PLOS ONE: La electroacupuntura en ST36 aminora el vaciado gástrico y rescata Redes de células intersticiales de Cajal en el estómago de Diabéticos Rats

Extracto

El agotamiento de las células intersticiales de Cajal (ICC) está certificada en el estómago de los pacientes diabéticos . A pesar de la electroacupuntura (EA) en ST36 es una terapia eficaz para regular la motilidad gástrica, los mecanismos de EA en ST36 en el vaciado y redes de CPI gástrica aún no se han dilucidado. Los objetivos de este estudio fueron investigar los efectos de la EA en el vaciado gástrico y en las alteraciones de las redes de la CPI. Las ratas se distribuyeron aleatoriamente en el control, las ratas diabéticas (DM), ratas diabéticas con EA simulado (DM + SEA), ratas diabéticas con EA baja frecuencia (DM + LEA) y ratas diabéticas con grupos de EA de alta frecuencia (DM + HEA). La expresión de c-kit en cada capa de la pared gástrica se evaluó mediante Western Blot. La proliferación de ICC se identificó mediante inmunomarcaje de c-kit y Ki67 como el apoptosis de ICC se examinó mediante la tinción de TUNEL. Los resultados fueron como sigue: (1) El vaciado gástrico se retrasó gravemente en el grupo DM, pero se aceleró en el grupo de LEA y HEA, especialmente en el grupo de la LEA. (2) La expresión de c-kit en cada capa se redujo aparentemente en el grupo DM, pero también regula-up en el grupo de LEA y HEA. se observaron (3) Abundante proliferaron CPI (c-kit + /Ki67 +) formando redes tupidas con c-kit + células en el grupo de LEA y HEA, mientras que las células apoptóticas (c-kit + /TUNEL +) fueron casi capturado en el grupo de LEA y HEA . Colectivamente, EA baja y alta frecuencia en ST36 rescatar las redes dañadas de ICC mediante la inhibición de la apoptosis y la mejora de la proliferación en el estómago de las ratas diabéticas, resultando en una mejora de vaciado gástrico

Visto:. Chen Y, Xu JJ , Liu S, Hou XH (2013) electroacupuntura en ST36 aminora el vaciado gástrico y rescata a redes de células intersticiales de Cajal en el estómago de ratas diabéticas. PLoS ONE 8 (12): e83904. doi: 10.1371 /journal.pone.0083904

Editor: Yvette Tache, Universidad de California, Los Angeles, Estados Unidos de América

Recibido: 9 Agosto, 2013; Aceptado: 8 de noviembre de 2013; Publicado: 31 de diciembre 2013

Derechos de Autor © 2013 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. El trabajo fue parcialmente apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30670775, Nº 81270458). No se recibió financiación externa adicional para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Tipos de trastornos de la motilidad gastrointestinal que van desde la dispepsia funcional para la gastroparesia afectar gravemente la calidad de vida de los pacientes con décadas de la diabetes mellitus [1]. La gastroparesia, caracterizado por retraso del vaciamiento gástrico, se produce hasta un 30% de los individuos con diabetes tipo 1 [2]. A pesar de varias intervenciones terapéuticas que incluyen el tratamiento farmacéutico y algunos tratamientos no farmacológicos han sido juzgados, los efectos curativos para la gastroparesia siguen siendo insatisfactorios.

La acupuntura se ha utilizado empíricamente para tratar trastornos gastrointestinales en los países orientales durante miles de años. Electroacupuntura (EA), que es una modificación de la acupuntura tradicional, es más adecuado para entornos de investigación y clínicos básicos para su reproducibilidad. Zusanli gratis (ST36) es un punto de acupuntura común que se utiliza con frecuencia para el tratamiento de enfermedades gastrointestinales. En los últimos años, los efectos de la EA en ST36 en la motilidad gástrica se han evaluado en numerosos estudios. Para los animales, EA en ST36 aumentó significativamente la motilidad gástrica en ratas conscientes y mejoró retrasa el vaciado gástrico en ratas diabéticas STZ inducida [3], [4]. Por otra parte, en los seres humanos, EA en ST36 acelera el vaciado gástrico y alivia los síntomas dispépticos en pacientes con dispepsia funcional y de los individuos diabéticos con gastroparesia [5], [6]. Aunque en estos estudios sólo se haya adoptado EA baja frecuencia, también se informó de EA de alta frecuencia para promover la motilidad esofágica y colon distal en los animales [7], [8]. Por lo tanto, los efectos de las diferentes frecuencias de EA en la motilidad gástrica y los mecanismos que subyacen a llamar la atención de las personas.
Significancia

