PLoS ONE: Elektroakupunktur bei ST36 Verbessert die Magenentleerung und Rettungen Networks von interstitiellen Zellen von Cajal im Magen von diabetischen Ratten

Abstrakt

Depletion der interstitiellen Cajal-Zellen (ICC) im Magen von diabetischen Patienten zertifiziert. Obwohl bei ST36 electroacupuncture (EA) eine wirksame Therapie ist die Motilität des Magens zu regulieren, so bleiben die Mechanismen von EA bei ST36 auf die Magenentleerung und Netzwerke von ICC aufgeklärt werden. Die Ziele dieser Studie waren die Auswirkungen von EA auf die Magenentleerung und auf die Veränderungen von ICC-Netze zu untersuchen. Die Ratten wurden in die Kontroll randomisierten, diabetischen Ratten (DM), diabetische Ratten mit Schein EA (DM + SEA), diabetische Ratten mit niedriger Frequenz EA (DM + LEA) und diabetischen Ratten mit hoher Frequenz EA Gruppen (DM + HEA). Die Expression von c-kit in jeder Schicht der Magenwand wurde durch Western-Blotting untersucht. Die Verbreitung von ICC wurde durch Immunmarkierung von c-kit und Ki67 als die Apoptose von ICC identifiziert durch TUNEL-Färbung untersucht. Die Ergebnisse waren wie folgt: (1) Die Magenentleerung stark in der DM-Gruppe verzögert wurde, aber in der LEA und HEA-Gruppe, vor allem in der LEA-Gruppe beschleunigt. (2) Die Expression von c-kit in jeder Schicht wurde offenbar in der DM-Gruppe reduziert, sondern auch in der LEA und HEA Gruppe hochreguliert. (3) Reichlich wucherte ICC (c-kit + /Ki67 +) bilden buschige Netzwerke mit c-kit + Zellen wurden in der LEA und HEA-Gruppe beobachtet, während die apoptotischen Zellen (c-kit + /TUNEL +) waren kaum in der LEA und HEA Gruppe gefangen . Zusammengefasst, Nieder- und Hochfrequenz EA bei ST36 Rettung der beschädigten Netze von ICC durch die Apoptose hemmen und die Proliferation in den Magen von diabetischen Ratten zu verbessern, in einer verbesserten Magenentleerung resultierenden

Citation:. Chen Y, Xu JJ Liu S, Hou XH (2013) Elektroakupunktur bei ST36 Verbessert die Magenentleerung und Rettungen Networks von interstitiellen Zellen von Cajal im Magen von diabetischen Ratten. PLoS ONE 8 (12): e83904. doi: 10.1371 /journal.pone.0083904

Editor: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 9. August 2013; Akzeptiert: 8. November 2013 beginnen; Veröffentlicht am: 31. Dezember 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Die Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (Nr 30670775, Nr 81270458) unterstützt. Keine zusätzliche externe Finanzierung erhalten für diese Studie. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Arten von Magen-Darm-Motilität Störungen im Bereich von funktionellen Dyspepsie gastroparesis stark die Lebensqualität von Patienten mit Dekaden des Diabetes mellitus beeinflussen [1]. Gastroparesis, durch eine verzögerte Magenentleerung gekennzeichnet, tritt bei bis zu 30% der Personen mit Typ-1-Diabetes [2]. Obwohl verschiedene therapeutische Eingriffe einschließlich pharmazeutische Behandlung und einige nicht-medikamentöse Behandlungen versucht worden sind, bleiben die heilende Wirkung für gastroparesis unbefriedigend.

