Ploche ONE: metabolomika spolu s mnohorozmerných dát a Pathway Analysis na potenciálne biomarkery žalúdočný vred a intervenčných účinkov Corydalis yanhusuo Alkaloid

abstraktné

metabolomiky, systematickú analýzu prípadných metabolitov v biologickom vzorky, bolo čím ďalej aplikovaný na objavovanie biomarkerov, identifikácia rozrušený dráh, meranie terapeutických cieľov a objavovanie nových liekov. Na základe analýzy a overovanie významný rozdiel v metabolických profilov a zmeny metabolitov biomarkerov, metabolomiky nám umožňuje lepšie pochopiť látok metabolické cesty, ktorá môže objasniť mechanizmus čínskej tradičnej medicíny (TCM). Corydalis yanhusuo
alkaloid (CA) je hlavnou zložkou Qizhiweitong (QZWT) lekárskeho predpisu, ktorý bol použitý pre liečenie žalúdočný vred po stáročia a jeho mechanizmus zostáva nejasný úplne. Metabolit profilovanie sa vykonáva pomocou vysoko účinnej kvapalinovej chromatografie v kombinácii s time-of-flight hmotnostnej spektrometrie (HPLC /ESI-TOF-MS) a v spojení s multivariačný štatistickej analýzy dát a dráhy. Štatistický software Mass Profiller Prossional (MPP) a štatistické metódy vrátane ANOVA a analýzy hlavných komponentov (PCA) boli použité pre objavovanie nových potenciálnych biomarkerov objasniť mechanizmus CA pri liečbe krýs kyselín injekciu žalúdočného vredu. Zmeny v metabolické profilovanie boli obnovené do ich základňou hodnôt po liečbe CA podľa skóre pozemkov PCA. Desať rôznych potenciálnych biomarkerov a sedem kľúčových metabolické dráhy, ktoré prispievajú k liečbe žalúdočných vredov boli objavené a identifikované. Medzi cestami, sphingophospholipid sieť súvisiace s metabolizmus a metabolizmus mastných kyselín boli intenzívne rozrušený. Kvantitatívne PCR (RT-PCR) analýzy boli vykonané pre hodnotenie expresie génov súvisiacich s dvoma cestami pre overenie vyššie uvedených výsledkov. Výsledky ukazujú, že zmenené biomarkery a cesty môžu predložiť dôkazy, aby nahliadnuť do mechanizmu účinku lieku a umožní nám zvýšiť produktivitu výskumu smerom k objavu lieku metabolomiku

Citácia :. Tianjiao L, Shuai W, Xiansheng M, Yongrui B, Shanshan G, Bo L, et al. (2014) metabolomika spolu s mnohorozmerných dát a Pathway Analysis na potenciálne biomarkery žalúdočný vred a intervenčných účinkov Corydalis yanhusuo
Alkaloid. PLoS ONE 9 (1): e82499. doi: 10,1371 /journal.pone.0082499

Editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Spojené štáty |

prijatá: May 15, 2013; Prijaté: 24.októbra 2013; Uverejnené: 15.januára 2014

Copyright: © 2014 Tianjiao et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený dotácií z nosným programom Natural Science Foundation štátu (č 81241111). Aglientu a investori mali žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy :. Autori vyhlasujú, že ich rukopis nemá vzťahy s Agilent Technologies Co., Ltd., vzťahujúce sa k zamestnaniu, poradenstvo, patenty, výrobky vo vývoji alebo výrobky uvádzané na trh atď. To je súčasťou master ~ s projektu a stojí na rozdiel od akéhokoľvek interného projektu. Jeden z príslušných autorov, Xiaorong Ran, je zamestnaná Agilent Technologies Co., Ltd., ktorý pomáhal v dizajne štúdie, experimenty a /alebo analýzy. Lei Wang je tiež zamestnaný od Agilent Technologies Co., Ltd., ktorý dohliadal na štúdium a pomáhal pri úprave gramatické chyby v rukopise. Autori potvrdzujú, že zamestnanosť podľa Agilent Technologoies nezmení ich dodržiavanie ktorejkoľvek prístupy ploche jeden na zdieľanie dát a materiálov.

