PLOS ONE: Metabolomics Juntamente com Multivariada de Dados e Análise Caminho na Biomarkers potenciais em úlcera gástrica e efeitos da intervenção de Corydalis yanhusuo Alcalóide

Abstract

Metabolomics, a análise sistemática dos potenciais metabolitos em uma amostra biológica, tem sido cada vez mais aplicada a biomarcadores descobrindo, identificando caminhos perturbados, medindo alvos terapêuticos, e descobrir novos medicamentos. Ao analisar e verificar a diferença significativa nos perfis metabólicos e as alterações em biomarcadores de metabólitos, metabolômica nos permite entender melhor substância vias metabólicas que podem esclarecer o mecanismo de Medicamentos Tradicional Chinesa (MTC). corydalis yanhusuo
alcalóide (CA) é um componente importante de Qizhiweitong (QZWT) receita médica, que tem sido utilizado para o tratamento de úlcera gástrica durante séculos e o seu mecanismo permanece obscuro completamente. perfil metabólico foi realizada por cromatografia líquida de elevado desempenho combinada com espectrometria de massa de tempo-de-voo (HPLC /ESI-TOF-MS) e em conjunto com a análise de dados multivariados e análise de caminho. O software estatístico Massa Profiller Prossional (MPP) e método estatístico incluindo análise de variância e análise de componentes principais (PCA) foram utilizados para a descoberta de novos biomarcadores potenciais para esclarecer mecanismo da CA no tratamento de ratos injetados com ácido úlcera gástrica. As mudanças no perfil metabólico foram restaurados para seus valores de referência após o tratamento CA de acordo com o score plot do PCA. Dez biomarcadores potenciais diferentes e sete vias metabólicas principais que contribuem para o tratamento da úlcera gástrica foram descobertos e identificados. Entre as vias, sphingophospholipid rede relacionada com o metabolismo e metabolismo de ácidos graxos foram gravemente perturbado. A análise quantitativa tempo de reacção em cadeia da polimerase real (RT-PCR) foram realizadas para avaliar a expressão de genes relacionados com as duas vias para verificar os resultados acima. Os resultados mostram que mudou biomarcadores e caminhos podem fornecer provas para insights sobre os mecanismos de ação da droga e nos permitem aumentar a produtividade em pesquisa para a descoberta de drogas metabolômica

Citation:. Tianjiao L, Shuai W, Xiansheng M, Yongrui B, Shanshan L, Bo G, et al. (2014) Metabolomics Juntamente com Multivariada de Dados e Análise Caminho na Biomarkers potenciais em úlcera gástrica e efeitos da intervenção de Corydalis yanhusuo
Alcalóide. PLoS ONE 9 (1): e82499. doi: 10.1371 /journal.pone.0082499

editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de maio de 2013; Aceito: 24 de outubro de 2013; Publicação: 15 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Tianjiao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Programa chave da Natural Science Foundation do Estado (No. 81.241.111). O Aglient e os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Os autores declaram que o manuscrito não tem relações com Agilent Technologies Co, Ltd., referentes ao emprego, consultoria, patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados etc. Isto é parte de um projeto master~s e se destaca de qualquer projeto interno. Um dos autores correspondentes, Xiaorong Ran, é empregado por Agilent Technologies Co, Ltd., que ajudou no estudo de design, experiências e /ou analisa. Lei Wang também é empregado por Agilent Technologies Co, Ltd., que tem supervisionado o estudo e ajudou a modificar os erros gramaticais no manuscrito. Os autores confirmam que o emprego pela Agilent Technologoies não altera a sua adesão a qualquer uma das políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

úlcera gástrica é uma doença generalizada que aflige muitas pessoas em todo o mundo devido à sua morbidade mais e mais alto. De acordo com as estatísticas de 2005, a incidência de úlcera gástrica foi de até 80%, especialmente mundo ocidental. Ele tem 40-80% da frequência de repetição de todo o mundo. úlcera gástrica em humanos ocorrem com freqüência por causa de vários fatores endógenos e exógenos, como estresse, tabagismo, deficiências nutricionais, ácido clorídrico, a pepsina, Helicobacter pylori
, não-esteróides uso drogas anti-inflamatórias (NSAIDs), álcool e infecção [1]. Enquanto estes factores têm sido pensado para ser envolvido na patogénese de úlceras gástricas, o mecanismo de formação de úlcera ainda não é compreendido com precisão [2], [3]. TCM ganha cada vez mais aceitação mundial nos últimos anos e é geralmente considerado como sendo natural e inofensivo [4], [5]. Terapias chamados coletivamente de TCM são comumente usado para tratar úlcera gástrica, que inclui a fitoterapia chinesa e prescrição etc.

