyliini-eosiinilla, syöpä osat olivat microdissected ja siirrettiin mikrosentrifugiputkeen. RNA eristettiin mukaisesti oma menettelyä (eurooppalainen patentti numero EP1945764-B1). Lyhyesti, parafiini poistettiin ksyleeni, ja microdissected syöpä osat hajotettiin proteinaasi K sisältävällä puskurilla 60 ° C: ssa 16 tuntia. RNA puhdistettiin fenolilla ja kloroformilla ja sen jälkeen saostamalla isopropanolilla, kun läsnä on natriumasetaattia -20 ° C: ssa. RNA-pelletti pestiin 70% etanolilla ja suspendoitiin uudelleen 53 ul: aan RNaasi-vapaata vettä, jota seuraa käsittely DNaasi I (Life Technologies).
QPCR arviointi geeniekspression
M-MLV-käänteistranskriptaasia Kit (Invitrogen) levitettiin tuottaa cDNA: Kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qPCR) havaitsemiseksi β-aktiini (ACTB), APTX, BRCA1, ERCC1, ISG15 ja Topo1. Kukin erä reaktion mukana positiivisena kontrollina kaupallisista ihmisen keuhkojen ja maksan RNA: ta (Stratagene, La Jolla, CA, USA), kuten kalibraattorit ja negatiiviset kontrollit ilman RNA: n ja käänteistranskriptaasia. Kokonais-RNA 1 ug käytettiin kutakin RT reaktiota. Templaatti-cDNA monistettiin spesifisillä alukkeilla ja koettimia ACTB, APTX, BRCA1, ERCC1, ISG15 ja Topo1 käyttäen Taqman Universal Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Määritys tunnukset (Applied Biosystems, Foster City, CA) alukkeet ja koettimet olivat seuraavat: Hs99999903_m1 (ACTB), Hs00214452_m1 (APTX), Hs00157415_m1 (ERCC1), Hs00192713_m1 (ISG15), Hs00243257_m1 (Topo1), BRCA1 (NM_007294) : eteenpäin 5 'GGCTATCCTCTCAGAGTGACATTTTA 3', reverse 5 'GCTTTATCAGGTTATGTTGCATGGT 3', ja koetin 6FAM -5 'CCACTCAGCAGAGGG 3' MGB. QPCR suoritettiin määrittämään geenin ilmentymistä käyttäen ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). PCR-olosuhteet olivat 50 ° C 2 min, 95 ° C: ssa 15 min, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 15 s ja 60 ° C 1 min. Suhteellinen geenien ilmentymisen kvantitatiivinen laskettiin vertailevan Ct menetelmällä käyttäen ACTB kuin endogeeninen kontrolli, perustuvat aikaisempaan kokemukseen verrataan erilaisia ​​taloudenhoito geenit [7, 20], ja kaupallinen ihmisen keuhkojen ja maksan RNA: t (Stratagene, La Jolla, CA, USA ) kuten kalibraattorit, jonka avulla voimme verrata geeniekspressiotasot eri potilailla. Lopputulokset määritettiin kaavalla mRNA ilmaisun taso = 2 - (DCT näyte-DCT kalibraattori) (DCT = Ct geeneihin Ct ACTB) [7, 21] ja analysoitiin Stratagene analyysi ohjelmisto.
DNA: n metylaation havaitsemiseen
DNA: n uutto ja muutos
Kolme 7 um leikkeet valmistettiin primaarikasvaimen lohkoja, jotka sisälsivät ainakin 80% kasvainsoluja. Sen jälkeen kun värjäys hematoksyliini-eosiinilla, syöpä osat olivat microdissected ja siirrettiin mikrosentrifugiputkeen. DNA eristettiin rutiininomaisesti ja sitten modifioitu natriumbisulfiittia muuntaa kaikki metyloitumattomat sytosiinit urasiileja jättäen methylcytosines muuttumattomina [16]. Sitten ne varastoitiin -20 ° C: ssa lisäanalyysiä varten.