Úvod

žalúdočný vred je rozšírená choroba, ktorá postihuje mnoho ľudí všetko na celom svete vzhľadom na vyššiu a vyššiu chorobnosťou. Podľa štatistík z roku 2005, bol výskyt žalúdočného vredu bolo až o 80%, predovšetkým západnému svetu. Má 40-80% z opakujúcich sa frekvencie po celom svete. Žalúdočné vredy u ľudí sa často vyskytujú v dôsledku rôznych endogénnych a exogénnych faktorov, ako je stres, fajčenie, výživové nedostatky, kyselinu chlorovodíkovú, pepsín, Helicobacter pylori
, nesteroidné protizápalové užívanie drog (NSAID), alkohol a infekcie [1]. Aj keď by sa zdať, tieto faktory sa podieľa na patogenéze žalúdočných vredov, mechanizmus vzniku vredov nie je doteraz presne zrejmé, [2], [3]. TCM získal uznanie na celom svete rastúce v posledných rokoch a je všeobecne považované za prírodné a neškodné [4], [5]. Terapia súhrnne nazývané TCM sa bežne používa na liečbu žalúdočný vred, ktorý zahŕňa čínskej bylinnej medicíny a lekársky predpis atď

QZWT recept zložený zo Corydalis yanhusuo
Radix Glycyrrhizae
a Radix Bupleuri
atď. boli rozsiahle používa na liečbu žalúdočný vred po stáročia v Číne, vzhľadom k jeho významný liečebný výkon v klinickej aplikácie [8] - [10]. čistí sme CA z rastlín "Corydalis yanhusuo W. T. Wang" o čistote 92%. Chemické zložky Corydalis yanhusuo
boli skúmané v našej predchádzajúcej štúdii. Tetrahydropalmatine, corydaline, protopine kolies boli biologickej aktivity Corydalis yanhusuo
. Boli skúmané štruktúry zložiek. CA Uznáva sa, že je hlavný aktívna zložka v Corydalis yanhusuo
[6], a preukázané, že majú protivredový účinok používaný v čínskej klinickej praxi už mnoho rokov [7]. Bolo tiež oznámené, že CA má protizápalový účinok [8], [9]. Avšak, detailné molekulárnej mechanizmus CA pri liečbe žalúdočný vred nie je dobre známa.

Ak chcete vysvetliť akčný mechanizmus drog, metodológie metabolomiky bol široko používaný [10]. Metabolomiky je dôležitou zložkou biológie systémov, a to najmä pri stanovení globálnej metabolický profil detekciou tisíce malých i veľkých molekúl v rôznych médiách v rozsahu od bunkových kultúr ľudských biologických tekutinách ako sú moč, sliny a krv [11], [12] , [13]. To má veľký vplyv na vyšetrovanie objavovanie biomarkerov, a identifikácia porušenej cesty kvôli chorobe alebo užívanie liekov [14]. Na základe analýzy a overovania konkrétnych včasných biologických ukazovateľov choroby, metabolomiky nám umožňuje lepšie pochopiť látok metabolické cesty, ktorá môže objasniť mechanizmus účinku [15].

Nedávne pokroky prístrojovej techniky a výpočty umožnili simultánny analýzu veľké množstvo metabolitov. HPLC v spojení s MS bolo preukázané, že byť efektívna kombinácia pre metabolity identifikáciou a kvantifikáciou vďaka vynikajúcim rozlíšením a citlivosťou. Cieľom súčasnej štúdie bolo získať systematický pohľad pitvať mechanizmus CA ako účinnú liečbu žalúdočných vredov. Špecifické a jedinečné biochemické dráhy účinnosti lieku môžu byť identifikované, v kombinácii s viacrozmerné techniky analýzy dát. Účelom tejto štúdie je identifikovať rôzne metabolity, ktoré by mohli uľahčiť pochopenie akčného mechanizmu CA a napomôcť k ich začleneniu do budúcej zlepšenie liečby TCM.

Materiály a metódy

2,1 Ethical Vyhlásenia

Všetky experimenty boli vykonávané v súlade so schválenými zvierat protokolov a pokynov stanovených Lekárska etika kontrolným výboru pre pokusy na zvieratách Liao-ning University of tradičnej čínskej medicíny.
Manipulácia

2,2 zvierat a príprava vzoriek

Sedem týždňov starí samci SD krýs s hmotnosťou 200-250 g, boli poskytnuté pre pokusné zvieratá mesta Dalian lekárskej univerzity. Starostlivosti a zaobchádzanie s potkanov boli v súlade so štandardom špecifického patogénnych mikroorganizmov. Žalúdočný vred bola indukovaná u potkanov podľa metódy v predchádzajúcej správe s miernou zmenou, [16], [17]. Tri dni po výrobe žalúdočných vredov, potkany boli náhodne rozdelené do piatich skupín: kontrola, model, CA skupiny s vysokou dávkou (32,4 mg /ml), CA skupina stredná dávka (10,8 mg /ml) a CA nízkou skupine s dávkou (3,6 mg /ml). Všetky krysy v skupinách boli podávané orálne účinné riešenie skupine 1,5 ml raz denne (model a kontrolnej skupiny s fyziologickým roztokom) po dobu 7 dní. Krysy boli zakázané žiadne jedlo po dobu 12 hodín pred pokusom, ale bol umožnený prístup voľne vode.