Las células intersticiales de Cajal (ICC), bien establecidos como los marcapasos que generan y propagan las ondas lentas, han ganado en la regulación gastrointestinal motilidad durante varias décadas [9]. Tres subtipos de CPI CPI incluyendo intramuscular (ICC-IM), CPI mientérico (ICC-MI) y el ICC submucosa (ICC-SM) forman redes intactos en la pared gástrica [10]. Redes de CPI no son estáticas, incluso en condiciones fisiológicas; la apoptosis y la transdiferenciación llevar a la pérdida de la CPI, mientras ICC también puede ser restaurada por la proliferación, la reposición de las células madre y el aumento de la supervivencia [11], [12]. Los numerosos estudios han documentado que las pérdidas y daños causados ​​CPI de la motilidad gastrointestinal desordenada en modelos animales y en pacientes con diabetes [13] - [15]. Recientemente, otros estudios informaron que EA facilitó el aumento de la CPI del colon en ratas y ratones estreñimiento de tránsito lento después enteroenterostomía [16], [17]. Nuestro estudio reciente demostró también que EA en ST36 podría restaurar ICC alterada en el colon de ratas diabéticas [18]. Mientras tanto, le preocupa que EA promovió la proliferación e inhibió la apoptosis de las células cerebrales en el hipocampo [19], [20]. Sin embargo, hay un espacio en blanco sobre los efectos del EA en ST36 en la CPI en la gastroparesia diabética y el mecanismo de si la proliferación y la apoptosis de CPI están involucrados

Por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron los siguientes:. 1) evaluar los efectos de diferentes EA frecuencia en el vaciado gástrico; 2) investigar los efectos del EA en ST36 en las redes de la CPI en ratas diabéticas; 3) certificar si la apoptosis y la proliferación de CPI estaban involucrados.

Materiales y Métodos

Ética declaración

Las ratas recibieron cuidado humano y este estudio se llevó a cabo en estricto cumplimiento con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud, con todas las operaciones aprobadas por las directrices éticas del Comité para el Cuidado y uso de Animales de la universidad médica de Tongji, Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología.

Animales

ratas Sprague-Dawley macho pesan 250-300 g fueron seleccionados en el presente estudio. Las ratas se obtuvieron del experimento Animal Center de Tongji Medical College (Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología, Wuhan, China) y se mantuvieron en condiciones de laboratorio normales (22 ° C, 12/12 h luz-oscuridad ciclo) con acceso libre a comida y agua esteralizada. Después de una semana de alimentación de adaptación, los animales fueron aprobadas oficialmente en nuestros experimentos.

diabética modelo

Después de una noche de ayuno, pero el acceso libre al agua, los modelos se establecieron con una sola inyección intraperitoneal de estreptozotocina en ratas (STZ, 60 mg /kg, es decir, 1 ml /100 g de peso corporal; Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA), recién disueltos en 20 mM solución tampón de citrato (pH 4,5; Sigma, St Louis, MO, USA) . El grupo de control se inyectó con un volumen igual de tampón de citrato. Todas las ratas fueron alojados en las mismas condiciones, con la privación de agua durante 4 horas, pero ad libitum
alimentación. Una semana después de la inyección, la diabetes se confirmó en diferente tiempo por la medición de glucosa en una gota de sangre entera obtenida por punción de la punta del recipiente de cola. Un nivel de glucosa en sangre de ≥16.7 mmol /L fue tomada como un estándar para modelo de éxito. La glucosa en sangre se proyectó puntualmente antes de la inyección y el 1, 4 y 8 semanas después de la inyección. Por otra parte, la pérdida de peso, polidipsia y poliuria produjeron nuevos indicadores a la evidencia de la inducción exitosa de rata diabética.

