Una firma de tres genes como potenciales biomarcadores predictivos para la sensibilidad irinotecán en cancer

gástrica Una firma de tres genes como potenciales biomarcadores predictivos para la sensibilidad irinotecan en el cáncer gástrico
Resumen Objetivo
quimioterapia personalizada basada en biomarcadores moleculares pueden maximizar contra el cáncer eficiencia. Nuestro objetivo es investigar biomarcadores predictivos capaces de predecir la respuesta al tratamiento basado en irinotecán en el cáncer gástrico.
Métodos
Se examinó la expresión de genes de APTX, BRCA1, ERCC1, ISG15, Topo1 y la metilación de SULF2 en parafina y fijado en formalina incrustado tejidos de cáncer gástrico de 175 pacientes y se evaluó la asociación entre los niveles de expresión de genes o estado de metilación y la sensibilidad in vitro
al irinotecán. Se utilizó el análisis de regresión lineal múltiple para desarrollar un modelo de expresión de genes para predecir la sensibilidad irinotecan en el cáncer gástrico y validado este modelo in vitro e in vivo

.
Resultados
los niveles de expresión génica de APTX, BRCA1 y ERCC1 fueron significativamente menores en irinotecan sensibles a muestras de cáncer gástrico que esas muestras irinotecán resistente (P
< 0,001 para todos los genes), mientras que ISG15 (P
= 0,047) y Topo1 (P
= 0,002) fueron significativamente más altos. Sobre la base de esos genes, se estableció una firma de tres genes, que se calcula de la siguiente manera: Índice = 0,488 - 0,020 × nivel de expresión de APTX + 0,015 × nivel de expresión de Topo1 - 0.011 × nivel de expresión de BRCA1. La firma de tres genes se asoció significativamente con la sensibilidad irinotecán (rho = 0,71, P Hotel < 0,001). La sensibilidad y especificidad para la predicción de la sensibilidad irinotecan basado en la firma de tres genes alcanzaron 73% y 86%, respectivamente. En otro conjunto de pruebas independiente, las tasas de inhibición de irinotecán en muestras gástricas con sensible a la firma eran mucho más altos que los que tienen a prueba de firma (65% vs. 22%, P
< 0,001). tratamiento con irinotecán con 20 mg /kg por semana a ratones inmunodeficientes que llevan xenoinjertos con sensible a la firma detenido drásticamente el crecimiento de los tumores (P
< 0,001), pero no tuvo efecto en ratones portadores de xenoinjertos con resistentes a la firma
. conclusiones México La firma de tres genes que aquí se establece es un biomarcador predictivo potencial de sensibilidad irinotecan en el cáncer gástrico.
Palabras clave personalizada
quimioterapia del cáncer gástrico irinotecan HDRA inmunodeficientes ratones Introducción
El cáncer gástrico sigue siendo una de las causas principales de muerte por cáncer en todo el mundo [1, 2]. No hay un "patrón oro" quimioterapia para el cáncer gástrico avanzado hasta ahora. En los últimos años, los nuevos agentes quimioterapéuticos generación, tales como docetaxel, oxaliplatino, irinotecan, capecitabina y S-1 se han estudiado en estudios de fase III [3]. Sin embargo, la supervivencia media se mantuvo por debajo de un año [2], y la tasa de respuesta fue de aproximadamente el 30% -50% [4]. Irinotecan (CPT-11) es un derivado semisintético de la camptotecina (CPT) que interfiere con la replicación del ADN y la división celular a través de su potente interacción con la enzima topoisomerasa I (Topo1). Tanto irinotecan y CPT pertenecen a los inhibidores de Topo1. Irinotecan se utiliza principalmente en el cáncer colorrectal y también se utiliza con frecuencia en el tratamiento del cáncer gástrico, mostrando tasas de respuesta que varían de 14% a 23% como agente único y aproximadamente el 50% en combinación [5].
Un número de biomarcadores moleculares capaces de la predicción de la probabilidad de respuesta a los agentes quimioterapéuticos han sido investigados durante las últimas décadas [6]. Nuestros estudios previos han identificado mama susceptibilidad al cáncer de gen 1 (BRCA1) como potencial biomarcador predictivo para el cisplatino y la sensibilidad docetaxel [7, 8], la timidilato sintasa (TS) para 5-FU y raltitrexed [9, 10], y la reparación por escisión cruzada complementando 1 (ERCC1) para el platino [11]. Sin embargo, ha habido un progreso limitado en la identificación de biomarcadores capaces de predecir la respuesta al tratamiento basado en irinotecán en el cáncer gástrico. Topo1 regula el superenrollamiento del ADN durante la replicación a través de la forma de causar roturas de cadena sencilla y religación [12]. metabolito de irinotecán y su activo SN-38 induce daño en el ADN mediante la estabilización de un complejo covalente transitorio entre el ADN y Topo1, que luego se traduce en roturas en el ADN de hebra, la detención de replicación, y la apoptosis [13]. Recientemente se han reportado niveles elevados de proteína tumorales Topo1 para identificar un subgrupo de pacientes con cáncer colorrectal metastásico con buena respuesta al irinotecan [14]. Reparación del daño del ADN asociado en irinotecan y mediada por Topo1 requiere la eliminación de la Topo1 estancado y resolución de la rotura del DNA asociado. Durante este proceso, una variedad de proteínas de reparación, incluyendo aprataxina (APTX), BRCA1 y ERCC1, están involucrados, algunos de los cuales pueden tener potencial clínico como biomarcadores predictivos [15].
Además de los biomarcadores candidatos se ha mencionado anteriormente, los estudios recientes sugiere que la metilación de la 6-O-endosulfatase promotor de heparán sulfato (SULF2) se asoció con la sensibilidad a los inhibidores Topo1 en células no pequeñas de cáncer de pulmón (NSCLC) [16]. regulador de INF-inducible de ubiquitinación (ISG15) podría bloquear la vía de la ubiquitina /26S proteasomal que conduce a la acumulación de daño del ADN inducida por CPT que resultó en un aumento de la apoptosis [17]. metilación SULF2 (SULF2M) y alta ISG15 expresando líneas celulares de cáncer mostraron una sensibilidad 134 veces mayor a la CPT que SULF2 no metilación (SULF2U) y las líneas celulares que expresan bajos Isg15 [16].
Con base en las evidencias anteriores, la hipótesis de que APTX, BRCA1 , ERCC1, ISG15, SULF2, y Topo1 o su combinación podrían desempeñar un papel importante en la predicción de la sensibilidad irinotecan en el cáncer gástrico. En el presente estudio, se investigó cada gen como biomarcador predictivo por sí mismo, y luego establecimos algoritmo de combinación de esos genes en conjunto para predecir con mayor precisión la sensibilidad irinotecán. También se validó el modelo en otro conjunto independiente de las muestras de cáncer gástrico y dos cohortes de modelos de ratones inmunodeficientes. El objetivo de este estudio fue identificar una firma de clasificación clínicamente útil que podría predecir la sensibilidad irinotecan en el cáncer gástrico.
Materiales y métodos Las muestras de pacientes