QZWT prescrição composto por Corydalis yanhusuo
, Radix Glycyrrhizae
e Radix Bupleuri
ect. têm sido amplamente utilizados para curar úlcera gástrica durante séculos na China, devido ao seu desempenho terapêutico significativo na aplicação clínica [8] - [10]. Nós purificado CA a partir de plantas "Corydalis yanhusuo W. T. Wang" com a pureza de 92%. Os componentes químicos da Corydalis yanhusuo
foram investigadas em nosso estudo anterior. Tetrahydropalmatine, corydaline, protopine et al foram as atividades biológicas do Corydalis yanhusuo
. Foram examinadas as estruturas dos componentes. CA é reconhecido como o principal componente activo em corydalis yanhusuo
[6], e demonstrado ter efeito anti-úlcera ser utilizado na prática clínica chinês por muitos anos [7]. Também tem sido relatado que o CA possui efeito anti-inflamatório [8], [9]. No entanto, o mecanismo molecular detalhada de CA no tratamento da úlcera gástrica não é bem compreendido.

para explicar o mecanismo de acção de drogas, metabolômicas metodologia tem sido amplamente utilizado [10]. Metabolómica é um componente importante de biologia de sistemas, especialmente para determinar o perfil metabólico global, através da detecção de milhares de pequenas e grandes moléculas em vários meios que varia a partir de culturas de células de fluidos biológicos humanos, tais como a urina, saliva e sangue [11], [12] , [13]. Ele tem um grande impacto na investigação de descoberta de biomarcadores e identificando caminhos perturbados devido a doença ou tratamento da toxicodependência [14]. Ao analisar e verificar os biomarcadores precoces específicas de uma doença, metabolômica nos permite entender melhor substância vias metabólicas que podem esclarecer o mecanismo de ação [15].

Os recentes avanços da instrumentação e computação permitiram a análise simultânea de um grande número de metabolitos. HPLC juntamente com MS tem sido provado ser uma combinação eficaz para metabolitos identificações e quantificações devido à sua excelente resolução e sensibilidade. O objetivo do estudo era obter uma visão sistemática para dissecar o mecanismo do CA como um tratamento eficaz para a úlcera gástrica. As vias bioquímicas específicas e únicas de eficácia da droga possa ser identificado, quando acoplados com técnicas de análise de dados multivariados. O objetivo deste estudo é identificar vários metabolitos que poderiam facilitar a compreensão do mecanismo do CA ação e ajudar a sua incorporação em melhoria futura da terapia TCM.

Materiais e Métodos

2.1 Declaração de ética

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os protocolos de animais aprovados e diretrizes estabelecidas pela Medicina Comitê de revisão Ética para Experimentação animal da Universidade de Liaoning de Medicina tradicional chinesa.
Manuseamento

2.2 animal e Preparação de Amostras

ratos SD macho de sete semanas de idade, pesando 200-250 g, foram fornecidos pelo centro animal experimental da Universidade de Medicina de Dalian. O cuidado e tratamento dos ratos estavam de acordo com o padrão de Specific Pathogen gratuito. úlcera gástrica foi induzida em ratos de acordo com o método em um relatório anterior, com uma ligeira modificação [16], [17]. Três dias após a produção de úlcera gástrica, os ratos foram divididos aleatoriamente em cinco grupos: controlo, modelo, grupo de dose elevada de Ca (32,4 mg /ml), grupo de dose média CA (10,8 mg /ml) e grupo de dose baixa CA (3,6 mg /ml). Todos os ratos, em grupos foram administrados oralmente a solução de grupo activo 1,5 ml uma vez ao dia (grupos de modelos e de controlo com solução salina), durante 7 dias. Os ratos foram proibidos qualquer alimento durante 12 h antes dos experimentos, mas foi permitido o acesso à água livremente.