Los protocolos experimentales

Las ratas se distribuyeron aleatoriamente en cinco grupos (10 ratas cada grupo), incluyendo el control , grupo de diabéticos (DM), las ratas diabéticas con tratamiento simulado grupo AE (MAR, solamente acupuntura sin corriente eléctrica, 30 min /d), ratas diabéticas con el grupo de baja frecuencia EA (LEA, 10 Hz, 1-3 mA, 30 min /día ) y ratas diabéticas con el grupo de alta frecuencia EA (HEA, 100 Hz, 1-3 mA, 30 min /d). EA se llevó a cabo en ST36 punto de acupuntura con un estimulador eléctrico (G6805-2A; Shanghai Huayi instrumento médico fábrica, Shanghai, China) cada día durante 8 semanas. La corriente eléctrica se estableció según ligeramente temblorosa de las extremidades inferiores. Para lograr el propósito de la eliminación de la influencia del estrés, los animales se les permite moverse libremente en su propia carcasa durante el procedimiento de EA.

Después de la intervención sucesiva de 8 semanas, las ratas de cada grupo se ensayaron para determinar el vaciado gástrico. Luego se sacrificaron, y fueron cuidadosamente obtuvieron muestras de antro. Cada muestra fue dividida en varios pedazos, uno relativamente pequeño se almacenó a -80 ° C para el análisis Western Blot después de las capas recién extraído y una pieza se colocó en el 2,5% de glutaraldehído para microscopía electrónica, y el resto se fijaron en fijador de Zamboni (2 % de paraformaldehído y solución de ácido pícrico saturado 1,5% en solución 0,1 M de tampón fosfato (PBS, pH 7,4) para la tinción de inmunofluorescencia.

Medición de vaciado gástrico

el vaciado gástrico se realizó mediante una modificación tal como se describe anteriormente [21]. La comida de prueba que contiene rojo de fenol (0,5 mg /ml) como indicador y carboximetilcelulosa (15 mg /ml) fue constantemente agitó y después se mantiene a 37 ° C. Después, se recibieron las ratas alimento privados durante la noche 2 ml de fenol comida roja administra a través de una aguja de sonda. Treinta minutos más tarde, los animales fueron sacrificados rápidamente por dislocación cervical. todo el estómago se retiró cuidadosamente después de la ligadura en el cardias y píloro, y luego el estómago fue abierto y su contenido se vierte en un tubo de ensayo y se lavó con 40 ml de agua destilada. Al final del experimento, se añadió solución de NaOH (20 ml, 1 M) a cada tubo para desarrollar la máxima intensidad de color. La absorbancia de la muestra se leyó a 560 nm con un espectrofotómetro (HITACHI, U-2900) fue para reflejar la cantidad de rojo de fenol que permanece en el estómago. La velocidad de vaciado gástrico se calculó según la siguiente fórmula: El vaciado gástrico (%) = 100 x (1 - X /Y), X representa absorbancia de rojo de fenol recogido desde el estómago de los animales sacrificados 30 minutos después de la comida de prueba. Y representa la absorbancia de rojo fenol recuperado del estómago del animal de control sacrificado inmediatamente después de la administración de la comida de prueba.

Western Blot

Las muestras frescas de antro gástrico fueron puestas a un plato Sylgard y cada capa se separó cuidadosamente por disección aguda después de la eliminación de la mucosa. Con la ayuda de unas pinzas de punta fina y tijeras de microcirugía bajo un microscopio de disección, se obtuvieron capas de CPI-SM, CPI-IM e ICC-MI. Todas las manipulaciones se realizaron en el hielo para evitar la pérdida de proteínas. Y entonces muestras de CPI-SM, CPI-IM e ICC-MI fueron almacenadas a -80 ° C.

Las muestras frescas congeladas fueron aplastados en la suspensión de células y se homogeneizaron en tampón RIPA (Upstate, Temecula, CA , EE.UU.) con el inhibidor de la proteasa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.). La mezcla se centrifugó a 12.000 g durante 10 min a 4 ° C, y los sobrenadantes se recogieron como la proteína total. La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford. Posteriormente, equivalentes de 50 mg de proteínas extraídas se separaron gradualmente por 10% de sodio electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato (SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). Seguido bloqueo de puntos de unión no específicos con leche en polvo desnatada al 5% en solución salina tamponada con Tris que contenía 0,1% de Tween 20 (TBST) a temperatura ambiente durante 1 h, estas membranas se incubaron con el anticuerpo primario a anti-c-kit (1:200, Santa Cruz Biotechnology, Inc) durante la noche a 4 ° C junto con conejo anti-ratón de actina (1:400, Santa Cruz Biotechnology, Inc) sirvió como control interno. Después de tres lavados con TBST, las membranas se incubaron con el anticuerpo secundario unido a HRP (conejo unido a HRP anti-cabra y la cabra unido a HRP anti-ratón, 1:5000) durante 1 h a temperatura ambiente. Seguido con tres lavados de TBST, las bandas se visualizaron por reacción química con el agente de aumento de quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y el blot se sometió a autorradiografía. análisis de densitometría se realizó mediante un software Cantidad (Departamento de Servicios Técnicos de Bio-Rad, Versión 4.6.2).

