Ein Drei-Gen-Signatur als potentielle prädiktive Biomarker für Irinotecan Empfindlichkeit im Magen cancer

Ein Drei-Gen-Signatur als potentielle prädiktive Biomarker für Irinotecan Empfindlichkeit bei Magenkrebs
Zusammenfassung
Ziel | Personalized Chemotherapie auf der Basis molekularer Biomarker können Krebs maximieren Effizienz. Wir wollen prädiktive Biomarker untersuchen Lage, als Reaktion auf Irinotecan-basierte Behandlung bei Magenkrebs vorherzusagen.
Methoden kaufen Wir Gen untersucht, die Expression von APTX, BRCA1, ERCC1, ISG15, Topo1 und die Methylierung von SULF2 in Formalin-fixierten Paraffin- Magenkrebsgewebe von 175 Patienten eingebettet und bewertet die Assoziation zwischen Genexpressionsniveaus oder Methylierungsstatus und in vitro
Empfindlichkeit gegenüber Irinotecan. Wir haben mehrere lineare Regressionsanalyse ein Gen-Expressionsmodell zu entwickeln, Irinotecan Empfindlichkeit bei Magenkrebs und validiert, um vorherzusagen, dieses Modell in vitro und vivo

.
Ergebnisse | Gene Expression von APTX, BRCA1 und ERCC1 waren signifikant niedriger als bei Irinotecan empfindlichen Magenkrebs Proben als die Irinotecan-resistenten Proben (P
< 0,001 für alle Gene), während ISG15 (P
= 0,047) und Topo1 (P
= 0,002) waren signifikant höher. Auf der Grundlage dieser Gene, ein Drei-Gen-Signatur wurden gegründet, die wie folgt berechnet: Index = 0,488-0,020 × Expressionsniveau von APTX + 0,015 × Expressionsniveau von Topo1 - 0.011 × Expression von BRCA1. Das Drei-Gen-Signatur war signifikant mit Irinotecan Empfindlichkeit assoziiert (rho = 0,71, P
< 0,001). Die Sensitivität und Spezifität für die Vorhersage von Irinotecan Empfindlichkeit auf der Basis der Drei-Gen-Signatur erreicht 73% und 86% betragen. In einer weiteren unabhängigen Test Satz waren die Irinotecan Hemmung Raten bei Magenproben mit empfindlicher-Signatur viel höher als die mit resistenten-Signatur (65% vs. 22%, p
< 0,001). Irinotecan-Therapie mit 20 mg /kg pro Woche zu immungeschwächten Mäusen Xenotransplantate mit empfindlichen-Signatur dramatisch verhaftete das Wachstum von Tumoren (P
< 0,001) trägt, hatte aber keine Auswirkung auf Mäuse Xenotransplantate mit resistenten-Signatur trägt
. Schlussfolgerungen
die Signatur drei Gen aufgebaut ist hier ein Potenzial prädiktive Biomarker für Irinotecan Empfindlichkeit bei Magenkrebs.
Schlüsselwörter Personalisierte Chemotherapie Irinotecan Magenkrebs HDRA Immundefiziente Mäuse Einführung
Magenkrebs bleibt eine der führenden Ursachen von Krebstod weltweit [1, 2]. Es gibt keine "Goldstandard" Chemotherapie bei fortgeschrittenem Magenkrebs bis jetzt. In den letzten Jahren neue Generation Chemotherapiemittel, wie Docetaxel, Oxaliplatin, Irinotecan, Capecitabin und S-1 wurden in Phase III-Studien [3] untersucht worden. Allerdings ist die mittlere Überlebenszeit unter einem Jahr blieb [2] und die Reaktionsgeschwindigkeit betrug nur etwa 30% -50% [4]. Irinotecan (CPT-11) ist ein halbsynthetisches Derivat von Camptothecin (CPT), die mit dem Enzym Topoisomerase I (Topo1) mit DNA-Replikation und Zellteilung durch seine starke Wechselwirkung stört. Sowohl Irinotecan und CPT gehören zu Topo1-Inhibitoren. Irinotecan ist vor allem bei Darmkrebs eingesetzt und auch häufig bei der Behandlung von Magenkrebs verwendet, Response-Raten zeigt, die von 14% variiert bis 23% als Einzelwirkstoff und etwa 50% in Kombination [5].