Akupunktur empirisch verwendet wurde seit Tausenden von Jahren Magen-Darm-Erkrankungen in orientalischen Ländern zu behandeln. Electroacupuncture (EA), die eine Modifikation der traditionellen Akupunktur ist, ist besser geeignet für die klinische und Grundlagenforschung Einstellungen für seine Reproduzierbarkeit. Zusanli
(ST36) ist eine häufige acupoint häufig verwendet, um Magen-Darm-Krankheiten zu behandeln. In den letzten Jahren haben die Auswirkungen der EA bei ST36 auf Magenmotilität wurde in zahlreichen Studien untersucht. Für Tiere, bei ST36 EA deutlich Motilität des Magens in der bewussten Ratten erhöht und verbesserte Magen in STZ-induzierten diabetischen Ratten [3], [4] Entleerung verzögert. Außerdem beim Menschen, bei ST36 EA Magenentleerung beschleunigt und erleichtert dyspeptischen Symptome in Patienten mit funktioneller Dyspepsie und diabetischen Personen mit gastroparesis [5], [6]. Obwohl in diesen Studien nur eine geringe Frequenz EA angenommen wurde, wurde Hochfrequenz EA auch Ösophagus und distalen Colon-Motilität bei Tieren [7], [8] berichtet, zu fördern. So zeichnen sich die Auswirkungen unterschiedlicher Frequenz EA auf die Motilität des Magens und die zugrunde liegenden Mechanismen die Aufmerksamkeit der Menschen.

Die interstitielle Cajal-Zellen (ICC), als Schrittmacher gut etablierte Erzeugung und langsamen Wellen ausbreiten, haben an Bedeutung gewonnen in Magen-Darm-Regulierung Motilität über mehrere Jahrzehnte [9]. Drei Subtypen von ICC einschließlich intramuskulär ICC (ICC-IM), myenteric ICC (ICC-MY) und submuköse ICC (ICC-SM) Form intakte Netzwerke in der Magenwand [10]. Netzwerke von ICC sind nicht statisch, auch unter physiologischen Bedingungen; Apoptose und transdifferentiation führen zu ICC-Verlust, während ICC kann auch aus Stammzellen und zunehmende Überleben [11], [12] durch die Proliferation, Nachschub wieder hergestellt werden. Umfangreiche Studien haben dokumentiert, dass Verlust und Beschädigung von ICC ungeordneten Magen-Darm-Motilität in Tiermodellen und bei Patienten mit Diabetes [13] verursacht - [15]. Vor kurzem berichteten weitere Studien, dass EA die Zunahme von Kolon ICC in Slow-Transit-Obstipation Ratten und Ratten nach enteroenterostomy erleichtert [16], [17]. Unsere kürzlich durchgeführte Studie zeigte auch, dass EA bei ST36 beeinträchtigte ICC im Darm von diabetischen Ratten wieder herstellen könnte [18]. Unterdessen wird es befürchtet, dass EA Proliferation gefördert und im Hippocampus Apoptose von Gehirnzelle inhibiert [19], [20]. Allerdings gibt es eine leere über die Auswirkungen von EA bei ST36 auf ICC in diabetische Gastroparese und den Mechanismus, ob die Proliferation und Apoptose von ICC beteiligt sind

Daher sind die Ziele dieser Studie waren: 1.) Bewerten die Auswirkungen der unterschiedlichen Frequenz EA auf die Magenentleerung; 2) untersuchen die Auswirkungen von EA bei ST36 auf ICC-Netzwerke in diabetischen Ratten; 3) fest, ob die Apoptose und Proliferation von ICC beteiligt waren.

Materialien und Methoden

Ethik-Anweisung

Die Ratten erhielten menschliche Pflege und diese Studie wurde streng nach durchgeführt mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health, mit allen Operationen, die von den ethischen Richtlinien der Animal Care und Use Committee der Tongji Medical College, Huazhong Universität für Wissenschaft und Technologie genehmigt.

Tiere

Männliche Sprague-Dawley-Ratten gewogen 250-300 g in der vorliegenden Studie ausgewählt wurden. Die Ratten wurden aus dem Experiment Animal Center der Tongji Medical College (Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, China) und hielt unter normalen Laborbedingungen (22 ° C, 12.12 h Hell-Dunkel-Zyklus) mit freiem Zugang zu Nahrung erhalten und steriles Wasser. Nach einer Woche der adaptiven Fütterung wurden die Tiere offiziell in unseren Experimenten angenommen.