Na posledný deň, potkany boli hlboko anestéziu a potom bola usmrtená. Krv bola odobratá, plazmy a séra boli oddelené centrifugáciou pri 3000 otáčkach za minútu po dobu 15 minút pri teplote 4 ° C. Vzorky plazmy boli odoberané a skladované pri -80 ° C blesk zmrazí v kvapalnom dusíku až do analýzy boli vykonané metabolomika. Potom sa žalúdky boli rez pozdĺž veľkého zakrivenia, premyje sa roztokom chloridu sodného. Oblasť vredov bola meraná kompas na meranie indexu vredu. Plocha vredu sa rovná šírke vrede násobku dĺžky vredu. Pre histologické vyhodnotenie vzoriek žalúdočnej tkaniva boli fixované v neutrálnom pufrovanom formalínu po dobu 24 hodín. Žalúdočné rezy boli dehydratuje etanolové, prešiel xylénu, a vložené do parafínu. Parafínové sekcie (5 hrúbka mm) boli zafarbené hematoxylínom /eosínu (HE). Ostatné žalúdočné vredy tkaniva boli rýchlo odstránené a zmrazený v kvapalnom dusíku až do extrakcie celkovej RNA tkaniva.

2,3 metabolické profilovanie

2.3.1 Chromatografia.

Chromatografia bola vykonaná za použitia HPLC systému Agilent série 1100 vybaveného kvartérnymi čerpadlom, on-line odplyňovač, autosampler a termostatického kolóne priestoru. Objem injekcie bola stanovená na 4 ul. Všetky vzorky boli udržiavané pri 4 ° C v priebehu analýzy. Separácia bola vykonaná na 4,6 x 100 mm, Zorbax SB-C18 (Agilent, USA). Teplota kolóny bola nastavená na 45 ° C. Mobilná fáza sa skladá z 0,1% kyseliny mravčej vo vode (rozpúšťadlo B) a 0,1% kyseliny mravčej v acetonitrile (rozpúšťadlo A), prietok bol nastavený ako 1 ml /min, s pomerom delenia 1: 3, gradient bol používaný ako nasledujúce: elúcie lineárnym gradientom 70- 33% B počas 5,0 min, základné a 33 -98% B počas 5.0-12.0 min. Eluent bol zavedený do hmotnostného spektrometra priamo. Po každých 10 vzoriek vstrekovanie, zloženej vzorky, ako je vzorka QC nasleduje polotovaru bol injikovaný, aby bola zabezpečená stabilita a opakovateľnosť systému LC-MS.

2.3.2 Hmotnostná spektrometria.

hmotnostnej spektrometrie bola použitá Agilent 6220 TOF-MS elektrosprejová ionizačná (ESI) zdroje v negatívnom móde. Prietok umierajúceho plynu (N2) bola stanovená na 9 l /min. Rozprašovač bol nastavený na 45 psi. Ostatné optimálne podmienky boli nasledovné: umieranie teplota plynu 350 ° C, fragmentu napätím 120 V. údaje boli zhromaždené v režime full-skenovanie zo m /z 50 až 1050 amu počas 0-12 min. Dáta MS boli zhromaždené v ťažisku režime.

2.3.3 Viacrozmerná analýza dát.

Analýza dát postup je znázornený na obr. 1. algoritmus Molecular Feature Extractor (MFE) v kvalitatívnej analýze softvérom Mass Hunter bol použitý k extrakcii molekulárno biologickými vlastnosťami-neidentifikovanej, necielenej látky - vo všetkých týchto údajov. Algoritmus MFE hľadá masových signály (ióny), ktoré sú covariant v dobe zvažuje možné ďalšie chemické vzťahy (izotopov priťahuje, diméry, viac stavy nabitie), a generuje extrahovaný zlúčenina chromatogramu a zložený hmotnostné spektrum pre každý molekulárnej funkciu. Extrahovaná Zoznam zlúčenina pre každý súbor bol exportovaný ako súbor zlúčenina Exchange Format (CEF). Pre ďalšie Mass Profiler Professional (verzia B.2.00, Agilent) štatistické analýzy. Výsledné funkcie súbory pre každej vzorky boli spracované pomocou ANOVA a PCA analýze s využitím softvéru MPP, ktorý vyrovnaný, štandardizovaná vizualizovať a filtruje molekulárne vlastnosti (MFS), na ďalšie spracovanie [18], [19], [20], [ ,,,0],21]. Následne, hierarchické zhlukovanie (podmienka strom) bol aplikovaný na dátové súbory. Hierarchická zhluková analýza je štatistická metóda pre vzorky skupín bez dozoru v rôznych skupinách alebo konárov hierarchického stromu. Týmto spôsobom, sú uvedené vzťahy medzi jednotlivými skupinami. Podmienkou strom bol zobrazený ako mapy tepla. Totožnosť biomarkerov s významnými zmenami v skupinách bola stanovená rysy ID prehliadač MPP.