Eine Reihe von molekularen Biomarkern fähig die Wahrscheinlichkeit der Reaktion auf chemotherapeutische Mittel zum Vorhersagen wurden in den letzten Jahrzehnten [6] untersucht. Unsere bisherigen Studien haben Brustkrebs Anfälligkeit identifizierte Gen 1 (BRCA1) als potentielle prädiktive Biomarker für Cisplatin und Docetaxel Empfindlichkeit [7, 8], Thymidylat-Synthase (TS) für 5-FU und Raltitrexed [9, 10], und Exzisionsreparatur Cross- Ergänzung 1 (ERCC1) für Platin [11]. Allerdings hat es bei Magenkrebs zur Vorhersage Reaktion auf-Irinotecan basierten Behandlung begrenzte Fortschritte bei der Identifizierung von Biomarkern der Lage gewesen. Topo1 reguliert DNA supercoiling während der Replikation durch die Art und Weise des Verursachens Einzelstrangbrüche und Religation [12]. Irinotecan und sein aktiver Metabolit SN-38 DNA-Schäden induzieren, indem eine transiente kovalenten Komplex zwischen DNA und Topo1 Stabilisierung, die dann in DNA-Strangbrüchen führt, Replikationsarrest und Apoptose [13]. Hohe Tumorniveaus Topo1 Protein haben vor kurzem eine Untergruppe von Patienten mit metastasiertem Kolorektalkarzinom zu identifizieren, mit guten Ansprechen auf Irinotecan [14] berichtet. Die Reparatur der Irinotecan-assoziierten und Topo1-vermittelte DNA-Schäden erfordert die Entfernung des ins Stocken geraten Topo1 und die Auflösung der assoziierten DNA-Pause. Während dieses Prozesses eine Vielzahl von Reparaturproteinen, einschließlich Aprataxin (APTX), BRCA1 und ERCC1, beteiligt sind, von denen einige klinische Potenzial als prädiktiver Biomarker kann [15].
Neben der Biomarker-Kandidaten oben erwähnt, die jüngsten Studien vorgeschlagen, dass die Methylierung des Heparansulfat-6-O-endosulfatase (SULF2) Promotor mit Empfindlichkeit gegenüber Topo1 Inhibitoren in Non-Small-Cell Lung Cancer (NSCLC) [16] verbunden war. INF-induzierbarer Regulator der Ubiquitinierung (ISG15) könnte blockieren den Ubiquitin /26S-Proteasom-Weg zu einer Akkumulation von CPT-induzierter DNA-Schädigung führen, die in einer erhöhten Apoptose führte [17]. SULF2 Methylierung (SULF2M) und hohe ISG15 exprimierenden NSCLC-Zelllinien zeigte 134-fache Empfindlichkeit gegenüber CPT als SULF2 unmethylation (SULF2U) und niedrige ISG15 exprimierenden Zelllinien [16].
Basierend auf den obigen Beweise, wir nahmen an, dass APTX, BRCA1 , ERCC1, ISG15, SULF2 und Topo1 oder deren Kombination könnte bei der Vorhersage von Irinotecan Empfindlichkeit bei Magenkrebs eine wichtige Rolle spielen. In der aktuellen Studie untersuchten wir jedes Gen als prädiktiver Biomarker für sich, und dann etablierten Algorithmus diejenigen Gene zusammen, um genauer vorhersagen Irinotecan Empfindlichkeit kombiniert wird. Wir validiert das Modell auch in einem anderen unabhängigen Satz von Magenkrebs Proben und zwei Kohorten von immungeschwächten Mäusen Modelle. Das Ziel dieser Studie war es, eine klinisch nützliche Klassifikation Signatur zu identifizieren, die die Irinotecan Empfindlichkeit bei Magenkrebs vorhersagen könnte.