Diabetic Modell

Nach nächtlichem Fasten aber freien Zugang zu Wasser wurden die Modelle mit einer einzigen intraperitoneale Injektion von Streptozotocin gegründet Ratten (STZ, 60 mg /kg, also 1 ml /100 g Körpergewicht; Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA), frisch in 20 mM Citrat-Pufferlösung (pH 4,5; Sigma, St Louis, MO, USA) . Die Kontrollgruppe wurde mit einem gleichen Volumen an Zitratpuffer injiziert. Alle Ratten wurden in der gleichen Bedingung, mit Wasserentzug für 4 h untergebracht, aber ad libitum
Fütterung. Eine Woche nach der Injektion, Diabetes wurde in verschiedenen Zeit bestätigt durch Glukose in einem Tropfen Vollblut Messung durch die Spitze des Schwanzes Schiffes Punktierung. Ein Blutzuckerspiegel von ≥16.7 mmol /L wurde als Standard für erfolgreiches Modell genommen. Blutzucker wurde pünktlich vor der Injektion und der 1., 4. und 8. Woche nach der Injektion untersucht. Darüber hinaus Gewichtsverlust, Polydipsie und Polyurie waren weitere Indikatoren für die erfolgreiche Veranlassung der diabetischen Ratte nachzuweisen.

Experimentelle Protokolle

Die Ratten wurden in fünf Gruppen randomisiert (10 Ratten pro Gruppe), einschließlich der Kontrolle , diabetische Gruppe (DM), diabetische Ratten mit Schein EA Gruppe (SEA, nur Akupunktur ohne elektrischen Strom, 30 min /d), diabetische Ratten mit niedriger Frequenz EA-Gruppe (LEA, 10 Hz, 1-3 mA, 30 min /d ) und diabetischen Ratten mit hoher Frequenz EA-Gruppe (HEA, 100 Hz, 1-3 mA, 30 min /d). (; Shanghai Huayi Medical Instrument Factory, Shanghai, China G6805-2A) täglich für 8 Wochen EA wurde bei acupoint ST36 mit einem elektrischen Stimulator umgesetzt. Der elektrische Strom wurde nach etablierten bis leicht an den unteren Extremitäten Zittern. Um den Zweck der Beseitigung des Einflusses der Belastung zu erreichen, wurden die Tiere erlaubt, frei in ihrem eigenen Gehäuse während des EA Prozedur zu bewegen.

Nach aufeinanderfolgenden Eingriff für 8 Wochen, die Ratten in jeder Gruppe für die Magenentleerung getestet. Dann wurden sie getötet und Proben von Antrum wurden sorgfältig erhalten. Jede Probe wurde in mehrere Stücke geteilt, eine relativ kleine wurde bei -80 ° C für die Western-Blot-Analyse gespeichert, nachdem Schichten frisch abgelösten und ein Stück wurde in 2,5% Glutaraldehyd für die Elektronenmikroskopie gelegt und der Rest wurde in Zamboni-Fixativ fixiert (2 % Paraformaldehyd und 1,5% gesättigte Pikrinsäure-Lösung in 0,1 M Phosphatpufferlösung (PBS, pH 7,4) für die Immunfluoreszenzfärbung.

Die Messung der Magenentleerung

Magenentleerung durch eine Modifikation wurde durchgeführt, wie beschrieben vorher [21]. Die Testmahlzeit enthält Phenolrot (0,5 mg /ml) als Indikator und Carboxymethylcellulose (15 mg /ml) wurde ständig gerührt und dann bei 37 ° C gehalten. Nach dem Nahrungs entzogen über Nacht erhielten die Ratten wurden 2 ml Phenol rot Mahlzeit über eine Magensonde Nadel verabreicht. Dreißig Minuten später Tiere durch Genickbruch schnell geopfert wurden. die ganze Magen wurde sorgfältig nach Ligatur an der Cardia und Pylorus, entfernt und dann der Magen war offen und sein Inhalt wurden in ein Teströhrchen gegossen und mit 40 ml destilliertem Wasser gewaschen. Am Ende des Experiments, NaOH-Lösung (20 ml, 1 M) wurde zu jedem Röhrchen zugegeben, um die maximale Intensität der Farbe zu entwickeln. Die Extinktion der Probe bei 560 nm mit einem Spektrophotometer gelesen (HITACHI U-2900) wurde die Menge an Phenol zu reflektieren rot im Magen verbleiben. Die Rate der Magenentleerung wurde nach der folgenden Formel berechnet: Magenentleerung (%) = 100 × (1 - X /Y), stellt X Extinktion von Phenolrot aus dem Magen von Tieren gesammelt geopfert 30 min nach der Testmahlzeit. Y für die Absorption von Phenolrot aus dem Magen des Kontrolltier gewonnen getötet unmittelbar nach der Verabreichung der Testmahlzeit.