2.3.4 biomarkery Identifikačné.

identifikácia potenciálnych biomarkerov bola stanovená Q-TOF (Xevo G2). Energia zrážky MS je 35ev, a údaje boli získané v režime záporných iónov, softvér x (V4. MassLn1) bol použitý pre analýzu dát. Identity špecifických metabolitov bola potvrdená porovnaním prvky informačného svojich hmotnostných spektier pomocou elementárne informácie o zložení uvedené v softvéri.

2.3.5 Sieť a Pathway Analysis.

MPP softvér bol použitý na všetky významné (zmena zložka > 2) hore a dole regulované regulované metabolity a príbuzné biologické dráhy. Potenciálne markery identifikované boli porovnané s presným pomerom hromadného náboja v niektorých databázach, vrátane HMDB, KEGG, metlinatý, lipidov máp a PubChem, objavovať súvisiacich dráh. T-test a rozkladacie alter boli použité pre stanovenie štatistickej významnosti v dráh. P hodnota menšia ako 0,05 a zmeny zložka zlúčenina, 2 bol považovaný za kritériá pre štatisticky významné a by mal byť vybraný

2,6 Molecular dát

Celková RNA bola extrahovaná z žalúdočné tkaniva vrátane riadenia, model a CA. skupiny pomocou TRIzolu činidlo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) podľa návodu výrobcu. cDNA bola syntetizovaná z celkovej RNA (1 ug) s použitím First-Strand TransScript cDNA Synthesis kit Supermix (Beijing transgénov Biotech, Čína). Kvantitatívne PCR v reálnom čase (CFX96, BIO-RAD, USA) bola vykonaná za použitia TransStart ™ Top Green Supermix qPCR Kit (Beijing transgénov Biotech, Čína). Primery používaný zosilniť S1Pr1, S1Pr3, SphK1, Got2 a Fabp1 boli od Invitrogen (S1Pr1: GenBank podľa nie NM_017301, S1Pr3: .. GenBank podľa nie XM_225216, SphK1: .. GenBank podľa nie NM_133386, Got2: ... GenBank podľa Žiadne . NM_013177.2, Fabp1: .. GenBank acc no NM_012556.2) a expresie týchto transkriptov bola kvantifikovaná proti upratovanie génu beta-aktínu, ktorý bol amplifikovaný za použitia primérov 5'-TGGCACCACACTTTCTACAATGA-3 'a 5'-AGGGACAACACAGCCTGGAT- 3 '. Hladiny expresie cieľových génov boli analyzované za použitia systému CFX Správca (BIO-RAD, USA).

2.7 Štatistická analýza

Dáta sú vyjadrené ako priemer ± SEM. SPSS 19.0 pre Windows bol použitý pre štatistickú analýzu. Dáta boli analyzované s použitím ANOVA s p menšie ako 0,05 nastavená ako úroveň štatistickej významnosti