Materialien und Methoden
Patientenproben
Alle Proben und relevanten klinischen Daten wurden von der Abteilung für Onkologie erhalten und allgemeine Chirurgie, Drum Tower Krankenhaus, angeschlossen an die Medizinische Fakultät der Universität Nanjing in der Zeit von August 2010 bis Juni 2012. die Proben sind 175 frisch entnommenen Magentumoren, die zufällig entweder als Trainingssatz eingestuft wurden (n = 100) oder Testsatz (n = 75) von computergenerierten Zufallszahlen verwendet wird. Jede Tumorgewebe wurde in zwei Teile geteilt, sobald er in der Operation entfernt: (1) Ein Teil wurde in 4 ° C Hanks 'ausgeglichener Salzlösung mit 1% Penicillin /Streptomycin und detektiert Chemosensitivität in vitro Gewebekultur und Videos Arzneimittelreaktion Assay gehalten (HDRA); (2) der restliche Teil wurde in Formalin links und machte in Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Tumorblöcke für die pathologische Beobachtung und Gen-Erkennung. Die Diagnose von Patienten mit Magentumor wurde durch Histopathologie bestätigt. Klinische und histopathologische Daten, wie Alter, Geschlecht, Histologie, Tumorstelle, Stadium, wurden histologischen Grad und Lymphknotenmetastasen alle gesammelt. Klinische Charakteristika der Patienten sind in Tabelle 1 zusammengefasst Einverständniserklärung wurde von allen Patienten erhalten und die Protokolle für diese Studie wurden von der Human Research Schutzausschuss des Drum Tower Krankenhaus, angeschlossen an die Medizinische Fakultät der Universität Nanjing genehmigt. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem chinesischen Koordinierungsausschuss für die Krebsforschung Ordnung für das Wohlergehen der Tiere und der Tierschutz Law.Table 1 Patientencharakteristika
Charakteristisch
Trainingssatz (N = 100) durchgeführt

Unabhängige Tests Satz (N = 75)
insgesamt (N = 175)
Alter, y Median (Bereich)
63 (29-83)
63 (29-83)
63 (29-83)
≥ 63
51 (51%)
40 (53%)
91 (52%)
< 63
49 (49%)
35 (47%)
84 (48%)
Sex
Male
74 (74%) 57 (76%)

131 (75%)
weiblich
26 (26%)
18 (24%) 44 (25%)
Tumor
Distal Magen 34 ( 34%)
28 (37%)
62 (35%)
proximale Magen
41 (41%)
29 (39%)
70 (40%)
Ganze Magen
25 (25%)
18 (24%)
43 (25%)
Bühne
I 13 (13%)
7 (9% )
20 (11%)
II
20 (20%)
21 (28%)
41 (23%)
III
65 (65%)
45 (60%)
110 (63%)
IV
2 (2%)
2 (3%)
4 (3%)
Grading
2
20 (20%)
16 (21%) 36 (21%)
3
47 (47%)
34 (46%)
81 (46%)
Mixed 1-2
3 (3%)
3 (4%)
6 (3%)
Mixed 2-3
30 (30%)
22 (29%)
52 (30%)
Lymphknotenmetastase
No
21 (21%)
19 (25%)
40 (23%)
Ja
79 (79%)
56 (75%)
135 (77%)
HDRA
HDRA Verfahren wie zuvor beschrieben durchgeführt wurden [18]. Kurz gesagt, wurden die frischen Tumorgewebe in kleine Stücke zu etwa 0,5 mm im Durchmesser gewaschen und fein zerkleinert, die dann auf vorbereiteten Kollagen gelegt wurden (Health Design, Rochester, NY) Oberflächen in 24-Well-Mikroplatten. Es gab 8 parallel Kulturvertiefungen für Irinotecan Empfindlichkeitsprüfung und 8 parallele Kulturvertiefungen für die Kontrolle. Nach Inkubation für 7 Tage bei 37 ° C (in einer befeuchteten Atmosphäre mit 95% Luft -5% CO 2) in Gegenwart von Arzneimitteln, gelöst mit RPMI 1640-Medium, 20% fötalem Kälberserum, 100 &mgr; l, Typ I Kollagenase ( 0,1 mg /ml, Sigma) und MTT (5 mg /ml, Sigma) wurden zu jeder Kultur zugegeben und gut für weitere 16 Stunden inkubiert. Konzentration von Irinotecan betrug 20 &mgr; g /ml entsprechend seiner maximalen Plasmakonzentration (ppc) in Patienten [19]. Nach Extraktion mit Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma), Extinktion der Lösung in jeder Vertiefung wurde bei 540 nm abgelesen. Extinktion pro Gramm kultivierten Tumorgewebe wurde aus der mittleren Extinktion von Gewebe aus 8 parallelen Kulturvertiefungen, und der Tumor-Gewebegewicht wurde vor der Kultur bestimmt berechnet. Die Hemmungsrate wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: Inhibition
Rate
%
=
1 | -
T
/ C
×
100
%
T ist die mittlere Absorption von behandelten Tumors /Gewicht
C ist die mittlere Absorption der Kontrolle Tumor /Gewicht
mRNA-Expression Gesamt-RNA-Extraktion aus FFPE Gewebe
Grenzstanderfassung
Sechs 7-um-Schnitte von FFPE Tumorblöcke hergestellt wurden, die mindestens 80% Tumorzellen enthalten. Nach der Hämatoxylin-Eosin-Färbung wurden die Krebsteile mikrodissezierten und in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt. RNA wurde nach einem proprietären Verfahren (Europäische Patentnummer EP1945764-B1) isoliert. Kurz gesagt, Paraffin durch Xylol wurde entfernt, und mikrodissezierten kanzerösen Teile wurden in einer Proteinase lysiert 16 h-Puffer bei 60 ° C-K enthält. RNA wurde durch Phenol und Chloroformextraktionen durch Fällung mit Isopropanol in Gegenwart von Natriumacetat bei -20 ° C gereinigt. Das RNA-Pellet wurde in 70% Ethanol gewaschen und in 53 &mgr; l RNase-freiem Wasser, gefolgt von einer Behandlung mit DNase I (Life Technologies).