Todas las muestras y datos clínicos relevantes se obtuvieron del departamento de oncología y cirugía general, Torre del tambor hospital afiliado a la Facultad de Medicina de la Universidad de Nanjing durante el período comprendido entre agosto de 2010 y junio de 2012. las muestras incluyen 175 tumores recién extraídos gástricos, que se clasificaron aleatoriamente ya sea como conjunto de entrenamiento (n = 100) o conjunto de pruebas (n = 75), mediante el uso de números aleatorios generados por computadora. Cada tejido tumoral se divide en dos partes una vez que se elimina en la cirugía: (1) una parte se mantuvo en solución salina equilibrada de 4 ° C de Hanks con 1% de penicilina /estreptomicina y se detecta la quimiosensibilidad in vitro
por el ensayo de respuesta a los fármacos histocultivo (HDRA); (2) la parte restante se dejó en formalina y se convierte en bloques (FFPE) de tumores fijados con formalina embebidos en parafina para la observación patológica y la detección de genes. El diagnóstico de los pacientes con tumor gástrico fue confirmada por histopatología. fueron recogidos los datos clínicos e histopatológicos, incluyendo la edad, el sexo, la histología, localización tumoral, estadio, grado histológico y la metástasis de los ganglios linfáticos. Características clínicas de los pacientes se resumen en la Tabla 1. El consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes y los protocolos para este estudio fueron aprobados por el Comité de Protección de Investigación Humana de la Torre del Tambor Hospital afiliado a la Facultad de Medicina de la Universidad de Nanjing. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Comité de Coordinación de China sobre el Reglamento de la investigación del cáncer para el bienestar de los animales y de la Protección de los Animales Law.Table 1 Características de los pacientes
Característica
conjunto de entrenamiento (N = 100)
conjunto de pruebas
Independiente (N = 75) guía empresas en total (N = 175)
Edad, años mediana (rango): perfil 63 (29-83)
63 (29-83)
63 (29-83)
≥ 63
51 (51%)
40 (53%)
91 (52%) Hotel < 63
49 (49%)
35 (47%)
84 (48%): perfil del sexo masculino