Metylaatiospesifinen polymeraasiketjureaktio (MSP) B-MSP suoritettiin määrittämään metyloinnin SULF2 käyttäen ABI Prism 7300HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Kukin PCR-reaktio sisälsi genomisen DNA: 2 ui SYBR Green PCR Mix (TaKaRa, Japani) 10 ul: ssa, vettä 7,7 ui, ja alukkeita 0,15 ui (10 umol /l). PCR-olosuhteet olivat 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 45 sykliä 59 ° C: ssa 30 s, 72 ° C 30 s ja 95 ° C: ssa 30 s. Alukkeet SULF2 metyloitu PCR (TaKaRa, Japani) olivat seuraavat: eteenpäin 5 'TAAGTGTTTTTTTTATAGCGGC 3', kääntää 5'TACCGTAATTTCCGCTATC 3 '. Alukkeet SULF2 metyloitumattomia PCR (TaKaRa, Japani) olivat seuraavat: eteenpäin 5 'GTTTATAAGTGTTTTTTTATAGTGGT3', kääntää 5'TACCATAATTTCCACTATCCCT 3 '. Jokainen lähetys reaktio sisälsi positiivisen ohjauksen metyylitransferaasi (M.SssI) hoidetun ihmisen genomista DNA: ta (täysin metyloitu), negatiivinen kontrolli DNA-näytteistä, jotka on vahvistettu metyloimattomia ja toinen negatiivinen kontrolli ilman DNA: ta. Kaikki testit suoritettiin kahtena.
Perustaminen ja validointi geenin ilmentymisen malli irinotekaanin herkkyys ennustuksen
Otimme useita lineaarista regressioanalyysiä luoda optimoidun geenin ilmentymisen mallia, joka perustuu koulutukseen joukko 100 mahasyövistä [22]. Tulosten mukaan portaittaista regressio (merkintä: α = 0,10, poista: α = 0,15), malli koostui APTX, Topo1 ja BRCA1 on optimoitu yksi. Me osoitettu kullekin potilaalle indeksi mukainen lineaarinen yhdistelmä ekspressiotason mRNA painotettu regressiokerroin koulutuksesta näytteistä. Indeksi geenin ilmentymisen malli laskettiin seuraavasti: Indeksi = +0,488-,020 × ilmentymistason APTX + 0,015 × ilmentymistason Topo1 - 0,011 × ilmentymistason BRCA1. Tätä mallia myöhemmin validoitu toinen riippumaton testaus sarja 75 potilaalla on mahasyöpä. Testauksessa joukko potilaita paremmuusjärjestykseen geenin allekirjoitus indeksiin ja jakaa herkkä allekirjoituksiin ja kestävä-allekirjoituksen ryhmiä käyttämällä mediaani indeksin cutoff pisteen. Irinotekaanikohortissa herkkyys näiden kahden ryhmän testattiin HDRA ja verrataan toisiinsa.
Viv
o validointi geenin ilmentymisen malli irinotekaanin herkkyys ennustuksen
Perustaa immuunivajaisiin hiiriä mallit, joissa potilaasta peräisin maha- syöpä ksenografteja, kukin vasta-poistettujen kirurginen kasvainkudoksessa leikattiin paloiksi 3 x 3 x 3 mm 3, joka istutettiin 30 minuutista 12 atymisiin immuunivajausta hiiriä, kutsutaan "kohortti" [23]. Kussakin kohortti, kun kasvain kasvoi kooltaan 50-100 mm 3, hiiriä -ksenografteja satunnaistettiin saamaan irinotekaania 20 mg /kg /w, ip (n = 6) tai ilman hoitoa, koska ohjaus ( n = 6). Yksittäiset kasvaimen tilavuutta (V) laskettiin kaavalla "V = (pituus x leveys x leveys) /2" ja verrattiin arvoihin, jotka on hoidon alussa, jolloin saadaan kasvaimen suhteellisen tilavuuden. Hiiriä tarkkailtiin joka toinen päivä kasvaimen kasvua.