QPCR Beurteilung der Genexpression
M-MLV Reverse Transcriptase Kits (Invitrogen) resuspendiert angewendet wurde cDNA für quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zu erzeugen, die β-Aktin (ACTB) APTX, BRCA1, ERCC1, ISG15 und Topo1 zu detektieren. Jede Charge der Reaktions enthielt eine positive Kontrolle aus handelsüblichen menschlichen Lunge und Leber-RNA (Stratagene, La Jolla, CA, USA) als Kalibratoren und negative Kontrollen ohne RNA und reverser Transkriptase. Gesamt-RNA, 1 &mgr; g wurde für jeden RT-Reaktion verwendet. Template cDNA wurde mit spezifischen Primern und Sonden amplifiziert ACTB, APTX, BRCA1, ERCC1, ISG15 und Topo1 mittels Taqman Universal-Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Die Assay-IDs (Applied Biosystems, Foster City, CA) für die Primer und Sonden waren wie folgt: Hs99999903_m1 (ACTB), Hs00214452_m1 (APTX), Hs00157415_m1 (ERCC1), Hs00192713_m1 (ISG15), Hs00243257_m1 (Topo1), BRCA1 (NM_007294) : vorwärts 5 'GGCTATCCTCTCAGAGTGACATTTTA 3', Reverse 5 'GCTTTATCAGGTTATGTTGCATGGT 3' und Sonde 6FAM -5 'CCACTCAGCAGAGGG 3' MGB. QPCR wurde durchgeführt, die Genexpression unter Verwendung des ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems) zu quantifizieren. Die PCR-Bedingungen waren 50 ° C für 2 min, 95 ° C für 15 min, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 1 min. Relative Genexpression Quantifizierungen wurden gemäß dem Vergleichs Ct Methode berechnet ACTB als endogene Kontrolle verwenden, auf der Grundlage unserer bisherigen Erfahrungen Vergleich verschiedener Housekeeping-Gene [7, 20], und kommerzielle menschlichen Lunge und Leber RNAs (Stratagene, La Jolla, CA, USA als Kalibratoren), die uns Genexpressionsniveaus zwischen verschiedenen Patienten zu vergleichen, ermöglicht. Die endgültigen Ergebnisse wurden durch die Formel-mRNA-Expression bestimmt level = 2 - (dCt Probe-dCt Kalibrator) (dCt = Ct Gen- Ct ACTB) [7, 21] und wurden mit dem Stratagene-Analyse analysiert Software.
DNA Methylierungsnachweis
DNA-Extraktion und Modifikation
Drei 7-um-Schnitte aus primären Tumorblöcke hergestellt wurden, die mindestens 80% Tumorzellen enthalten. Nach der Hämatoxylin-Eosin-Färbung wurden die Krebsteile mikrodissezierten und in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt. DNA wurde routinemäßig isoliert und wurde dann chemisch durch Natriumbisulfit modifizierte alle nicht methylierten Cytosine zu urazile zu konvertieren, während Methylcyto- unverändert [16] zu verlassen. Dann wurden sie bei -20 ° C für die weitere Analyse gespeichert.
Methylierungsspezifischen Polymerase-Kettenreaktion (MSP)
MSP wurde ausgeführt, um die Methylierung von SULF2 unter Verwendung des ABI Prism 7300HT Sequence Detection System (Applied Biosystems) zu bestimmen. Jede PCR-Reaktion enthielt genomische DNA 2 ul, SYBR Green PCR Mix (Takara, Japan) 10 &mgr; l, 7,7 &mgr; l Wasser und 0,15 ul Primer (10 umol /l). Die PCR-Bedingungen waren 95 ° C für 10 min, gefolgt von 45 Zyklen bei 59 ° C für 30 s, 72 ° C für 30 s und 95 ° C für 30 s. Primer für SULF2 methylierte PCR (Takara, Japan) waren wie folgt: vorwärts 5 'TAAGTGTTTTTTTTATAGCGGC 3', Reverse 5'TACCGTAATTTCCGCTATC 3 '. Primer für SULF2 unmethylierte PCR (Takara, Japan) waren wie folgt: vorwärts 5 'GTTTATAAGTGTTTTTTTATAGTGGT3', Reverse 5'TACCATAATTTCCACTATCCCT 3 '. Jede Charge der Reaktion enthielt eine positive Kontrolle von Methyltransferase (M.SssI) humanen genomischen DNA (vollständig methyliert) -behandelten, eine negative Kontrolle von DNA-Proben, die ohne DNA unmethyliert und eine weitere Negativkontrolle bestätigt worden ist. Alle Tests wurden doppelt ausgeführt.