74 (74%)
57 (76%)
131 (75%)
Mujer
26 (26%)
18 (24%)
44 (25%)
tumor Site
estómago distal
34 ( 34%)
28 (37%)
62 (35%)
proximal estómago
41 (41%)
29 (39%)
70 (40%)
Todo el estómago
25 (25%)
18 (24%)
43 (25%)
Etapa I
página 13 (13%) página 7 (9% ): perfil 20 (11%)
II
20 (20%): perfil 21 (28%): perfil 41 (23%)
III
65 (65%)
45 (60%)
110 (63%)
IV página 2 (2%) página 2 (3%) página 4 (3%) del tour histológico
2
20 (20%)
16 (21%)
36 (21%) página 3
47 (47%): perfil 34 (46%): perfil 81 (46%)
Mixta 1-2 página 3 (3%) página 3 (4%) página 6 (3%)
Mixta 2-3
30 (30%)
22 (29%)
52 (30%)
metástasis de ganglios linfáticos
Sin
21 (21%) página 19 (25%)
40 (23%) Sí

79 (79%): perfil 56 (75%): perfil 135 (77%)
HDRA
se realizaron procedimientos HDRA como se describe anteriormente [18]. En resumen, los tejidos tumorales frescos se lavaron y se desmenuzaron en trozos pequeños a aproximadamente 0,5 mm de diámetro, que después se colocan en colágeno preparada (Diseño de la Salud, Rochester, NY) a la superficie en microplacas de 24 pocillos. Hubo 8 pocillos de cultivo paralelas para las pruebas de sensibilidad irinotecán y 8 pocillos de cultivo paralelas para el control. Después de la incubación durante 7 días a 37 ° C (en una atmósfera humidificada que contiene 95% de aire -5% de CO 2) en presencia de los fármacos disueltos con RPMI 1640 que contenía suero de ternera fetal 20%, 100 tipo I l colagenasa ( 0,1 mg /ml, Sigma) y MTT (se añadieron 5 mg /ml, Sigma) a cada pocillo de cultivo y se incubó durante otras 16 horas. La concentración de irinotecan fue 20 mg /ml de acuerdo con su concentración plasmática máxima (ppc) en pacientes [19]. Después de la extracción con dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma), la absorbancia de la solución en cada pocillo se leyó a 540 nm. La absorbancia por gramo de tejido tumorales cultivadas se calculó a partir de la absorbancia media de tejido de 8 pocillos de cultivo paralelas, y el peso del tejido tumoral se determinó antes del cultivo. El porcentaje de inhibición se calculó utilizando la siguiente fórmula: Inhibición
tasa
%
=
1 | -
T
/
C
×
100
%
T es la absorbancia media del tumor tratado /peso
C es la absorbancia media del tumor de control /Peso
detección de nivel de expresión del ARNm
extracción de ARN total a partir de tejido FFPE
se prepararon seis secciones de 7 micras a partir de bloques tumorales FFPE que contenían células tumorales al menos el 80%. Después de la tinción con hematoxilina-eosina, las partes cancerosas se microdissected y se transfirieron a un tubo de microcentrífuga. Se aisló ARN de acuerdo con un procedimiento específico (número de patente EP1945764-B1 Europea). Brevemente, se eliminó la parafina por xileno, y microdissected partes cancerosas se lisaron en una proteinasa K que contiene tampón a 60 ° C durante 16 h. RNA se purificó mediante extracciones con fenol y cloroformo, seguido de precipitación con isopropanol en presencia de acetato de sodio a -20 ° C. El sedimento de RNA se lavó en etanol al 70% y se resuspendió en 53 l de agua libre de RNasa, seguido de tratamiento con DNasa I (Life Technologies). QPCR evaluación
de la expresión génica
M-MLV Reverse Transcriptase Kit (Invitrogen) se aplicó para generar ADNc para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para detectar la β-actina (ACTB), APTX, BRCA1, ERCC1, ISG15 y Topo1. Cada lote de reacción incluyó un control positivo de pulmón humano comercial y ARN de hígado (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) como calibradores y controles negativos sin ARN y transcriptasa inversa. ARN total 1 mg se utilizó para cada reacción de RT. Molde de cDNA se amplificó con cebadores y sondas específicas para ACTB, APTX, BRCA1, ERCC1, ISG15 y Topo1 utilizando Taqman Universal Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). El ensayo de identificadores (Applied Biosystems, Foster City, CA) para los cebadores y sondas fueron los siguientes: Hs99999903_m1 (ACTB), Hs00214452_m1 (APTX), Hs00157415_m1 (ERCC1), Hs00192713_m1 (ISG15), Hs00243257_m1 (Topo1), BRCA1 (NM_007294) : delantero 5 'GGCTATCCTCTCAGAGTGACATTTTA 3', revertir 5 'GCTTTATCAGGTTATGTTGCATGGT 3', y 6FAM sonda -5 'CCACTCAGCAGAGGG 3' MGB. QPCR se realizó para cuantificar la expresión de genes utilizando el sistema ABI Prism 7900HT de detección de secuencias (Applied Biosystems). Las condiciones de PCR fueron 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 15 min, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min. génica relativa cuantificaciones de expresión se calcularon de acuerdo con el método comparativo Ct usando ACTB como control endógeno, basado en nuestra experiencia previa comparación de diferentes genes de limpieza [7, 20], y de pulmón e hígado ARN humanos comerciales (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU. ) como calibradores, lo que nos permite comparar los niveles de expresión de genes entre diferentes pacientes. Los resultados finales se determinaron mediante la expresión de mRNA nivel fórmula = 2 - (muestra-DCT dCt calibrador) (DCT = Ct gene- Ct ACTB) [7, 21] y se analizaron con el análisis Stratagene software. detección de la metilación del ADN