Jotta voitaisiin arvioida johdonmukaisesti inhibition irinotekaanin herkillä allekirjoituksen hiirissä, kolmen viikon kuluttua ensimmäisestä annosta, kaikki kasvaimet erotettiin ensimmäisen sukupolven hiirillä ja jatkoviljeltiin toisen sukupolven hiirillä. Toisessa sukupolven, ei lääkettä ylläpitäjä. Hiiriä tarkkailtiin päivittäin vielä kaksi viikkoa.
Tilastollinen analyysi
Mann-Whitneyn U-testiä ja Kruskal-Wallisin testiä käytettiin testaamaan yhdistyksen välillä mRNA ekspressiotasot ja kliinisiä tekijöitä, ja yhdistyksen välillä irinotekaani herkkyys ja potilaiden kliinispatologiset parametreja. Spearmanin sijoitus menetelmää käytettiin arvioimaan korrelaatiota mRNA ekspressiotasoja eri geenien sekä korrelaatio mRNA-tasoja ja in vitro
irinotekaanin herkkyys. Mann-Whitneyn U-testiä käytettiin vertaamaan irinotekaani herkkyyden välillä SULF2M ja SULF2U ryhmiä, irinotekaania herkkä ja irinotekaanin resistenttien potilaiden ja herkkien-allekirjoituksen ja kestävä-allekirjoitus ryhmiä. Vastaanotin toimii (ROC) dikäyrät laskea herkkyys ja spesifisyys ennustaminen perustuu eri geenit ja geeni-ilmentymisen malli suhteen irinotekaanin herkkyys. Parilliset Studentin t-testiä käytettiin arvioimaan eroja kasvaimen koon herkkien-allekirjoituksen hiiriä tai resistentti allekirjoituksiin hiirillä ja valvontaa. S P
< 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä (kaksipuolinen). Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS versio 16.0.
Tulokset
Potilaiden ominaisuudet
Ominaisuudet: lla kaikista potilaista on esitetty taulukossa 1. 175 potilailla, suurin osa potilaista oli miehiä (75%), ja histologia jokaisen näytteen oli adenokarsinooma. 62 (35%) potilaista, kasvain sijaitsee distaalinen vatsa, 70 (40%) proksimaalisessa mahassa, ja 43 (25%) koko vatsassa. Sata ja kymmenen (63%) potilaista oli vaiheen III tauti. Imusolmuke etäpesäke oli läsnä 135 (77%) potilaalla.
Geenien ilmentyminen tasolla
mRNA-ekspressiotasot APTX, BRCA1, ERCC1, ISG15 ja Topo1 havaittiin kaikissa kasvaimet, mediaani geeni-ilmentymisen tason suhteen siivous ACTB of 4,32 APTX (vaihteluväli 0,26-17,99, 95%: n luottamusväli (CI): 3,78-5,19), 7,91 ja BRCA1 (vaihteluväli 0,37-29,04, 95% CI: 7,07-9,51), 14.03 ERCC1 (vaihteluväli 0,33-46,30 , 95% CI: 13,01-17,07), 5,07 ja ISG15 (vaihteluväli 0,04-34,24, 95% CI: 3,94-6,21) ja 7,51 varten Topo1 (vaihteluväli 1,07-37,81, 95% CI: 6,38-9,17) (kuvio 1) . Merkittävä yhdistys ei havaittu APTX mRNA ilmaisun ja histologista arvosana (P
= 0,03), ja ISG15 mRNA ja sukupuoli (P
= 0,017). Mikään muu assosiaatio kliinisiä piirteitä ja kasvaimen mRNA-tasojen havaittiin (taulukko 2). Kuitenkin voimakas korrelaatio ei havaittu mRNA: n ekspressiotasot APTX ja BRCA1 (rho = 0,53, P
< 0,001), APTX ja ERCC1 (rho = 0,73, P
< 0,001), BRCA1 ja ERCC1 (rho = 0,48, P
< 0,001) kasvain. Kuva 1 Geenien ilmentyminen tasoilla APTX, BRCA1, ERCC1, ISG15 ja Topo1 175 potilasta analysoitiin kvantitatiivisen RT-PCR. Arvot geenin ilmentymisen laskettiin vertailevan Ct-menetelmällä käyttäen ACTB kuin endogeeninen kontrolli. Sininen viiva seisoi Keskimääräisen 95%: n luottamusväli.