Western Blotting

Frische Proben von Magenantrum zu einem Sylgard Gericht festgesteckt wurden, und jede Schicht wurde durch scharfe Dissektion nach Entfernung der Schleimhaut sorgfältig abgelöst. Mit Hilfe von Feinspitzzange und mikro Schere unter einem Binokular, Schichten von ICC-SM, ICC-IM und ICC-MY erhalten. Alle Manipulationen wurden auf dem Eis durchgeführt, um den Proteinverlust zu vermeiden. Und dann Proben von ICC-SM, ICC-IM und ICC-MY wurden bei -80 ° C gelagert.

Fresh-gefrorenen Proben wurden in die Zellsuspension zerkleinert und homogenisiert in RIPA-Puffer (Upstate, Temecula, CA USA,) mit Protease-Inhibitor (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Das Gemisch wurde 10 min bei 12000 g zentrifugiert bei 4 ° C, und die Überstände wurden als Gesamtprotein gesammelt. Die Proteinkonzentration wurde durch das Bradford-Verfahren bestimmt. Anschließend wurden Äquivalente von 50 mg der extrahierten Proteine ​​allmählich um 10% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran (Millipore, Bedford, MA, USA). Gefolgt Blockierung unspezifischer Bindungsstellen mit 5% fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Salzlösung, enthaltend 0,1% Tween 20 (TBST) bei Raumtemperatur für 1 h wurden diese Membranen mit primärem Antikörper gegen anti-c-kit inkubiert (1:200, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) über Nacht bei 4 ° C mit Kaninchen-anti-Maus-Actin (1:400, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) diente als interne Kontrolle. Nach dreimaligem Waschen mit TBST, die inkubierten Membranen mit HRP-gebundenen sekundären Antikörpers (HRP-gebundenen Kaninchen-Anti-Ziege und HRP-gebundenen Ziege-anti-Maus, 1:5000) für 1 h bei Raumtemperatur. Gefolgt von drei Waschungen mit TBST wurden die Bänder durch chemische Reaktion mit verstärkter Chemilumineszenz Mittel (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) sichtbar gemacht und der Blot wurde einer Autoradiographie unterworfen. Densitometrie-Analyse wurde durch Quantity One Software (Bio-Rad Technischen Service, Version 4.6.2) durchgeführt.

Immunofluoreszenz Studien

Für ganze-mount-Färbung Vorbereitungen wurde der Magen geöffnet und mehrere gespült -mal mit PBS. Magenantrum wurde einem Sylgard Schale gesteckt und auf 150% ihrer Originalgröße gestreckt, und dann mit Zamboni-Fixativ für 24 h bei Raumtemperatur fixiert. Die fixierten Gewebe wurden mit PBS gewaschen und dann wurde die Schleimhaut durch scharfe Dissektion entfernt. ICC-SM an der Submukosa-Oberfläche der Ringmuskelschicht Ortung, ICC-IM Verwirbelung unter glatten Muskelzellen und ICC-MY zusammen mit myenteric Nervenplexus sorgfältig wurden unter Verwendung von feinzackigen Zange und mikro Schere unter einem Binokular.

Die Immunfärbungsverfahren zum Erfassen ICC Netzwerke und Proliferation früher beschrieben [22]. Ki67, ein Kernprotein während aller aktiven Phasen der Zelle exprimiert und verschwand in der ruhenden Zelle wurde die proliferative ICC [23] zu erkennen angewendet. Nach dem Waschen sechsmal mit PBS für 1 h wurden die Gewebe mit 5% normalem Rinderserum in PBS, enthaltend 0,3% Triton X-100 (PBST) für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit primärem Antikörper c-kit inkubiert (1:100 über Nacht bei 4 ° C Abcam, Cambridge, UK);; Santa Cruz, CA, USA) und Ki67 (1:100. Nachdem in PBST Spülung für 30 Minuten wurde die Immunreaktivität mit Alexa Fluor 594-konjugierten sekundären Antikörper (IgG Esel anti-Ziege, 1:100) erkannt und Alexa Fluor 488-konjugierten sekundären Antikörper (Esel anti-rabit IgG, 1:100) bei 37 ° C für 1 h, gefolgt von in PBS dreimal für 30 min inkubiert und mit DAPI (0,1 mg /ml; Sigma, St Louis, MO, USA) Spülen für 30 min als Kerngegenfärbung. Rinsed in PBS zweimal wurden die Gewebe auf einer Folie entfaltet. Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (Nikon, Japan) wurde verwendet, um die immunmarkierten Geweben zu untersuchen. Um alle Ebenen der positiv gefärbten Zellen und Prozesse umfassen, die optimale Z Stapeln von konfokalen Bildern wurde bei 5 &mgr; m Intervallen eingestellt.