la extracción de ADN y la modificación
Tres secciones 7-micras fueron preparadas a partir de bloques tumorales primarias que contenían las células tumorales al menos 80%. Después de la tinción con hematoxilina-eosina, las partes cancerosas se microdissected y se transfirieron a un tubo de microcentrífuga. Se aisló el ADN de forma rutinaria y luego se modificó químicamente por bisulfito de sodio para convertir todas las citosinas no metiladas a uracilos, dejando inalterada methylcytosines [16]. A continuación, se almacenaron a -20 ° C para su posterior análisis.
Reacción en cadena de la polimerasa específica de metilación (MSP)
MSP se realizó para determinar la metilación de SULF2 utilizando el sistema ABI Prism 7300HT de detección de secuencias (Applied Biosystems). Cada reacción de PCR contenía ADN genómico 2 l, SYBR Green PCR Mix (Takara, Japón) 10 l, agua 7,7 l, y los cebadores de 0,15 l (10 mmol /l). Las condiciones de PCR fueron 95 ° C durante 10 min, seguido de 45 ciclos a 59 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 30 s y 95 ° C durante 30 s. Los cebadores para PCR SULF2 metilado (Takara, Japón) fueron los siguientes: delantero 5 'TAAGTGTTTTTTTTATAGCGGC 3', inversa 5'TACCGTAATTTCCGCTATC 3 '. Los cebadores para PCR SULF2 no metilado (Takara, Japón) fueron los siguientes: transmita 5 'GTTTATAAGTGTTTTTTTATAGTGGT3', revertir 5'TACCATAATTTCCACTATCCCT 3 '. Cada lote de reacción incluyó un control positivo de metiltransferasa (M.SssI) tratados con ADN humano genómico (totalmente metilado), un control negativo a partir de muestras de ADN que ha sido confirmado no metilado y otro control negativo sin ADN. Todas las pruebas se realizaron por duplicado. México La creación y validación del modelo de expresión de genes para predecir la sensibilidad irinotecán
Adoptamos el análisis de regresión lineal múltiple para establecer el modelo de expresión de genes optimizado basado en el conjunto de entrenamiento de 100 cánceres gástricos [22]. De acuerdo con los resultados de regresión paso a paso (entrada: α = 0,10, quitar: α = 0,15), el modelo consistió en APTX, Topo1 y BRCA1 es el paso optimizado. Se asignó cada paciente un índice de acuerdo con la combinación lineal del nivel de expresión del ARNm ponderada por el coeficiente de regresión de las muestras de entrenamiento. El índice del modelo de expresión de genes se calculó de la siguiente manera: Índice = 0,488 - 0,020 × nivel de expresión de APTX + 0,015 × nivel de expresión de Topo1 - 0.011 × nivel de expresión de BRCA1. Este modelo fue validado posteriormente en otro conjunto de pruebas independiente de 75 pacientes con cáncer gástrico. En el conjunto de pruebas, los pacientes fueron clasificados de acuerdo a su índice de firma genética y se dividieron en grupos sensibles a la firma y resistente a la firma utilizando el índice mediana como punto de corte. La sensibilidad irinotecán de estos dos grupos fueron probados por HDRA y se compara con los demás.
En viv sobre O validación del modelo de expresión genética para la sensibilidad irinotecán predicción
Establecer modelos de ratones inmunodeficientes con gástrica derivada del paciente xenoinjertos de cáncer, cada tejido quirúrgica del tumor recién retirado se cortó en piezas de 3 x 3 x 3 mm 3, que fueron trasplantados dentro de 30 min a 12 ratones inmunodeficientes atímicos, denominado un "grupo de edad" [23]. En cada cohorte, cuando el tumor creció hasta un tamaño de 50 a 100 mm 3, los ratones con xenoinjertos fueron aleatorizados para el tratamiento con irinotecan 20 mg /kg /w, ip (n = 6) o ningún tratamiento como control ( n = 6). volúmenes de los tumores individuales (V) se calcularon por la fórmula "V = (longitud x anchura x anchura) /2" y en comparación con los valores al inicio del tratamiento para obtener el volumen relativo del tumor. Los ratones se observaron cada otro día para el crecimiento tumoral.