Die Etablierung und Validierung des Genexpressionsmodell für Irinotecan Empfindlichkeit Vorhersage kaufen Wir multiple lineare Regressionsanalyse nimmt die optimierte Gen-Expression-Modell auf dem Trainingssatz von 100 Magenkrebs Basis zu etablieren [22]. Nach den Ergebnissen der schrittweisen Regression (Eintritt: α = 0,10, zu entfernen: α = 0,15), Modell bestand aus APTX, Topo1 und BRCA1 ist die optimierte ein. Wir zugewiesen jeden Patienten ein Index entsprechend der linearen Kombination des Expressionsspiegels der mRNA durch den Regressionskoeffizienten von den Trainingsproben gewichtet. Der Index des Gen-Expression-Modell wurde wie folgt berechnet: Index = 0,488-0,020 × Expressionsniveau von APTX + 0,015 × Expressionsniveau von Topo1 - 0.011 × Expression von BRCA1. Dieses Modell wurde später mit Magenkrebs in einem anderen unabhängigen Testsatz von 75 Patienten validiert. Im Test-Set wurden die Patienten entsprechend ihrer Gen-Signatur-Index und unterteilt in sensitive-Signatur und resistent-Signatur-Gruppen durch den Median-Index als der Cutoff-Punkt verwenden. Die Irinotecan Empfindlichkeit dieser beiden Gruppen wurden durch HDRA und miteinander verglichen getestet.
In viv
o Validierung des Gen-Expression-Modell für Irinotecan Empfindlichkeit Vorhersage
Zum immundefizienten Mäusen Modelle mit Patienten stammenden Magen etablieren Krebs Xenografts, die jeweils frisch entferntem chirurgische Tumorgewebe in Stücke von 3 × 3 × 3 mm geschnitten 3, die innerhalb von 30 min bis 12 athymischen immundefizienten Mäuse transplantiert wurden, bezeichnet als eine "Kohorte" [23]. In jeder Kohorte, wenn der Tumor auf eine Größe von 50-100 mm wuchs 3, Mäuse mit Xenotransplantate wurden randomisiert einer Behandlung mit Irinotecan 20 mg /kg /w, ip (n = 6) oder ohne Behandlung als Kontrolle ( n = 6). Einzelne Tumorvolumina (V) wurden durch die Formel "V = (Länge × Breite × Breite) /2" berechnet, und im Vergleich zu den Werten zu Beginn der Behandlung die relative Tumorvolumen zu erhalten. Die Mäuse wurden jeden zweiten Tag für das Tumorwachstum beobachtet.
Um eine einheitliche Hemmung von Irinotecan in den sensiblen-Signatur Mäuse drei Wochen nach der ersten Verabreichung alle Tumoren wurden von der ersten Generation Mäuse getrennt zu bewerten und zu der zweiten Generation agierten Mäusen. In der zweiten Generation wurde kein Medikament verabreicht. Die Mäuse wurden jeden Tag für zwei weitere Wochen beobachtet.
Statistische Analyse
Der Mann-Whitney-U-Test und der Kruskal-Wallis-Test verwendet die Assoziation zwischen mRNA Expression und klinischen Eigenschaften zu testen, und die Assoziation zwischen Irinotecan Empfindlichkeit und klinischen Parametern der Patienten. Der Spearman-Rang Methode wurde verwendet, um die Korrelation der mRNA-Expressionsniveaus zwischen verschiedenen Genen sowie die Korrelation zwischen mRNA-Spiegel und in vitro
Irinotecan Empfindlichkeit zu beurteilen. Der Mann-Whitney-U-Test wurde verwendet, um Irinotecan Empfindlichkeit zwischen SULF2M und SULF2U Gruppen, Irinotecan empfindlichen und Irinotecan-resistenten Patienten und zwischen empfindlichen-Signatur und resistente Signaturgruppen vergleichen. Receiver operating characteristic (ROC) Kurven wurden erzeugt, um die Sensitivität und Spezifität der Vorhersage auf verschiedenen Genen und der Gen-Expression-Modell in Bezug auf Irinotecan Empfindlichkeit zu berechnen. Paired Student-t-Test wurde verwendet, um die Unterschiede zwischen den Tumorgrößen sensitiver-signature Mäusen oder resistenter-signature Mäusen und Kontrollen zu evaluieren. Ein P
< 0,05 wurde als statistisch signifikant (zweiseitig) betrachtet. Die statistische Analyse wurde die SPSS mit der Version 16.0.