Los estudios de inmunofluorescencia

Para las preparaciones de todo el montaje de tinción, se abrió el estómago y aclararse varias veces con PBS. antro gástrico fue fijado a un plato Sylgard y se estiró al 150% de su tamaño original, y luego fijó con fijador de Zamboni durante 24 horas a temperatura ambiente. Los tejidos fijados se lavaron con PBS y luego la mucosa se separó por disección aguda. ICC-SM localizar en la superficie de la capa submucosa músculo circular, CPI-IM entremezclándose entre las células del músculo liso y ICC-MI, junto con los nervios del plexo mientérico se prepararon cuidadosamente con punta fina pinzas y tijeras de microcirugía bajo un microscopio de disección.

Los procedimientos de inmunotinción para la detección de redes y la proliferación de ICC se han descrito anteriormente [22]. Ki67, una proteína nuclear expresado durante todas las fases activas de la celda y desapareció en la célula en reposo, se ha aplicado para detectar la proliferativa ICC [23]. Después de lavar seis veces con PBS durante 1 h, los tejidos se incubaron con suero bovino normal 5% en PBS que contenía 0,3% de Triton X-100 (PBST) durante 1 h a temperatura ambiente y después se incubaron con el anticuerpo primario c-kit (1:100; Santa Cruz, CA, EE.UU.) y Ki67 (1:100; Abcam, Cambridge, Reino Unido) durante la noche a 4 ° C. Después de enjuagar en PBST durante 30 min, se detectó la inmunoreactividad con Alexa Fluor 594 conjugado con anticuerpo secundario (IgG de burro anti-cabra, 1:100) y Alexa Fluor 488 conjugado anticuerpo secundario (de burro anti-IgG rabit, 1:100) a 37 ° C durante 1 h, seguido de lavado en PBS tres veces durante 30 min, y se incubaron con DAPI (0,1 mg /ml; Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) durante 30 min como una tinción de contraste nuclear. Se enjuaga dos veces en PBS, los tejidos se desdobla en una diapositiva. Un microscopio de barrido láser confocal (Nikon, Japón) se utilizó para examinar los tejidos inmunomarcadas. Con el fin de incluir a todos los niveles de las células y los procesos de tinción positiva, el apilamiento Z óptima de imágenes confocal se fijó en 5 micras intervalos.

La apoptosis de las ICC se detectaron con la señal de TUNEL, un kit de detección de apoptosis (Roche, Alemania). preparaciones de todo el montaje se incubaron con el anticuerpo primario c-kit (1:100; Santa Cruz, CA, EE.UU.) durante la noche a 4 ° C y anticuerpo secundario (Alexa Fluor 594 burro IgG anti-cabra, 1:100) a 37 ° C por 30 min. Bajo una circunstancia humidificado y oscuro, los tejidos se incubaron con tampón de reacción TUNEL (solución de etiquetado: solución de enzima = 09:01) a 37 ° C durante 1 h. Después se lavaron tres veces durante 30 min para eliminar sin conectar con fluoresceína dUTP y se incubaron con DAPI como una tinción de contraste nuclear, se observaron las muestras bajo un microscopio de escaneo láser confocal.