El fin de evaluar la inhibición consistente de irinotecan en los ratones sensibles a la firma, tres semanas después de la primera administración, todos los tumores fueron separados de los primeros ratones generación y se pasaron a la segunda generación ratones. En la segunda generación, ningún fármaco fue administrado. Los ratones se observaron diariamente durante dos semanas más.
El análisis estadístico Francia El Mann-Whitney U-test y el test de Kruskal-Wallis se utilizó para probar la asociación entre los niveles de expresión de ARNm y las características clínicas, y la asociación entre irinotecán sensibilidad y parámetros clínico de los pacientes. método de rango de Spearman se utilizó para evaluar la correlación de los niveles de expresión de ARNm entre diferentes genes, así como la correlación entre los niveles de mRNA y in vitro
sensibilidad irinotecan. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para comparar la sensibilidad irinotecán entre los grupos SULF2M y SULF2U, pacientes irinotecán-sensibles y resistentes a irinotecán y entre los grupos resistentes a la firma sensible a la firma y. (ROC) curvas características de funcionamiento del receptor se generaron para calcular la sensibilidad y especificidad de la predicción basada en genes diferentes y el modelo de expresión de genes en términos de sensibilidad irinotecán. Se utilizó la prueba de la t de Student pareada para evaluar las diferencias entre los tamaños de los tumores de los ratones sensibles a la firma o ratones resistentes a la firma y controles. Un P Hotel < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo (a dos caras). El análisis estadístico se realizó mediante el programa SPSS, versión 16.0.
: Resultados de la Características de los pacientes
Características de todos los pacientes se muestran en la Tabla 1. En los 175 pacientes, la mayoría de los pacientes eran varones (75%), y la histología de cada muestra fue de adenocarcinoma. En 62 (35%) pacientes, el tumor se encuentra en el estómago distal, en 70 (40%) en el estómago proximal, y en 43 (25%) en todo el estómago. Ciento diez (63%) pacientes tenían enfermedad en estadio III. metástasis en ganglios linfáticos estuvo presente en 135 (77%) pacientes.
niveles de expresión de genes
se detectaron en todos los tumores Los niveles de expresión de ARNm de APTX, BRCA1, ERCC1, ISG15 y Topo1, con mediana de nivel de expresión de genes en relación a la limpieza ACTB del 4,32 por APTX (rango de 0,26 a 17,99, 95% intervalo de confianza (IC): 3,78 a 5,19), 7,91 para el BRCA1 (rango de 0,37 a 29,04, IC del 95%: 7,07 a 9,51), 14.03 por ERCC1 (rango de 0,33 a 46,30 , IC del 95%: 13,01-17,07), 5,07 por ISG15 (rango de 0,04 a 34,24; IC del 95%: 3,94 a 6,21) y 7,51 para Topo1 (rango de 1,07 a 37,81; IC del 95%: 6,38 a 9,17) (Figura 1) . Se observó una asociación significativa entre los niveles de mRNA APTX de expresión y el grado histológico (P = 0,03
), y ARNm ISG15 y el sexo (p = 0,017
). Ninguna otra asociación entre las características clínicas y los niveles de mRNA de tumor se encontró (Tabla 2). Sin embargo, se observó una fuerte correlación entre los niveles de expresión de mRNA de los genes BRCA1 y APTX (rho = 0,53, P Hotel < 0,001), APTX y ERCC1 (rho = 0,73, P Hotel < 0,001), BRCA1 y ERCC1 (rho = 0,48, P Hotel < 0,001) en el tumor. Figura niveles de expresión génica de 1 APTX, BRCA1, ERCC1, ISG15 y Topo1 en 175 pacientes analizados por RT-PCR cuantitativa. Los valores de la expresión de genes se calcularon de acuerdo con el método comparativo Ct usando ACTB como control endógeno. La línea azul se puso de pie para la media con IC del 95%.
Tabla 2 La asociación de las expresiones de genes y características patológicas
Característica Nº
Los pacientes de
ARNm APTX
BRCA1 ARNm
ERCC1 mRNA
ISG15 ARNm
Topo1 ARNm