Apoptosis von ICC mit TUNEL Kennzeichnung nachgewiesen wurden, ein Apoptose-Nachweis-Kit (Roche, Deutschland). über Nacht bei 4 ° C und sekundären Antikörper (Alexa Fluor 594 Esel anti-Ziege IgG, 1:100) bei 37 ° C; Whole-Mount-Präparate wurden mit dem primären Antikörper c-kit (Santa Cruz, CA, USA 1:100) inkubiert für 30 min. bei 37 ° C für 1 h: unter einer befeuchteten und dunklen Umstand wurden die Gewebe mit TUNEL-Reaktionspuffer (Enzymlösung = 9.01 Markierungslösung) inkubiert. Nach dreimal für 30 min mit DAPI als Kerngegenfärbung unverbundenen Fluorescein-dUTP und inkubiert zu entfernen, werden die Proben wurden unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop beobachtet.

Elektronenmikroskopie

Nach Schleimhaut entfernt, Proben von Antrum wurden in eine Fixierlösung aus 2,5% Glutaraldehyd bei 4 ° C für 2 h eingetaucht. Dann sie mit 0,1 M PBS zweimal für 20 Minuten gespült wurden, nachfixiert in 1% OsO _{4 (pH 7,4) für 1 h, dehydriert mit abgestuftem Alkohol, Propylenoxid geklärt und eingebettet in Epon flachen Formen verwenden. Ultradünne Schnitte mit einem Ultramikrotom erhalten (Leica ULTRACUTU, Deutschland), und gefärbt mit Bleizitrat für 10 Minuten, bevor sie mit einem Transmissions-Elektronenmikroskop betrachten (Tecnai G ^{212, FEI, Niederlande).}}

Die statistische Analyse

Für Immunfluoreszenzanfärbung Analyse, Magenantrum von jedem Versuchstier wurde in der gleichen Lage des Magens entnommen. ICC wurde von c-kit-Immunoreaktivität und die Anwesenheit von reichlich zellulärer Prozesse erkannt. Proliferierendes und apoptotische ICC wurden von c-kit Immunreaktivität und Ki67 /TUNEL gefärbten Kern umschließt mit c-kit positiven Membranstrukturen identifiziert. Zehn Zufallsfelder (× 200 Vergrößerung, 0,2607 mm ^{2) pro Vollmontage Vorbereitung wurden für Fotos von c-kit-positiven Zellen entnommen, c-kit + /Ki67 + und c-kit + /TUNEL + markierten Zellen. Diese Fotografien wurden auch die Dicke der Schichten in jedem Stapel mit Hilfe der DAPI markierten Kerne als Marker der oberen und unteren Grenzen der Schichten zu evaluieren. Die Zahl der c-kit-positiven Zellen, c-kit /Ki67 und c-kit /TUNEL doppelt markierten Zellen wurden mit Bild-ProPlus 5,0 (Media Cybernetics) gezählt. Alle Daten wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Mindestens zehn Visionen wurden in jedem Tier entnommen. Die Analyse der Varianz (ANOVA) und der t-Test nach Student verwendet, um die Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen zu vergleichen. P-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikanter Unterschied gemacht.}

Ergebnisse

• PLoS ONE: Self-Reported Magenverstimmung in Reisende auf Cruise-Based und Land-basierte Paket Holidays
• PLoS ONE: Nikotin Dämpft Aktivierung von Gewebe Makrophagen in der Maus Magen durch den β2 nikotinischen Acetylcholin Receptor