Taulukko 2 Yhdistys geenin ilmaisuja ja patologiset ominaisuudet
Ominaisuus
No. Potilaiden
APTX mRNA
BRCA1 mRNA
ERCC1 mRNA
ISG15 mRNA
Topo1 mRNA


keskiarvo ± SD
keskiarvo ± SD
keskiarvo ± SD
keskiarvo ± SD
keskiarvo ± SD
Ikä , y
≥ 63
91 (52%) B 4,81 ± 3,78
8,61 ± 5,73
15,28 ± 10,01
4,48 ± 3,69
8,03 ± 7,30
< 63
84 (48%) B 4,09 ± 3,76
7,90 ± 5,95
14,75 ± 9,28
5,79 ± 6,90
7,47 ± 5,81
Sukupuoli
Mies
131 (75%) B 4,77 ± 3,33
8,41 ± 5,57
15,74 ± 10,19
5,54 ± 5,62
7,95 ± 7,17
Nainen
44 (25%) B 3,58 ± 3,29
7,92 ± 6,67
12,77 ± 7,30
3,53 ± 4,27 *
7,21 ± 4,62
kasvainpaikkaa
Distal mahaan
62 (35%) B 4,79 ± 2,87
8,97 ± 6,52
16,12 ± 10,36
7,05 ± 7,75
8,09 ± 5,93
proksimaalinen mahaan
70 (40%) B 4,16 ± 3,10
8,33 ± 5,72
13,97 ± 9,09
3,61 ± 2,64
7,40 ± 6,63
kaikkiaan mahaan
43 (25%) B 4,60 ± 4,44
7,12 ± 4,74
15,31 ± 9,70
4,61 ± 3,43
7,06 ± 7,94
Stage
I
20 (11%) B 4,25 ± 4,47
5,91 ± 3,40
13,40 ± 7,07
1,89 ± 0,83
5,89 ± 4,03
II
41 (23%) B 4,19 ± 3,01
8,58 ± 5,09
14,70 ± 9,56
6,76 ± 7,96
8,91 ± 6,35
III
110 (63%) B 4,66 ± 3,38
8,19 ± 5,75
15,56 ± 10,16
4,67 ± 4,01
7,70 ± 7,07
IV
4 (3%)
4,20 ± 4,61
15.88 ± 17.90
11,01 ± 5,00
7,25 ± 6,33
4,03 ± 1,63
histologinen luokka
2
36 (21% )
5,05 ± 3,54 *
10,97 ± 7,33
15,78 ± 9,52
4,86 ​​± 4,75
8,08 ± 6,61
3
81 (46%) B 3,92 ± 3,55
7,81 ± 5,16
14,30 ± 9,64
3,68 ± 2,75
7,18 ± 6,08
Mixed 1-2
6 (3%) B 3,63 ± 4,51
7,17 ± 2.13
15.17 ± 12.40
8,00 ± 8,94
8,42 ± 6,02
Mixed 2-3
52 (30%) B 4,55 ± 2,53
7,06 ± 5,27
15,65 ± 9,96
7,16 ± 7,74
8,44 ± 7,18
Imusolmuke etäpesäke
Ei
40 (23%) B 4,58 ± 3,39
8,70 ± 5,08
14,68 ± 7,31
5,97 ± 8,17
7,48 ± 4,47
Kyllä
135 (77%) B 4,46 ± 3,35
8,16 ± 6,05
15,16 ± 10,33
4,78 ± 4,12
7,87 ± 7,23
* P
< 0.05.