Microscopía electrónica

Después de la mucosa eliminado, las muestras de antro se sumergieron en una solución fijadora de glutaraldehído al 2,5% a 4 ° C durante 2 h. Luego, se enjuagaron con 0,1 M PBS dos veces por 20 min, después de la fijada en 1% OSO _{4 (pH 7,4) durante 1 h, se deshidrataron con alcohol graduado, aclarado en óxido de propileno y se incluyeron en Epon usando moldes planos. Los cortes ultrafinos se obtuvieron con un ultramicrotomo (Leica ULTRACUTU, Alemania), y se tiñeron con citrato de plomo durante 10 minutos antes de ver con un microscopio electrónico de transmisión (Tecnai G ^{212, FEI, Países Bajos).}}

El análisis estadístico

Para el análisis de la tinción de inmunofluorescencia, antro gástrico de cada animal experimental se tomaron muestras en el mismo lugar del estómago. ICC fue reconocido por inmunoreactividad c-kit y la presencia de procesos celulares abundantes. La proliferación y apoptosis CPI fueron identificados por inmunoreactividad c-kit y Ki67 /TUNEL manchadas núcleo que encierra con estructuras de membrana positivo c-kit. Se tomaron diez campos al azar (200 × magnificación, 0,2607 mm ^{2) por la preparación de todo el montaje de fotografías de células positivas para c-kit, c-kit + /Ki67 + y células marcadas c-kit + /+ TUNEL. También se emplearon Estas fotografías para evaluar el espesor de las capas en cada pila con la ayuda de núcleos DAPI etiquetados como un marcador de los límites superior e inferior de las capas. El número de células positivas para c-kit, c-kit /Ki67 y c-kit /TUNEL células doblemente marcadas se contaron con imagen-ProPlus 5.0 (Media Cybernetics). Todos los datos se expresan como media ± SEM. Al menos diez visiones fueron tomadas en cada animal. El análisis de la varianza (ANOVA) y la prueba t de Student se utilizó para comparar las diferencias entre los diferentes grupos. valor de p inferior a 0,05 se consideró como diferencia estadísticamente significativa.}

Resultados

El peso corporal y el nivel de glucosa en la sangre

Después de 8 semanas, la muerte por accidente se produjo en el grupo de DM (dos ratas) y en el grupo MAR (una rata). Las ratas fueron seleccionados para el mismo peso corporal de línea de base entre los grupos (Tabla 1). Al final de 1, 4 y 8 semanas, el peso corporal del grupo DM significativamente se disminuyó en comparación con el control ( P
= 0,009, 0,000 y 0,000). No hubo diferencias significativas entre el grupo MAR y DM ( P Hotel > 0,05). Sin embargo, en contraste con el grupo DM, el peso corporal fue elevado en el grupo de LEA a las 8 semanas ( P
< 0,001) y el grupo HEA a las 4 y 8 semanas ( P =
0.003, P
. < 0,001 por separado)

Como se muestra en la Tabla 2, no se observaron diferencias en el nivel de glucosa en la sangre la línea de base entre los grupos. Los modelos diabéticos se establecieron con éxito con el alto nivel de glucosa en sangre en el grupo DM en comparación con el control al final de 1, 4 y 8 semanas (todo el P Hotel < 0,001). Mientras tanto, los niveles de glucosa en sangre en el mar, los grupos de LEA y se HEA no cambiaron significativamente en comparación con el grupo de DM (todo el P Hotel > 0,05).

Efectos de la EA en el vaciado gástrico

la figura 1 muestra los efectos de la EA en ST36 en el vaciado gástrico en diferentes grupos. El vaciado gástrico del grupo DM se retrasó de manera espectacular en contraste con el control ( P
= 0,012). En comparación con el grupo DM, SEA no tuvo ningún efecto significativo sobre el vaciado gástrico ( P
= 0,338), pero LEA y HEA marcadamente aceleró el retraso del vaciamiento gástrico de 43,96 ± 5,02% a 69,72 ± 3,02% y 59,06 ± 3,70% ( P Hotel < 0,001 y P = 0,013
, respectivamente). Comparación entre el grupo LEA y HEA, se alcanzó significación estadística ( P
= 0,04), lo que supone que el efecto de la LEA, obviamente, superior a la de la HEA.