Ergebnisse Patientencharakteristika
Eigenschaften aller Patienten
sind in Tabelle 1 Bei den 175 Patienten gezeigt, waren die Mehrzahl der Patienten Männer (75%), und die Histologie jeder Probe war Adenokarzinom. In 62 (35%) der Patienten wurde der Tumor in dem distalen Magen befindet, in 70 (40%) in dem proximalen Magen und in 43 (25%) in der gesamten Magen. Hundert und zehn (63%) Patienten hatten Stadium III. Lymphknotenmetastasen war in 135 (77%) Patienten.
Genexpressionsniveaus, Die mRNA Expression von APTX, BRCA1, ERCC1, ISG15 und Topo1 wurden in allen Tumoren, mit einer medianen Genexpression Ebene relativ zu Housekeeping erkannt ACTB von 4,32 für APTX (Bereich 0,26 bis 17,99, 95% Konfidenzintervall (CI): 3,78 bis 5,19), 7,91 für BRCA1 (Bereich 0,37 bis 29,04, 95% CI: 7,07-9,51), 14,03 für ERCC1 (Bereich 0,33-46,30 , 95% CI: 13,01-17,07), 5,07 für ISG15 (Bereich 0,04 bis 34,24, 95% CI: 3,94-6,21) und 7,51 für Topo1 (Bereich 1,07 bis 37,81, 95% CI: 6,38-9,17) (Bild 1) . Ein signifikanter Zusammenhang wurde zwischen APTX mRNA Expression und histologischen Grad (P
= 0,03) und ISG15 mRNA und Geschlecht (P
= 0,017) beobachtet. Keine andere Verbindung zwischen klinischen Charakteristika und Tumor-mRNA-Spiegel gefunden (Tabelle 2). Jedoch wurde eine starke Korrelation zwischen den mRNA-Expressionsniveaus von APTX und BRCA1 beobachtet (rho = 0,53, P
< 0,001), APTX und ERCC1 (rho = 0,73, P
< 0,001), BRCA1 und ERCC1 (rho = 0,48, P
< 0,001) in Tumor. Abbildung 1 Genexpressionsniveaus APTX, BRCA1, ERCC1, ISG15 und Topo1 in 175 Patienten untersucht durch quantitative RT-PCR. Werte der Genexpression wurden gemäß dem Vergleichs Ct-Methode berechnet ACTB als endogene Kontrolle verwendet. Die blaue Linie stand für die mittlere mit 95% CI.
Tabelle 2 die Assoziation der Genexpressionen und pathologischen Merkmale
Charakteristika
No. von Patienten
APTX mRNA
BRCA1-mRNA
ERCC1 mRNA
ISG15 mRNA
Topo1 mRNA


Mittelwert ± SD
Mittelwert ± SD
Mittelwert ± SD
Mittelwert ± SD
Mittelwert ± SD
Alter , y
≥ 63
91 (52%) 4,81 ± 3,78
8,61 ± 5,73
15.28 ± 10.01
4,48 ± 3,69
8,03 ± 7,30
<
; 63
84 (48%)
4,09 ± 3,76
7,90 ± 5,95
14,75 ± 9,28
5,79 ± 6.90
7,47 ± 5,81
Sex
Male
131 (75%)
4,77 ± 3,33
8,41 ± 5,57
15,74 ± 10,19
5,54 ± 5,62
7,95 ± 7,17
Weiblich
44 (25%)
3,58 ± 3,29
7,92 ± 6,67
12.77 ± 7.30
3,53 ± 4,27 *
7,21 ± 4,62
Tumor
Distal Magen
62 (35%)
4.79 ± 2,87
8,97 ± 6,52
16,12 ± 10,36
7,05 ± 7,75
8,09 ± 5,93
proximale Magen
70 (40%)
4,16 ± 3.10
8,33 ± 5,72
13,97 ± 9,09
3,61 ± 2,64
7,40 ± 6,63
ganzen Magen
43 (25%)
4,60 ± 4,44
7,12 ± 4,74
15,31 ± 9,70
4,61 ± 3,43
7,06 ± 7,94
Bühne
I
20 (11%)
4,25 ± 4,47
5,91 ± 3,40
13,40 ± 7,07
1,89 ± 0,83
5,89 ± 4,03
II
41 (23%)
4,19 ± 3,01
8,58 ± 5,09
14,70 ± 9,56
6,76 ± 7,96
8,91 ± 6,35
III
110 (63%)
4,66 ± 3,38
8,19 ± 5,75
15,56 ± 10,16
4,67 ± 4,01
7,70 ± 7,07
IV
4 (3%)
4,20 ± 4,61
15.88 ± 17.90
11.01 ± 5.00
7,25 ± 6,33
4,03 ± 1,63
Grading
2 36 (21%
) 5,05 ± 3,54 *
10,97 ± 7,33
15.78 ± 9.52
4,86 ​​± 4,75
8,08 ± 6,61
3
81 (46%)
3,92 ± 3,55
7,81 ± 5,16
14,30 ± 9,64