Výsledok

3.1 Vplyv CA na kyselinu octovú injekcií vyvolané žalúdočný vred modelu
.

experimentálny model kyseliny octovej injekčne-indukovanej poškodenia žalúdočnej sliznice u potkanov sa často používa na skríning zlúčenín na anti-vredov aktivitu v tom, že slúži ako hlavnou príčinou žalúdočných vredov u ľudí [22]. kyselina octová injekcií vyvolané intenzívny poškodenie žalúdočnej sliznice pri tvorbe vredov v modeli skupiny (obr. 2A) potkanov, ktorým má výrazne rozdiel v porovnaní s kontrolnou skupinou (obr. 2B). Patologická pozorovanie bol použitý na confirm poškodeniu indukovanej kyselinou octovou v povrchových vrstvách žalúdočnej sliznice ulteriorly. žalúdočné vredy indukované kyselinou octovou (obr. 2C) má erózie účinok na sliznicu, ktoré bolo sprevádzané svalov lomu a zápalovú infiltráciou buniek vo vrstvách v porovnaní s kontrolou (obr. 2D). Výsledky ukázali, že model žalúdočných vredov bola úspešne reprodukovaná. Výsledky časového priebehu zobrazenej na Obr. 2E ukazujú, že plocha vredu u potkanov ošetrených CA stále výrazne nižšie v porovnaní s príslušným hodnotám v modeli potkanov pri siedmy deň, takže sme choosed vzorky siedmy deň pre analýzu. Na vyhodnotenie účinkov CA, ako je ukázané na Obr. 2F, oblasť žalúdočného vredu v dávkových skupín CA bol významne znížený v porovnaní s modelom skupinou (p 0,01). Naše výsledky naznačujú, že experimentálny CA môžu účinne liečiť žalúdočný vred, najmä skupinu stredné dávky. Zdá sa, že dochádza k výraznému prekrývania medzi neurónových patogénnych dráh zapojených do vredov vzniku a depresie. Preto nie je prekvapujúce, že na liečbu depresívnych epizód môže mať aj silný ochranný účinok proti žalúdočný vred [23]. Dôvodom, prečo CA prostredný skupinu danej dávky majú lepšiu terapeutický účinok než skupiny s vysokou dávkou môže byť CA skupina s vysokou dávkou má za úlohu potlačiť nervy. Účinok CA bola skúmaná ďalej skúmať mechanizmus.

3,2 metabolomické Study

3.2.1 získavanie a spracovanie metabolických údajov v profile.

Reprezentatívny celkový iónový chromatogram ( TIC) plazmových vzoriek získaných z kontroly, model a dávkovaním CA v záporných režimoch sú uvedené na obrázku. 3 pomocou optimálne podmienky LC-MS popísané vyššie. Nízka hmotnosť metabolity molekulárnej by mohli byť oddelené tiež v krátkej dobe 15 minút. Aby bolo možné lepšie vizualizovať jemné podobnosti a rozdiely medzi týmito zložitými dátovými súbory boli použité viacnásobné metódy rozpoznávania fenotypu plazmového metabolomu krýs. Tu hierarchickej analýza zhlukovaniu a PCA boli použité pre klasifikáciu metabolické fenotypmi a identifikovať differenting metabolity. Hierarchickej analýza zhlukovaniu metabolomika údajov ukázala výrazné segregácii medzi kontrolnou skupinou, model a skupine s dávkou CA (viď obr. 4). V PCA skóre, každý bod predstavuje jednotlivý vzorku. Výsledky PCA sú zobrazené ako skóre pozemkov, ktoré udávajú rozptyl vzoriek, ktoré svedčia o podobné metabolomika zložení pri zoskupené a kompozične rozdielne metabolomes pri rozptýlené. PCA skóre dej mohol rôzne vzorky plazmové rozdeliť do niekoľkých blokov, v uvedenom poradí, čo naznačuje, že metabolické profily zmenili. Čo sa týka informačného analytika PCA v experimente ukázali, na Obr. 5, kontrolné a modelové skupiny boli signifikantne rozdelené do dvoch tried, čo indikuje, že model žalúdočného vredu indukovanej kyselinou octovou bola úspešne reprodukovaná. Jemnejšie zmeny možno nájsť pomocou rozpoznávania prístup skóre pozemkoch PCO. PCA výsledky zobrazí, že model skupina bola ďaleko od zostávajúcich štyroch skupín, čo naznačuje, že zmenený metabolický vzor výsledkom indukovanej kyselinou octovou môže byť výrazne odlišný od ostatných. Postavenie liečebnú skupinu bolo u kontrolnej skupiny, čo naznačuje, že zmenené metabolické vzorka bol spôsobený tým, CA. Výsledky zjavné, že CA môže zmeniť abnormálne metabolický stav a môže mať iný liečebný mechanizmus žalúdočné vredy indukované kyselinou octovou.