Suhdetta geenien ilmentymisen ja kemosensitiivisyys irinotekaanille
koulutuksen asetettu, irinotekaani herkkyys testattiin onnistuneesti kaikissa kasvaimissa, joissa mediaani esto 43,3% (vaihteluväli 2% -89%, CI: 39 % -47%). Ei ollut merkittävää yhdistyksen välillä irinotekaanin herkkyyden ja kliinisiä tekijöitä (taulukko 3), kuten ikä (P =
0,51), sukupuoli (P =
0,77), kasvain sivusto (P =
0,64), vaihe ( P =
0,41), histologinen arvosana (P =
0,48) ja imusolmuke etäpesäke (P =
0,47). Kuitenkin mRNA tasot APTX (rho = -0,48, P
< 0,001), BRCA1 (rho = -0,49, P
< 0,001), ERCC1 (rho = -0,42, P
< 0,001), ISG15 (rho = 0,34, P
= 0,001), ja Topo1 (rho = 0,43, P
< 0,001) osoittivat korrelaation irinotekaania herkkyyttä. Potilaita paremmuusjärjestykseen irinotekaani inhibiitionopeudet ja jaettu irinotekaania herkkä ja irinotekaania kestävä ryhmiä käyttämällä mediaani esto cutoff kohta [19]. Geenien ilmentyminen tasoilla APTX (P
< 0,001), BRCA1 (P
< 0,001) ja ERCC1 (P
< 0,001) olivat merkitsevästi vähemmän irinotekaania herkillä potilailla kuin irinotekaani resistenttien potilaiden , kun taas ISG15 (P
= 0,047) ja Topo1 (P
= 0,002) olivat huomattavasti suuremmat (kuva 2A-E). ROC dikäyrät laskea herkkyys ja spesifisyys kunkin geenin ennustettaessa irinotekaanin herkkyys (kuvio 2G-J). Kuuluvilla alueilla ROC-käyrän (AUC), herkkyys ja spesifisyys ennustamiseen irinotekaanin herkästi APTX, BRCA1, ERCC1, ISG15 ja Topo1 mRNA-tasot olivat taulukossa 4.Table 3 välisestä assosiaatiosta irinotekaanin herkkyyden ja kliinisiä tekijöitä
Ominaisuus
Irinotecan esto
Irinotecan esto
tarkoittaa (95% CI)
keskiarvo (95% CI) B

Training joukko (N = 100)
Riippumaton testaus sarja (N = 75)
ikä, y mediaani (alue)
≥ 63
42% ( 36-47%) B 44% (31-57%) B < 63
45% (39-51%) B 44% (34-54%)
Sukupuoli
Mies
43% (38-47%) B 42% (33- 51%) B Female
45% (36-55%) B 50% (31-68%) B kasvainpaikkaa
Distal vatsa
42% (35-49%)
44% (28-60%) B proksimaalinen mahan
44% (38-51%) B 47% (35-58%)
kaikkiaan mahan
43% (35 -51%) B 37% (16-59%) B Stage
I
34% (21-47%) B 36% (3-70%) B II
49% (40-57%) B 50% (31-68%) B III
43% (38-48%) B 44% (34-54%) B IV
33%
34%
histologinen luokka
2
41% (33-49%) B 44% (21-68%) B 3
42 % (36-48%) B 39% (27-51%) B Mixed 1-2
54%
58%
Mixed 2-3
46% (38- 54%) B 49% (35-62%) B Imusolmuke etäpesäke
Ei
42% (33-51%) B 46% (27-65%) B Kyllä
44% (39-48%) B 44% (34-53%) B Signature indeksi
> 0,43
57% (52-63%) **
65% (61-70%) **
≤ 0,43
31% (27-36%) B 22% (17 -28%) B ** P
< 0,001.