media ± SD
media ± SD
media ± SD
media ± SD
media ± SD
Edad , y
≥ 63
91 (52%)
4,81 ± 3,78 8,61 ± 5,73

15,28 ± 10,01 4,48 ± 3,69

8,03 ± 7,30 Hotel < 63
84 (48%)
4,09 ± 3,76 7,90 ± 5,95

14,75 ± 9,28 5,79 ± 6,90

7,47 ± 5,81 Sexo seguro
Hombre
131 (75%)
4,77 ± 3,33 8,41 ± 5,57

15,74 ± 10,19 5,54 ± 5,62

7,95 ± 7,17
Mujer
44 (25%)
3,58 ± 3,29 7,92 ± 6,67

12,77 ± 7,30 3,53 ± 4,27
*
7,21 ± 4,62
tumor Site
estómago distal
62 (35%) 4,79
± 2,87 8,97 ± 6,52

16,12 ± 10,36 7,05 ± 7,75

8,09 ± 5,93
proximal del estómago
70 (40%)
4.16 ± 3.10 8.33 ±
5,72 13,97 ± 9,09

3,61 ± 2,64 7,40 ± 6,63

Todo el estómago
43 (25%)
4,60 ± 4,44 7,12 ± 4,74

15.31 ± 9.70
4,61 ± 3,43 7,06 ± 7,94

Etapa I

20 (11%)
4.25 ± 4.47 5.91 ± 3.40

13.40 ± 7.07 1.89
± 0,83 5,89 ± 4,03

II
41 (23%)
4,19 ± 3,01 8,58 ± 5,09

14.70 ± 9.56 6.76 ± 7.96

8.91 ± 6.35
III
110 (63%)
4,66 ± 3,38 8,19 ± 5,75

15.56 ± 10.16
4,67 ± 4,01 7,70 ± 7,07

IV página 4 (3%)
4.20 ± 4.61 15.88 ± 17.90

11,01 ± 5,00 7,25 ± 6,33

4,03 ± 1,63
El grado histológico
2 36 (21% ): perfil del 5,05 ± 3,54 * 10,97 ± 7,33