3.2.2 Identifikácia potenciálnych biomarkerov.

malé molekuly metabolity významné rozdiely (T-test, p < 0,05) boli vyhľadávané pomocou softvéru MPP. Potenciálne markery boli identifikované pomocou "ID" prehliadač pre vyhľadávanie v databáze metlinatý (http://metlin.scripps.edu/) a v porovnaní s presným pomerom hromadného náboja v niektorých databázach, vrátane HMDB (http: //www. hmdb.org/), KEGG (http://www.genome.jp/kegg/), lipidov MAPS (http://dev.lipidmaps.org:25424/) a PubChem (http: //pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/). Môžeme spoznať pravdepodobný názov potenciálnych biomarkerov prostredníctvom prvého kroku. V tejto štúdii, 10 potenciálnych biomarkerov boli identifikované (tabuľka 1). Presná molekulová hmotnosť zlúčenín s významnými zmenami v skupine bol stanovený v rámci chyby merania (menej ako 5 ppm) Waters Xevo G2 QTOF, a medzitým potenciálny prvkové zloženie, sa získa stupeň nenasýtené a frakčnej izotopov množstvo zlúčenín. Predpokladaná molekulárnej vzorec bol hľadaný v Chemspider (http://www.chemspider.com/~~HEAD=pobj), HMDB a ďalších databáz pre identifikáciu možných chemické ústavy a dáta MS /MS boli testované na určenie potenciálnej štruktúry ióny. Sfingozín-1-fosfát (S1P) a kyselina stearová boli vzaté ako príklady na ilustráciu fragmenty štruktúry a spôsobu hodnotenia. Informácie o primárnu a sekundárnu hmotnostnej spektrometrie bola analyzovaná MassLynx (videnie 4,1, vody) softvér, v porovnaní s databázou, a iónové fragmenty 379.2488 (C _{18 H 38NO 5P) bolo ukázané na Obr. 6 A. Hlavnými fragmentov ióny analyzovaný pomocou MS /MS preskúmanie boli m /z 224,080, 165,1254 a 82,0238, ktoré by mohli zodpovedať stratené C 7 H 15NO 5P, C 11 H 17O, C 4H 4NO resp. Nakoniec, sa špekulovalo ako S1P po odkazom, a v závislosti od ich veľkosti, polarity. Medzitým iónové fragmenty stearovej 284.2715 (C 18H 36o 2) (obr. 6 B) boli 212,2419 (C 15H 32), 143,1359 (C 9H 19o), 117,0962 (C 6 H 13O 2) a 83,0962 (C 6 H 11).}

biomarkery popísané vyššie boli preukázané majú blízko vzťah s tvorbou a liečbe žalúdočných vredov. Výrazne sa regulovaným D-glukózy, lyzín, kyselina močová, kyselina pyrohroznová, kortikosterónu, sfingozín-1-fosfát a dole regulovať tryptofánu, glykocholát, kyselina hexadecanedioic, kyselina stearová boli pozorované v modelovom skupine v porovnaní s kontrolnou skupinou (obr. 7 ). Tento rozdiel metabolitov môže naznačovať ich potenciál ako cielené biomarkerov pre diferenciáciu žalúdočný vred a normálne stavy. Monitorovanie zmien týchto metabolitov môžu predpovedať rozvoj žalúdočný vred. Biomarkery 1, 2, 3, 4, 7, 8, klesli po ošetrení CA, na rozdiel, ďalšie biomarkery boli zvýšené. Navyše, s cieľom charakterizovať protivredové účinky CA jasnejšie, zmeny v relatívnych koncentráciách cieľových metabolitov uvedených v rôznych skupinách bola analyzovaná, zistilo sa, že obsah týchto kľúčových markerov bližšie k normálnej skupine. Výsledky naznačujú, že mechanizmus pre liečbu žalúdočných vredov, môže byť dosiahnutý prostredníctvom regulácie týchto markerov významne a ich interakcie, ako je na obr. 8. Napríklad, kyselina stearová, ktoré nazýva 17FA, má vzťah s kyselinou thapsic keď je proteín Fabp1 (mastná proteín viažuci kyselinu 1). Sieť nielen ukazuje interakciu medzi biomarkery, ale tiež poskytuje informácie o potenciálnej proteínov, génov, enzýmy a biologických procesov. Prispieva k objavu ciele počas výskytu a liečbe žalúdočných vredov a je vodivý k vývoju nového lieku na liečbu žalúdočný vred.

3.3 Stanovenie hladín mRNA pre potvrdenie biomarkerov

Ak chcete potvrdiť naše zistenia metabolomiky, budeme potrebovať nejaké molekulárnej dáta, takže sme identifikovali 5 mRNA, ktoré sa týkajú 4 potenciálnych biomarkerov a 2 metabolických dráh s RT-PCR. Sphingolipid metabolizmus, vrátane S1Pr1, S1Pr3 a SphK1 boli skúmané ako je vidieť na Obr. 8. Výsledky sú zhrnuté na Obr. 9. Hladina mRNA S1Pr1, SIPr3 a SphK1 významne up-regulované v modeli skupiny, hladiny expresie boli 5,21, 2,54, 6,57 krát v porovnaní s kontrolnou skupinou, ktorá bola v súlade s našimi predchádzajúcimi poznatkami a dát. Po ošetrení CA, hladiny expresie S1Pr1, S1Pr3 a SphK1 sa späť na základné hodnoty. S1P je tvorený dvoma kinázami, sfingozín kinázy 1 a 2 (SphK1 a SphK2), ale žiadne rozdiely boli pozorované u SphK2 expresie medzi všetkými skupinami (dáta nie sú ukázaná), výsledok bol v súlade s našich zistení siete. Tu môžeme vysvetliť potenciálny mechanizmus CA pri liečbe žalúdočný vred, že blokuje S1P zvyšuje. Tiež sme zistili, je znížená expresia Fabp1 a Got2 v modelovom skupine (obr. 9), v porovnaní s kontrolnou skupinou. Ale CA robí skupiny boli v blízkosti s kontrolnou skupinou, ktorá potvrdila, že terapeutický účinok CA súvisela s metabolizmu mastných kyselín z molekulárnej úrovni.