No último dia, os ratos foram profundamente anestesiados e sacrificados. Recolheu-se sangue, plasma e soro foram separadas por meio de centrifugação a 3000 rpm durante 15 min a 4 ° C. As amostras de plasma foram recolhidas e armazenadas a -80 ° C de flash congeladas em azoto líquido até a análise foram realizadas metaboloma. Em seguida, os estômagos foram cortadas ao longo da curvatura maior, lavados com solução salina. A área da úlcera foi medida por uma bússola para medir o índice de úlcera. A área da úlcera é igual à largura das vezes úlcera do comprimento da úlcera. Para a avaliação histológica, amostras de tecido gástrico foram fixados em formalina tamponada neutra, durante 24 h. Estômago secções foram desidratadas com etanol graduado, passados ​​através de xileno, e embutidos em parafina. As secções de parafina (5 mm de espessura) foram corados com hematoxilina /eosina (HE). Os outros tecidos ulceradas gástricos foram rapidamente removidos e congelados em nitrogênio líquido até que a extração de RNA de tecido total.

2.3 Metabolic Profiling

2.3.1 Cromatografia.

A cromatografia foi realizada utilizando um sistema de série HPLC Agilent 1100 equipado com bomba quaternária, desgaseificador em linha, amostrador automático, e compartimento de coluna com termostato. O volume de injecção foi fixada em 4 mL. Todas as amostras foram mantidas a 4 ° C durante a análise. A separação foi realizada numa 4.6 * 100 mm, ZORBAX SB-C18 (Agilent, EUA). A temperatura da coluna foi fixada em 45 ° C. As fases móveis foram feitos de ácido fórmico a 0,1% em água (solvente B) e 0,1% de ácido fórmico em acetonitrilo (solvente A), a taxa de fluxo foi definido como 1 ml /min com 01:03 razão de separação, o gradiente foi utilizado como seguinte maneira: um gradiente linear de 70- 33% B ao longo de 5,0 min inicial-, 33 -98% de B ao longo 5,0-12,0 min. O eluente foi introduzida no espectrómetro de massa diretamente. Depois de cada injecção de 10 amostras, uma amostra combinada como amostra QC seguido de uma peça em bruto foi injectado, a fim de garantir a estabilidade e a reprodutibilidade dos sistemas de LC-MS.

2.3.2 espectrometria de massa.

para a espectrometria de massa, foi utilizado o Agilent 6220 TOF-MS com uma fonte de ionização por electrospray (ESI) no modo negativo. O caudal de gás de morrer (N2) foi de 9 L /min. O nebulizador foi fixada em 45 psi. As outras condições óptimas foram os seguintes: morrendo temperatura do gás em 350 ° C, a tensão fragmento de 120 V. Os dados foram coletados no modo full-scan de m /z 50-1050 amu sobre 0-12 min. Os dados de MS foram recolhidos em modo de centróide.

2.3.3 análise multivariada de dados.

procedimento de análise de dados é mostrado na Fig. 1. O algoritmo Molecular Extractor Característica (MFE) no software de análise qualitativa Mass Hunter foi utilizado para extrair recursos não identificada, compostos não-alvo molecular - em cada um dos dados. O algoritmo de MFE olha para sinais de massa (iões) que são co-variante no tempo, considera possíveis relações químicas (isótopos, aductos, dímeros, vários estados de carga), e gera um espectro de massa composto do cromatograma e o composto extraído para cada característica molecular. A lista composto extraído para cada arquivo foi exportado como arquivo Formato Composto Exchange (. CEF) para mais Mass Profiler Professional (versão B.2.00, Agilent) análise estatística. Os arquivos de recursos resultantes para cada amostra foram processados ​​por análise de variância e PCA análise utilizando o software MPP, que alinhados, normalizada, visualizado e filtrada as características moleculares (MFS), para processamento adicional [18], [19], [20], [ ,,,0],21]. Posteriormente, agrupamento hierárquico (estado das árvores) foi aplicado para os arquivos de dados. análise de agrupamento hierárquico é um método estatístico de amostras do grupo sem vigilância em diferentes clusters ou galhos da árvore hierárquica. Desta forma, as relações entre os diferentes grupos são mostrados. A árvore condição foi apresentado como um mapa de calor. A identidade de biomarcadores com alterações significativas nos grupos foi determinada por características ID do browser do MPP.