3,68 ± 2,75
7,18 ± 6,08
Mixed 1-2
6 (3%)
3,63 ± 4,51
7,17 ± 2.13
15.17 ± 12.40
8,00 ± 8,94
8,42 ± 6,02
Mixed 2-3
52 (30%)
4,55 ± 2,53
7,06 ± 5,27
15.65 ± 9,96
7,16 ± 7,74
8,44 ± 7,18
Lymphknotenmetastase
No
40 (23%)
4,58 ± 3,39
8,70 ± 5,08
14,68 ± 7,31
5,97 ± 8,17
7,48 ± 4,47
Ja
135 (77%)
4,46 ± 3,35
8,16 ± 6,05
15.16 ± 10.33
4,78 ± 4,12
7,87 ± 7,23
* P
< . 0,05
Die Beziehung zwischen Genexpression und Chemosensitivität zu Irinotecan
Im Trainingssatz wurde die Irinotecan Empfindlichkeit erfolgreich in allen Tumoren getestet, mit einer medianen Hemmungsrate von 43,3% (Bereich 2% -89%, CI: 39 % -47%). Es gab keinen signifikanten Zusammenhang zwischen Irinotecan Empfindlichkeit und klinischen Eigenschaften (Tabelle 3), einschließlich Alter (P =
0,51), Geschlecht (P =
0,77), Tumor (P =
0,64), Stufe ( P =
0,41), histologischen Grad (P =
0,48) und Lymphknotenmetastasen (P =
0,47). Allerdings mRNA-Spiegel von APTX (rho = -0,48, P
< 0,001), BRCA1 (rho = -0,49, P
< 0,001), ERCC1 (rho = -0,42, P
< 0,001), ISG15 (rho = 0,34, P = 0,001
) und Topo1 (rho = 0,43, P
< 0,001) zeigte eine Korrelation mit Irinotecan Empfindlichkeit. Die Patienten wurden nach ihrer Irinotecan Hemmraten geordnet und aufgeteilt in Irinotecan empfindliche und Irinotecan-resistente Gruppen durch die mittlere Hemmungsrate als Cutoff-Punkt unter Verwendung von [19]. Gene Expression von APTX (P
< 0,001), BRCA1 (P
< 0,001) und ERCC1 (P
< 0,001) waren signifikant niedriger als bei Irinotecan empfindlichen Patienten als in der Irinotecan-resistenten Patienten , während ISG15 (P
= 0,047) und Topo1 (P
= 0,002) waren signifikant höher (2A-E). ROC-Kurven wurden erzeugt, um die Empfindlichkeit und Spezifität der jedes Gen in der Vorhersage Irinotecan Empfindlichkeit (2G-J) zu berechnen. Die Flächen unter der ROC-Kurve (AUC), Sensitivität und Spezifität für die Vorhersage von Irinotecan Empfindlichkeit basierend auf APTX, BRCA1, ERCC1, ISG15 und Topo1 mRNA-Spiegel wurden in Tabelle 3 4.Table Assoziation zwischen Irinotecan Empfindlichkeit und klinische Merkmale aufgeführt
Charakteristisch
Irinotecan Inhibierungsgeschwindigkeit
Irinotecan Inhibierungsgeschwindigkeit
bedeuten (95% CI)
bedeuten (95% CI)

Trainingssatz (N = 100)
Unabhängige Tests Satz (N = 75)
Alter, y Median (Bereich)
≥ 63
42% ( 36-47%)
44% (31-57%)
< 63
45% (39-51%)
44% (34-54%)
Sex
männlich
43% (38-47%) 42%
(33- 51%)
Weiblich
45% (36-55%)
50% (31-68%)
Tumor
Distal Magen
42% (35-49%)
44% (28-60%)
proximale Magen
44% (38-51%)
47% (35-58%)
43%
ganzen Magen (35 -51%)
37% (16-59%)
Bühne
I 34% (21-47%)
36%
(3-70%)
II
49% (40-57%)
50% (31-68%)
III
43% (38-48%)
44% (34-54%)
IV
33%
34%
Grading 2
41% (33-49%) 44%
(21-68%)
3
42 % (36-48%)
39% (27-51%)
Mixed 1-2
54%
58%
Mixed 2-3
46% (38- 54%)
49% (35-62%)
Lymphknotenmetastase
Kein
42% (33-51%)
46% (27-65%)
Ja
44% (39-48%)
44% (34-53%)
Signatur Index
> 0,43
57% (52-63%) **
65% (61-70%) **
≤ 0,43
31% (27-36%)
22% (17
-28%) ** P