3,4 Pathway Analysis

Podrobnejšia analýza dráh a siete ovplyvnené žalúdočných vredov bola vykonaná MPP. Dráhy Získané ukazuje v tabuľke 2. Používame kvalitné KEGG metabolické dráhy ako základ vedomostí backend identifikovať tie najrelevantnejšie dráhy, napríklad sphingolipid metabolizmus, cyklus tricarboxylicacidcycle kyselín, metabolizmu biotín a tak ďalej, v ktorých 7 jedinečnej cesty ( sú uvedené v tabuľke 1) pre modelovú skupinu bol identifikovaný. boli tiež zodpovedalo potenciálnych biomarkerov týkajúce sa metabolizmu kyseliny listovej, metabolizmu mastných kyselín a sphingolipid dráhy látkovej výmeny. Zo 6 rôznych metabolitov zistených z týchto dráh, mnohé z nich sú v rôznych fázach pokroku pri žalúdočných vredov. Niektoré výrazne zmenili metabolity, ako je glykocholát, kyselina hexadecanedioic a kyselina stearová boli nájdené a použité na vysvetlenie mechanizmu mastné kyseliny. Tieto výsledky naznačujú, že tieto cieľové dráhy ukazujú výrazné perturbace cez tvorbu žalúdočných vredov a mohla by prispieť k rozvoju žalúdočných vredov.

Diskusia

žalúdočné vredy u ľudí často opakujú, a obtiažnosť pri liečbe nich je indikovaná príslovie "Akonáhle vred, vždy vredovej" [24]. Mnoho faktorov môže zvýšiť výskyt žalúdočného vredu, ale mechanizmus nie je presne známy. Preto, že účinnosť liečby drogovej závislosti, závisí nielen na zníženie škodlivých faktorov, ale aj na základe zmenených metabolity, ktoré regulujú metabolizmus dráhu. Najmä objav biomarkerov, ktoré predpovedajú riziko žalúdočného vredu poskytujú príležitosť pre diagnostiku a umožniť farmakologickú liečbu včas. QZWT bol použitý na liečbu žalúdočný vred po mnoho rokov v Ázii aj keď jeho mechanizmus zostáva nejasný. Metabolomika spolu s mnohými premennými dátovými nástroje, ktoré súčasne kvantifikujú tisíce metabolitov v živom organizme bola použitá na analýzu biomarkerov v žalúdočných vredov [25]. Okrem toho, pochopenie biomarkerov zažal nový záujem v oblasti zisťovania protidrogových programov a monitorovanie chorôb, ktoré poskytujú cenné mieridlá o zložitých mechanizmov chorobe [26]. Táto štúdia bola teda navrhnutá tak, aby ďalej objasniť základný mechanizmus CA na žalúdočný vred reguláciu z metabolických dráh v globálnom pohľade.

Model žalúdočných vredov u krýs bola úspešne reprodukovať. Vzorky plazmy boli analyzované pomocou HPLC /ESI-TOF-MS a multivariačný štatistickej analýzy. Výsledky ukázali, že plocha vredu a dynamických metabolických profilov po ošetrení CA boli uzavreté s kontrolnou skupinou, ktoré preukazujú, že CA mali terapeutickú účinnosť. Podľa analýzy metabolomiky, 10 potenciálnych biomarkerov a 7 súvisiace metabolické cesty boli popísané v našej štúdii. Výrazne sa regulovaná D-glukóza, lyzín, kyselina močová, kyselina pyrohroznová, kortikosterónu, sfingozín-1-fosfát a hore regulované tryptofán, glykocholát, kyselina hexadecanedioic, kyselina stearová boli pozorované u skupiny CA v porovnaní s modelom skupinou. Okrem toho, metabolizmu kyseliny listovej, metabolizmu mastných kyselín, a sphingolipid metabolizmus a mnoho ďalších metabolizmus bolo potvrdené, že majú vplyv na žalúdočné vredy. Máme určiť expresiu mRNA súvisiace s sphingolipid Metabolizmus a mastných kyselín pre overenie mechanizmu. Mnoho iných potenciálnych proteíny, gény, enzýmy a bioprocesov uzatvorené s inými cestami potrebujú budúce experimenty na overenie.