Efectos de la EA en la expresión de c -Kit

a partir de la figura 2, se evaluó la expresión de c-kit en cada capa de la pared gástrica. En ICC-IM, c-kit en el grupo DM obviamente fue disminuido en comparación con el control (0,47 ± 0,04 vs 0,69 ± 0,05, P
= 0,001). Por el contrario, HEA LEA y mejoran dramáticamente la expresión de c-kit en comparación con el grupo de marcos alemanes (0,65 ± 0,04 vs 0,47 ± 0,04, P = 0,004
; 0,66 ± 0,03 vs 0,47 ± 0,04, P
= 0,002, respectivamente). En ICC-MI, la expresión de c-kit se redujo significativamente en el grupo de DM en contraste con el control (0,57 ± 0,04 vs 0,83 ± 0,05, P
< 0,001). Pero diferencia significativa se consigue tanto en el grupo de LEA y HEA en comparación con el grupo de DM (0,78 ± 0,05 vs 0,57 ± 0,04, P
= 0,002; 0,76 ± 0,04 & 0,57 ± 0,04, P
= 0,004, respectivamente). En ICC-SM, el c-kit del grupo de DM fue disminuida, evidentemente, sobre la base del nivel normal (0,56 ± 0,03 vs 0,77 ± 0,04, P
= 0,001). En consonancia, la LEA y HEA, obviamente, aumentaron la expresión de c-kit en comparación con el grupo de DM ( P = 0,003
y P
= 0,007). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre el grupo EAE y MS en CPI-IM, el ICC-MI-SM e ICC ( P = 0,597
, P = 0,853
y P
= 0,172).

Efectos de la EA en las redes ICC

Las alternancias de redes ICC en especial morfología de la CPI y de la densidad fueron exhibidos en la figura 3. No hubo diferencia significativa del espesor de las capas entre los grupos. Asociado con células de músculo liso, c-kit inmunoreactividad para ICC-IM se observó en las capas musculares, mostrando que ICC-IM tenía dos procesos polares de formación de una red celular en el grupo de control. En el grupo DM, los largos procesos de ICC-IM fue afectada aparentemente y la densidad de células positivas c-kit se redujo a aproximadamente 50% del control normal ( P
< 0,001). En comparación con el grupo de DM, ningún cambio significativo se observó en el grupo MAR. Sin embargo, una red celular casi intacto se visualizó en el grupo de LEA y HEA y la densidad de c-kit positivo ICC-IM casi restauró el nivel normal (ambos P
< 0,001, en comparación con el grupo de DM ).

ICC-MI bobinado alrededor del plexo mientérico fueron ubicadas entre las capas musculares lisas longitudinales y circulares. ICC-MI multipolar con numerosas ramas que forman una red celular intacta se mostró claramente en el grupo de control. En el grupo de DM, las células c-kit + aparecieron con cuerpos celulares delgados y procesos fracturadas, y la densidad de ICC-MI se redujo obviamente ( P Hotel < 0,001). En el grupo MAR, la densidad de ICC-MI no fueron significativamente alterada en comparación con el grupo de DM ( P = 0,762
). Sin embargo, una red celular casi intacta existía alrededor del plexo mientérico y el ICC-MI densidad recuperado parcialmente en el grupo de LEA y HEA (ambos P Hotel < 0,001, en comparación con el grupo DM)
<. h3> Efectos de EA sobre la apoptosis de CPI

La apoptosis de las ICC fue detectado por la señal de TUNEL para determinar si la apoptosis estaba involucrado en la deficiencia de la CPI en la diabetes (Figura 4). A partir de preparaciones de todo el montaje del mando, unos núcleos de CPI se tiñeron por el método TUNEL en la capa muscular, capa mientérico y la capa submucosa. Un montón de c-kit + /TUNEL + ICC-IM, el ICC-MI e ICC-SM se observaron en el grupo DM (18,48 ± 1,88 mm ^{-2, 26.51 ± 1.87 mm -2 y 12.03 ± 1.27 mm -2, respectivamente). La redes celulares de c-kit + estaban incompletos y la CPI apoptótica presentan como procesos más cortos con menos ramas. Un gran número de células c-kit + /+ TUNEL también se inundan en todas las capas del grupo MAR. En virtud de la aplicación de la LEA y HEA, apoptosis de células kit + apenas se encuentran en CPI-IM (1,79 ± 0,33 mm -2 y 2,05 ± 0,30 mm -2), ICC-MI (2,24 ± 0,40 mm -2 y 2,48 ± 0,40 mm -2) e ICC-SM (1,09 ± 0,25 mm -2 y 1,39 ± 0,20 mm -2). Las redes celulares reveladas por inmunotinción c-kit mostraron una alta densidad y espesor de los procesos celulares en el grupo de LEA y HEA.}