< . 0.001 of 2 Genexpressionsniveaus APTX (P < 0,001) gezeigt, BRCA1 (P < 0,001) und ERCC1 (P < 0,001) waren signifikant niedriger in Irinotecan empfindlichen Patienten als bei Irinotecan resistenten Patienten, während ISG15 (P = 0,047) und Topo1 (P = 0,002) signifikant höher. Box-Plots zeigten die mRNA-Expressionsniveaus von APTX (A), BRCA1 (B), ERCC1 (C), ISG15 (D) und Topo1 (E) in Irinotecan empfindlichen und Irinotecan beständige Gruppen, bzw. (n = 100). Die Leitungen in den Boxen bezeichnet die Mediane. Die Whisker von Box-Plots: Min Max. Graphen der ROC-Kurve zeigte die AUC-Werte von APTX (F), BRCA1 (G), ERCC1 (H), ISG15 (I) und Topo1 (J) für Irinotecan Empfindlichkeit der Vorhersage. Empfindlichkeit (Y-Achse) wurde aufgetragen gegen die falsch-positive Fraktion. (1 - Spezifität)
Tabelle 4 Die Sensitivität und Spezifität von fünf Genexpressionsniveaus für die Vorhersage von Irinotecan Empfindlichkeit
Gene
chemotheraputic
Agenten
Empfindlichkeit
Spezifität
AUC (95% CI)
P
APTX
Irinotecan
73%
74%
0,758 (0,669-0,847)
< 0,001
BRCA1
Irinotecan
91%
58%
0.760 (0,673-,846)
< 0,001
ERCC1
Irinotecan
64%
79%
0,726 (0,632 bis 0,821)
< 0,001
ISG15
Irinotecan
59%
73%
0,617 (0,494-0,740)
0,047
Topo1
Irinotecan
48%
94%
0,664 (0,563-0,765)
0.002
Die Beziehung zwischen SULF2 Methylierung und Empfindlichkeit gegenüber Irinotecan
im Trainingssatz wurde der Methylierungsstatus des SULF2 erfolgreich bei allen Patienten nachgewiesen, mit dreiunddreißig (28%) trägt SULF2M und vierundachtzig (72%) trägt SULF2U. Es gab keinen signifikanten Zusammenhang zwischen SULF2 Methylierungsstatus und klinische Merkmale. Die Irinotecan Hemmung Raten betrugen 49,8% (Bereich 2% -89%, 95% CI: 41% -59%) für SULF2M-Gruppe und 40,2% für SULF2U Gruppe (Bereich 2% -84%, 95% CI: 34% - 46%, P
= 0,08).
die Einrichtung des Genexpressionsmodell und seine Verbindung mit Empfindlichkeit gegenüber Irinotecan
Basierend auf der Expression von fünf Genen und den Status von SULF2 Methylierung, konstruierten wir eine Signatur durch mehrfache lineare Regressionsanalyse, wie in den Verfahren erwähnt. Der Index der drei Gen-Signatur reichten von 0,08 bis 0,99 mit einem mittleren Wert von 0,43 ± 0,16. Es gab eine signifikante Korrelation zwischen dem Index und Irinotecan Empfindlichkeit (rho = 0,71, P
< 0,001) (3A). ROC-Kurve wurde erzeugt, um die Empfindlichkeit und Spezifität des Drei-Gen-Signatur in der Vorhersage Irinotecan Empfindlichkeit (3B) zu berechnen. Die AUC war 0,828 (95% CI: 0,755 bis 0,901, P
< 0,001). Mit dem Schwellenwert von 0,43, die Empfindlichkeit und Spezifität für die Vorhersage von Irinotecan Empfindlichkeit auf der Basis der Drei-Gen-Signatur erreicht 73% und 86% betragen. Abbildung 3 Die Bewertung und Validierung des Drei-Gen-Signatur für Irinotecan Empfindlichkeit Vorhersage. A, gab es eine signifikante Assoziation zwischen dem Drei Gen Signaturindex und Irinotecan Empfindlichkeit (rho = 0,71, P
< 0,001). Index (Y-Achse) wurde gegen Irinotecan Hemmungsrate aufgetragen. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

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