Podľa analýzy a overenie špecifické včasných biologických ukazovateľov choroby, metabolomiky nám umožňuje lepšie pochopiť patologických procesov a látka metabolických dráh , Veríme, že biomarker a cesta analýzy majú veľký potenciál, aby preskúmala a objasniť terapeutický účinok TCM. V súčasnej štúdii sme vyznačujúci biomarker interakcie siete zahŕňať proteíny, gény, enzýmy a bioprocesmi, ako je znázornené na Obr. 8. S1P akt extracelulárne ako ligand pre jeho špecifických receptorov S1PRs, je teraz rozpoznaný ako regulátor mnohých fyziologických a patofyziologických procesov, vrátane zápalových ochorení, ako je reumatoidná artritída, zápalové črevné ochorenia, sepsy a [27], [28]. Zápal, ktorý sa vyskytuje v sliznice gastrointestinálneho traktu, a tým spôsobí, vred žalúdka alebo čreva [29]. Naše výsledky ukazujú, že CA môže znížiť expresiu S1P a jeho receptory, vrátane S1Pr1 a S1Pr3, na zmiernenie problémov, na zmiernenie zápalu tvorbu žalúdočných vredov [30]. S1P je tvorený SphK1 a SphK2 [31]. SphK1 môže aktívny NF-kB dráha, ktorá iniciuje hlavné zápalová signalizačné molekuly TNF-a. Stručne povedané, NF-kB a TNF-α úzko súvisí s vzniku a liečiť žalúdočný vred [32], [33]. Tiež sme zistili, že nedostatok SphK1 (nie je SphK2) významne inhibuje žalúdočný vred, čo naznačuje, že SphK1 môže hrať kľúčovú úlohu v žalúdočný vred. To znamená, že metabolizmus sphingolipid môže byť životaschopná cieľ pre liečenie žalúdočný vred.

kyselina stearová, glykocholát a kyselina hexadecanedioic zmenil spôsobiť metabolizmu mastných kyselín porucha zatvárania k výskytu a rehabilitáciu žalúdočných vredov [34], [35] , Mastné kyseliny, vrátane ETC kyselina stearová, bežne vnímaná ako zdroj energie, prilákali záujem o výskum a verejné zdravie, vzhľadom k ich vplyvu na ľudské zdravie a chorôb. Mastné kyseliny sú prospešné pre zdravie prospešné. Kyselina stearová, glykocholát a hexadecanedioic sú regulované Fabp1, enzýmu z mastné kyseliny viažuci proteín 1. V analýze RT-PCR, nízka expresia v modelovom Fabp1 skupiny naznačuje, že inhibícia aktivity Fabp1 môže znížiť kyselina stearová, glykocholátu a kyselinu hexadecanedioic a viesť k poruche metabolizmu mastných kyselín. Preto sa zvýšila zápalovú reakciu a mitochondriálnu dysfunkciu a podporovať tvorbu vredov. Avšak, CA môže vyvážiť tejto poruchy prostredníctvom zvýšenia expresie Fabp1 [36]. Glutámovej-oxaloctová transamináza 2 (Got2) je dôležitým enzýmom v cykle tricarboxylicacidcycle kyseliny (TCA cyklus). Ťažko inhibícia TCA spôsobené zníženou o Got2 prispeje k vzniku žalúdočných vredov. Metabolity aminokyselín, ako je tryptofán a jeho metabolitov in vivo majú rozsiahle úlohu v metabolizme tryptofánu. Najdôležitejšie je, že poruchy metabolizmu tryptofánu môže spôsobiť poruchu TCA. TCA hrať úlohu pri hojení žalúdočný vred [37]. Down-regulácia expresie mRNA v Got2 modelovú skupinu a up-regulácia v CA skupinách bolo predtým preukázané v našom výsledku. Všetky tieto údaje jasne ukazujú, že molekulárne mechanizmus CA liečenie žalúdočný vred úzko koreluje s jeho vyváženie účinkov na TCA. Tieto výsledky sa týkajú aj účinky CA môžu byť sprostredkované bielkoviny, enzýmy, a metabolizmus dráhy.

• Ploche ONE: zmenšená Vyjadrenie Proangiogenic rastových faktorov a ich receptorov pri žalúdočných vredoch všetkých pacientov s cirhózou
• Ploche ONE: In vivo antioxidant a antiulceróznych Činnosť parkii speciosa etanolového extraktu z listov proti Etanol vyvolané žalúdočné vredy u potkanov