Efectos de la EA sobre la proliferación de
ICC

Teniendo en cuenta el aumento del número de ICC en el LEA y el grupo de HEA, se detectó CPI Ki67 positivas para revelar la proliferación de la CPI en las tres capas (Fig.5). En el grupo control, una serie de c-kit /Ki67 se observaron células doblemente marcadas en CPI-IM (8,82 ± 1,02 mm ^{-2), ICC-MI (10,64 ± 0,92 mm -2) y el ICC -SM (4,67 ± 0,96 mm -2). El número de CPI con ramas fracturadas fue notablemente reducida y las redes eran muy escaso con pocas células en proliferación, tanto en el grupo de DM y SEA. Sin embargo, en el grupo de LEA y HEA, c-kit /Ki67 células doblemente marcadas en CPI-IM se caracterizaron por organismos estrechamente adyacentes de células y procesos relativamente bipolares y la densidad media llegado a 18,37 ± 1,60 mm -2 y 15,27 ± 1,81 mm 2 (ambos P Hotel < 0,001). Del mismo modo, abundante c-kit + /Ki67 + ICC-MI en el grupo de LEA y HEA (ambos P Hotel < 0,001) la formación de redes intactas con c-kit + células realizan un cuerpo de células redondas y procesos largos y delgados. En ICC-SM, acompañado por una red intacta de ICC, la densidad de la proliferación de células en el grupo de LEA y HEA eran relativamente más alta en contraste con el grupo DM ( P
= 0,016 y P
= 0,003).}

Efectos de la EA en las alteraciones ultraestructurales de la CPI

características ultraestructurales típicas de ICC fueron revelados por microscopía electrónica de transmisión (figura 6). En el grupo control, el ICC-IM y orgánulos celulares ricos de bien desarrollados MIS ICC-extendidos procesos largos que contienen mitocondrias y retículo endoplasmático rugoso y liso. Polimórfica ICC-SM situado en la superficie de la submucosa de la capa muscular circular mostró mayor citoplasma denso en electrones, numerosas mitocondrias y el retículo endoplásmico. En el grupo DM, una disminución dramática en el número de ICC con características ultraestructurales dañados se examinó por microscopía electrónica. Estas células con mitocondrias hinchadas, cristaed perturbado y cromatina condensada mostraron membrana incompleta y se acortan los procesos. Estos cambios también se observaron en el grupo MAR. En el grupo de LEA y HEA, el número de CPI fue significativa aumentado y conectado estrechamente con las fibras nerviosas y células musculares lisas que forman la estructura sináptica y la brecha de los cruces. cresta de la mitocondria clara, ordenada retículo endoplasmático rugoso y distribuido ribosomal partículas se consideraron características clásicas de la CPI-IM, IM-MI e ICC-SM.

Discusión

En el presente estudio, se encontró que tanto EA baja y alta frecuencia en ST36 suprime la apoptosis de las ICC y se activa la proliferación de la CPI en el estómago de ratas diabéticas STZ inducido. Como resultado, el rescate de las redes ICC se asoció con un efecto preventivo sobre el vaciamiento gástrico retardado.

Como un procedimiento eficaz y con menos efectos secundarios, EA combinada con la acupuntura y la estimulación de corriente eléctrica en lugar de manipulaciones manuales es aceptado gradualmente por Países occidentales. ST36 es uno de los puntos más frecuentemente para tratar trastornos gastrointestinales, con indicaciones que incluyen: dolor epigástrico, náuseas, vómitos, falta de apetito y distensión abdominal. Al mismo tiempo, nuestro estudio anterior ha indicado EA en ST36 podría aumentar el movimiento de propulsión del colon, pero no se observa en el grupo con EA en los no-puntos de acupuntura. retraso del vaciamiento gástrico es un carácter común de los pacientes diabéticos con gastroparesia y también uno de los principales factores que contribuyen a los síntomas de la gastroparesia. Durante las últimas décadas, los experimentos en ratas conscientes mostraron que EA baja frecuencia (10 Hz) se aceleró significativamente el vaciado gástrico [3], [24], [25]. Además, 100 EA Hz era eficaz para provocar la liberación de dinorfina y la serotonina para inducir analgesia [26]. Aunque también se informó de EA de alta frecuencia (100 Hz) para promover la motilidad esofágica y colon distal en los animales [7], [8], los efectos de 100 Hz EA sobre la motilidad gástrica han investigado apenas. Por lo tanto, se seleccionaron los parámetros (10 y 100 Hz) de EA de acuerdo con los experimentos preliminares que indicaban efecto estimulante de la motilidad gastrointestinal. Nuestros resultados demostraron que tanto EA de baja frecuencia (10 Hz) y EA de alta frecuencia (100 Hz) en ST36 mejoraron significativamente retraso del vaciamiento gástrico en ratas diabéticas, y el resultado también revelaron que el efecto de la baja EA frecuencia fue más dramático que el de alta EA frecuencia.