15,78 ± 9,52 4,86 ​​± 4,75

8,08 ± 6,61 página 3
81 (46%)
3,92 ± 3,55
7,81 ± 5,16 14,30 ± 9,64

3,68 ± 2,75 7,18 ± 6,08

Mixta 1-2 página 6 (3%)
3,63 ± 4,51 7,17 ±
2.13
15.17 ± 12.40
8,00 ± 8,94 8,42 ± 6,02

Mixta 2-3
52 (30%)
4,55 ± 2,53 7,06 ± 5,27

15.65 ± 9,96 7,16 ± 7,74

8,44 ± 7,18
metástasis de ganglios linfáticos
Sin
40 (23%)
4,58 ± 3,39 8,70 ± 5,08

14,68 ± 7,31
5,97 ± 8,17 7,48 ± 4,47

Sí
135 (77%)
4.46 ± 3.35 8.16 ± 6.05

15.16 ± 10.33
4,78 ± 4,12
7,87 ± 7,23 * P
Hotel < . 0.05
La relación entre la expresión génica y la quimiosensibilidad al irinotecán
En el conjunto de entrenamiento, la sensibilidad irinotecán fue probado con éxito en todos los tumores, con una tasa de inhibición media de un 43,3% (rango de 2% -89%, IC: 39 % -47%). No se encontró asociación significativa entre la sensibilidad irinotecán y las características clínicas (Tabla 3), incluyendo la edad (p = 0,51
), el sexo (p = 0,77
), sitio del tumor (p = 0,64
), etapa ( P = 0,41
), el grado histológico (p = 0,48
) y metástasis en los ganglios linfáticos (P = 0,47
). Sin embargo, los niveles de mRNA de APTX (rho = -0,48; P Hotel < 0,001), BRCA1 (rho = -0,49, P Hotel < 0,001), ERCC1 (rho = -0,42, P Hotel < 0,001), ISG15 (rho = 0,34, P = 0,001
), y Topo1 (rho = 0,43, P
< 0,001) mostraron una correlación con la sensibilidad irinotecan. Los pacientes fueron clasificados de acuerdo a sus tasas de inhibición de irinotecan y se dividieron en grupos de irinotecán-sensibles y resistentes a irinotecán mediante el uso de la tasa de inhibición mediana como punto de corte [19]. los niveles de expresión génica de APTX (P Hotel < 0,001), BRCA1 (P Hotel < 0,001) y ERCC1 (P Hotel < 0,001) fueron significativamente inferiores en los pacientes sensibles a irinotecán que en los pacientes resistentes a irinotecán , mientras que ISG15 (P
= 0,047) y Topo1 (P
= 0,002) fueron significativamente mayores (Figura 2A-e). curvas ROC se generaron para calcular la sensibilidad y la especificidad de la cada gen en la predicción de la sensibilidad irinotecan (Figura 2G-J). Las áreas bajo la curva ROC (AUC), la sensibilidad y especificidad para la predicción de la sensibilidad irinotecan basado en APTX, BRCA1, los niveles de ERCC1, Isg15 mRNA y Topo1 se enumeran en la Tabla 3 4.Table Asociación entre la sensibilidad y las características clínicas irinotecán
característica
tasa de inhibición irinotecan
tasa de inhibición irinotecan
significa (IC del 95%)
media (IC del 95%)

conjunto de entrenamiento (N = 100)
conjunto de pruebas independientes (N = 75)
Edad, años mediana (rango): perfil ≥ 63
42% ( 36-47%)
44% (31-57%) Hotel < 63
45% (39-51%)
44% (34-54%): perfil del sexo masculino

43% (38-47%)
42% (33- 51%)
Mujer
45% (36-55%)
50% (31-68%)
tumor de estómago distal del sitio

42% (35-49%)
44% (28-60%)
estómago proximal
44% (38-51%): perfil del 47% (35-58%): perfil del estómago entero
43% (35 -51%)
37% (16-59%)
Etapa I