2.3.4 Biomarkers Identificação.

A identificação de potenciais biomarcadores foi determinada por Q-TOF (Xevo G2). A energia de colisão é 35ev MS, e os dados foram obtidos no modo de iões negativos, (MassLn1 V4.) X software foi utilizado para análise de dados. As identidades dos metabolitos específicas foram confirmadas por comparação de elementos de informação dos seus espectros de massa usando a informação composição elementar fornecido pelo software.

2.3.5 Rede e Pathway Analysis.

MPP software foi empregue a todos significativa (alteração da pasta > 2) até metabólitos regulamentados e para baixo regulamentados e vias biológicas relacionadas. Os marcadores potenciais identificados foram comparados com a razão exata de massa de carga em alguns bancos de dados, incluindo HMDB, KEGG, METLIN, LIPID MAPS e PubChem, para descobrir vias relacionadas. T-teste e dobrá-Alter foram usadas para determinar a significância estatística nas vias. valor de P < 0,05 e alteração da pasta > 2 foi considerado como critérios para estatisticamente significativa e seria seleccionado

2,6 dados moleculares

O ARN total foi extraído a partir de tecidos do estômago, incluindo o controlo, do modelo e CA. grupos utilizando um reagente TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) segundo as instruções do fabricante. O ADNc foi sintetizado a partir de ARN total (1 ug) usando TransScript da primeira cadeia de cDNA Synthesis Kit SuperMix (Beijing Biotech transgen, China). Quantitative PCR em tempo real (CFX96, Bio-Rad, EUA) foi realizada utilizando um kit de TransStart ™ superior verde qPCR SuperMix (Beijing Biotech transgen, China). Iniciadores utilizados para amplificar S1Pr1, S1Pr3, SphK1, Got2 e Fabp1 eram de Invitrogen (S1Pr1: GenBank acc não NM_017301, S1Pr3:.. GenBank acc não XM_225216, SphK1:.. GenBank acc não NM_133386, Got2:... GenBank acc Não . NM_013177.2, Fabp1:.. GenBank acc não NM_012556.2) e a expressão destes transcritos foi quantificado contra o gene de manutenção β-actina, que foi amplificado utilizando os iniciadores 5'-TGGCACCACACTTTCTACAATGA-3 'e 5'-AGGGACAACACAGCCTGGAT- 3 '. Os níveis de expressão de genes alvo foram analisados ​​utilizando o sistema de Gestor de CFX (Bio-Rad, EUA).

2.7 Análise Estatística

Os dados são expressos como média ± SEM. SPSS 19.0 para Windows foi utilizado para a análise estatística. Os dados foram analisados ​​utilizando a análise de variância, com p < 0,05 definido como o nível de significância estatística

Resultado

3.1 Efeito da CA no ácido acético induzida injetado úlcera gástrica modelo
.

o modelo experimental de lesão da mucosa gástrica induzida por ácido acético em ratos injectados é muitas vezes empregada para rastrear os compostos para a actividade anti-úlcera na medida em que serve como a principal causa de úlceras gástricas em seres humanos [22]. ácido acético injectado induzida por lesão da mucosa gástrica intensa na formação de úlceras no grupo modelo (Fig. 2A) ratos que tem uma diferença significativa em comparação com o grupo de controlo (Fig. 2B). observação patológica foi usada para confirmé o dano de nas camadas superficiais da mucosa gástrica ulteriorly induzida por ácido acético. úlceras gástricas induzidas por ácido acético (Fig. 2C) tem um efeito de erosão para a mucosa, que foi acompanhada por fractura muscular e infiltração de células inflamatórias nas camadas em comparação com o controlo (Fig. 2D). Os resultados provaram que o modelo de úlcera gástrica foi reproduzido com sucesso. Os resultados do tempo de curso mostrado na Fig. 2E ilustram que a área da úlcera em ratos tratados com o CA permaneceu significativamente mais baixa quando comparada com os respectivos valores em ratos modelo no sétimo dia, de modo que escolheram amostras sétimo dia de para análise. Para avaliar os efeitos de CA, tal como demonstrado na Fig. 2F, a área da úlcera gástrica em grupos de dose de Ca foi significativamente diminuída em comparação com o grupo de modelo (p < 0,01). Os resultados experimentais sugerem que a AC pode efectivamente curar a úlcera gástrica, particularmente o grupo de dose média. Parece que existe uma sobreposição significativa entre as vias moleculares neuronais envolvidos na gênese da úlcera e depressão. Portanto, não é surpreendente que a medicação para o tratamento de episódios depressivos também podem exercer efeito protector potente contra a úlcera gástrica [23]. A razão pela qual a CA grupo de dose média têm um efeito terapêutico melhor do que o grupo de dose elevada pode ser o grupo de dose elevada CA tem um papel para inibir o nervo. O efeito da CA foi examinada para investigar o mecanismo.