Numerosos estudios han demostrado que la CPI desempeña un papel importante en la regulación del peristaltismo gástrico, un importante determinante de vaciado gástrico [27], [28]. Como existe la CPI en diferentes capas de antro gástrico en forma de redes in vivo
, se valiosamente a tener en cuenta las alteraciones de las redes de la CPI. Reducción del número y morfológicas cambios ICC-MI y CPI-IM en el estómago de ratones diabéticos se demostró en un estudio anterior [14]. Del mismo modo, se observó una marcada pérdida de ICC-IM y ICC-SM en antro de ratas diabéticas inducidas por STZ, pero ICC-MI no se vio afectada de manera significativa a excepción de una pérdida de conexiones con las estructuras nerviosas [15]. Estas diferencias de los resultados de estos dos estudios fueron probablemente asociados con las especies animales. A partir de un estudio de 28 pacientes con gastroparesia, se encontró un número reducido de CPI en el plexo mientérico de biopsias antrales de espesor completo [29]. Nuestros resultados mostraron que el CPI-IM, el ICC-MI e ICC-SM en el antro de ratas diabéticas STZ inducido se redujeron drásticamente basado en la técnica de Western Blot y la tinción de inmunofluorescencia, y aún más la estructura dañada de la CPI se mostró por microscopía electrónica de transmisión . Afortunadamente, se ha informado que baja frecuencia EA mejora la expresión de la CPI en el colon de ratas lentos estreñimiento de tránsito [17]. Además, nuestro estudio previo ha sugerido que tanto de baja como de alta frecuencia EA restaura la expresión de la CPI en el colon de ratas diabéticas [18]. Sin embargo, en estos estudios, que investigan la alteración de la CCI en su conjunto y los efectos de diferentes frecuencias EA sobre la CPI en el estómago no se han dilucidado. Por lo tanto, los efectos de las diferentes frecuencias de EA en tres subtipos de la CPI en el estómago, incluyendo ICC-IM, el ICC-MI e ICC-SM eran los objetivos del presente estudio. Nuestros resultados mostraron que la expresión de la CPI en las tres capas se conspicuamente rescatado por baja y alta frecuencia de EA, lo que sugiere que EA baja y alta frecuencia renovado redes de CPI-IM, el ICC-MI e ICC-SM y además podría contribuir a un recuperado el vaciado gástrico.

es de destacar que el balance de las redes ICC está determinada principalmente por la apoptosis y la proliferación de la CPI [11], [12]. Por lo tanto, el posible mecanismo en la motilidad gástrica y los efectos sobre las redes de ICC de EA en ST36 se exploraron a través de la detección de las alteraciones de la proliferación y la apoptosis de ICC. Recientemente, se informó de la muerte celular por apoptosis al ser un proceso continuo de las redes de la CPI y el nivel de apoptosis en colon sano indica que estas células deben regenerarse continuamente para mantener intactas las redes [12]. Además, los resultados de los conejillos de Indias adultos indican que la isquemia y lesión por reperfusión intestinal condujo a la reducción en el número de CPI a través de la apoptosis que puede contribuir a trastornos de motilidad gastrointestinal [30]. Por otra parte, un informe reciente mostró que el tratamiento con EA redujo el porcentaje de apoptosis de las células de la sustancia negra en las ratas con Parkinson [31]. El presente estudio ha articulado claramente que la CPI apoptótica detectado por métodos TUNEL fueron las inundaciones en las redes de la CCI de estómago de rata diabética y especuló que el agotamiento de las redes ICC también puede dar lugar a trastornos de la motilidad gástrica. Pero a través de la intervención de estimulación EA baja y alta frecuencia, núcleo TUNEL + eran difícilmente para encontrar, lo que sugiere la apoptosis de las ICC se redujo a un nivel bajo de forma normal.

La proliferación es también otro regulador principal de mantener las redes de CPI. Los resultados previos han demostrado que la proliferación estuvo involucrado en la recuperación de la CPI, una vez que se perdió en los animales adultos [32], [33].

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