34% (21-47%)
36% (3-70%)
II
49% (40-57%)
50% (31-68%)
III
43% (38-48%)
44% (34-54%)
IV
33%
34% del tour histológico
2 41% (33-49%)
44% (21-68%) página 3
42 % (36-48%)
39% (27-51%)
Mixta 1-2
54%
58%
Mixta 2-3
46% (38- 54%)
49% (35-62%)
metástasis de ganglios linfáticos
Sin
42% (33-51%)
46% (27-65%) Sí

44% (39-48%)
44% (34-53%)
índice Firma Hotel > 0,43
57% (52-63%) **
65% (61-70%) **
≤ 0,43
31% (27-36%)
22% (17 -28%)
P ** Hotel < . 0.001
figura 2 niveles de expresión génica de APTX (P < 0,001), BRCA1 (P < 0,001) y ERCC1 (P < 0,001) fueron significativamente inferiores en los pacientes irinotecán-sensibles que en los pacientes irinotecán-resistentes, mientras ISG15 (P = 0,047) y Topo1 (P = 0,002) fueron significativamente más altos. Los diagramas de caja mostraron los niveles de expresión de ARNm de APTX (A), BRCA1 (B), ERCC1 (C), ISG15 (D) y Topo1 (E) en los grupos de irinotecán-sensibles y resistentes a irinotecán, respectivamente (n = 100). Las líneas dentro de las casillas indican las medianas. Los bigotes de los diagramas de caja: Min Max. Las gráficas de las curvas ROC mostraron las AUC de APTX (F), BRCA1 (G), ERCC1 (H), ISG15 (I) y Topo1 (J) para predecir la sensibilidad irinotecán. Sensibilidad (eje Y) se representó frente a la fracción de falsos positivos. (1 - especificidad) sobre Table 4 La sensibilidad y la especificidad de los niveles de expresión de genes de cinco para la predicción de la sensibilidad irinotecán
Genes
chemotheraputic agentes
Sensibilidad Especificidad

AUC (IC del 95%)
P
APTX
irinotecan
73%
74%
0,758 (0,669 a 0,847) Hotel < 0,001
BRCA1
irinotecan
91%
58%
0,760 (0,673 a 0,846)
< 0,001
ERCC1
irinotecan
64%
79%
0,726 (0,632 a 0,821) Hotel < 0,001
ISG15
irinotecan
59%
73%
0,617 (0,494-0,740) 0,047

Topo1
irinotecan
48%
94%
0,664 (0,563-0,765) 0,002 Francia El
relación entre la metilación y la sensibilidad a la SULF2 irinotecán
en el conjunto de entrenamiento, el estado de metilación de SULF2 se detectó con éxito en todos los pacientes, con treinta y tres (28%) que lleva SULF2M ochenta y cuatro (72%) que lleva SULF2U. No se encontró asociación significativa entre el estado de metilación SULF2 y características clínicas. Las tasas de inhibición irinotecán fueron 49,8% (rango de 2% -89%, 95% IC: 41% -59%) para el grupo SULF2M, y el 40,2% para el grupo SULF2U (rango de 2% -84%, 95% IC: 34% - 46%, P = 0,08
). Francia el establecimiento del modelo de expresión genética y su asociación con la sensibilidad a irinotecán
con base en el nivel de expresión de cinco genes y el estado de metilación SULF2, hemos construido una firma por análisis de regresión lineal múltiple como se menciona en los métodos. El índice de la firma de tres genes varió 0,08 a 0,99 con un valor medio de 0,43 ± 0,16. Hubo una correlación significativa entre el índice y la sensibilidad irinotecan (rho = 0,71, P
< 0,001) (Figura 3A). curva ROC fue generado para calcular la sensibilidad y especificidad de la firma de tres genes en la predicción de la sensibilidad irinotecan (Figura 3B). El AUC fue (IC del 95%: 0,755 a 0,901, P Hotel < 0,001) 0,828. Con el valor umbral de 0,43, la sensibilidad y especificidad para la predicción de la sensibilidad irinotecan basado en la firma de tres genes alcanzaron 73% y 86%, respectivamente. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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