Kuvio 2 Geenien ilmentyminen tasoilla APTX (P < 0,001), BRCA1 (P < 0,001) ja ERCC1 (P < 0,001) olivat merkitsevästi vähemmän irinotekaania herkillä potilailla kuin irinotekaani resistenttien potilaiden, kun taas ISG15 (P = 0,047) ja Topo1 (P = 0,002) olivat merkittävästi korkeammat. Rasiakuvaajien osoitti mRNA-ekspressiotasot APTX (A), BRCA1 (B), ERCC1 (C), ISG15 (D) ja Topo1 (E) irinotekaani-herkkä ja irinotekaani kestävä ryhmiä, vastaavasti (n = 100). Viivat sisällä laatikot merkitään medians. Viikset of rasiakuvaajien: Min Max. Kuvaajat ROC-käyrä osoitti AUC-arvot APTX (F), BRCA1 (G), ERCC1 (H), ISG15 (I) ja Topo1 (J) ennustamiseksi irinotekaanin herkkyys. Herkkyys (Y-akseli) piirrettiin väärien positiivisten fraktio (1 - spesifisyys).
Taulukko 4 herkkyys ja spesifisyys viiden geenin ekspressiotasoja ennustamiseen irinotekaanin herkkyys
Genes
Chemotheraputic aineet
Herkkyys
spesifisyys
AUC (95% CI)
P
APTX
Irinotecan
73%
74%
0,758 (,669-,847) B < 0,001
BRCA1
Irinotecan
91%
58%
0,760 (0,673-,846) B < 0,001
ERCC1
Irinotecan
64%
79%
0,726 (,632-0,821) B < 0,001
ISG15
Irinotecan
59%
73%
0,617 (0,494-0,740) B 0,047
Topo1
Irinotecan
48%
94%
0,664 (0,563-0,765) B 0,002
suhde SULF2 metylaatio ja herkkyys irinotekaania
koulutuksen asetettu, metylaatiostatuksen SULF2 onnistuneesti havaittiin kaikilla potilailla, joilla kolmekymmentäkolme (28%) kuljettavat SULF2M kahdeksankymmentä neljä (72%) kuljettavat SULF2U. Ei ollut merkittävää yhdistyksen välillä SULF2 metylaatio ja kliiniset tekijät. Irinotekaanikohortissa inhibiitionopeudet oli 49,8% (vaihteluväli 2% -89%, 95% CI: 41% -59%) ja SULF2M ryhmä, ja 40,2% ja SULF2U ryhmä (alue 2% -84%, 95% CI: 34% - 46%, P
= 0,08).
perustaminen geenin ilmentymisen malli ja sen yhdessä herkkyys irinotekaania
perusteella ilmentymistason viisi geeniä ja aseman SULF2 metylaation rakensimme allekirjoitus useiden lineaarista regressioanalyysiä, kuten edellä menetelmissä. Indeksi kolmen geenin allekirjoitus vaihteli +0,08-+0,99 kanssa keskiarvon 0,43 ± 0,16. Oli merkittävä korrelaatio indeksin ja irinotekaanin herkkyys (rho = 0,71, P
< 0,001) (kuvio 3A). ROC-käyrä muodostettiin laskea herkkyys ja spesifisyys kolmen geenin allekirjoitus ennustettaessa irinotekaanin herkkyys (kuvio 3B). AUC oli 0,828 (95% CI: 0,755-0,901, P
< 0,001). Kun kynnysarvo 0,43, herkkyys ja spesifisyys ennustamiseen irinotekaanin herkästi kolmen geenin allekirjoituksen saavutti 73% ja 86%, vastaavasti. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Mekanismeja välittömiä vaikutuksia Roux-en-Y mahalaukun ohitusleikkaus tyypin 2 diabetes
• Advanced mahasyövän osoittaa pitkän aikavälin täydellisen remission vastauksena S-1 monoterapia: kaksi tapauskertomuksiin