3.2 metabolômica Estudo

3.2.1 aquisição e processamento de dados do perfil metabólico.

O representante totais cromatogramas iónicos ( TIC) de amostras de plasma derivadas de controlo, modelo, e os grupos de dose de Ca em modos negativos são apresentados na Fig. 3 usando as condições de LC-MS óptimas acima descritas. metabolitos de baixo peso molecular poderiam ser separados bem no curto espaço de tempo de 15 min. A fim de visualizar melhor as semelhanças e as diferenças subtis entre estes conjuntos de dados complexos, múltiplos métodos de reconhecimento de padrões foram utilizados para o fenótipo do metaboloma de plasma de ratos. Aqui, a análise de agrupamento hierárquico e PCA foram usados ​​para classificar os fenótipos metabólicos e identificar os metabólitos diferenciação de. análise de agrupamento hierárquico dos dados metabolômica mostrou segregação distinta entre o controle, o grupo de modelo e grupo de dose CA (Fig. 4). Na pontuação PCA, cada ponto representa uma amostra individual. Os resultados dessa análise são apresentados como parcelas de pontuação indicando a dispersão das amostras, o que indica composições metabolômica semelhantes quando agrupadas e de composição metabolomes diferentes quando disperso. A pontuação trama PCA poderia dividir as diferentes amostras de plasma em diferentes blocos, respectivamente, o que sugere que os perfis metabólicos foram alterados. Com relação ao analista de informação da PCA em nossa experiência mostrou na Fig. 5, os grupos de controle e modelo foram significativamente divididos em duas classes, indicando que o modelo de úlcera gástrica induzida por ácido acético foi reproduzido com sucesso. Mais mudanças sutis podem ser encontrados pelos reconhecimento de padrões gráficos abordagem de pontuação de PCA. resultados dessa análise mostrar que o grupo modelo era longe dos quatro grupos restantes, indicando que mudou padrão metabólico resultou pode ser significativamente diferente dos outros induzida por ácido acético. A posição do grupo de tratamento estava próximo ao grupo controle, sugerindo que o padrão metabólico alterado foi causado por CA. Os resultados manifesto que a CA poderia mudar o estado metabólico anormal e pode ter um mecanismo diferente tratamento de úlcera gástrica induzida por ácido acético.

3.2.2 Identificação de potenciais biomarcadores.

A pequena molécula metabólitos de diferenças significativas (teste t, p < 0,05) foram pesquisados ​​pelo software da MPP. Os marcadores potenciais foram identificados usando o "navegador ID" para pesquisar na base de dados Metlin (http://metlin.scripps.edu/) e comparada com a razão de carga de massa preciso em alguns bancos de dados, incluindo HMDB (http: //www. hmdb.org/), KEGG (http://www.genome.jp/kegg/), LIPID MAPS (http://dev.lipidmaps.org:25424/), e PubChem (http: //pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/). Podemos saber o nome provável de potenciais biomarcadores através da primeira etapa. No presente estudo, 10 biomarcadores potenciais foram identificados (Tabela 1). A massa molecular precisa dos compostos com alterações significativas entre os grupos foi determinada dentro dos erros de medição (< 5 ppm) por Waters Xevo G2 QTOF, e, entretanto, a composição elementar potencial, foram obtidos grau de insaturação e abundância isotópica fraccionada dos compostos. A fórmula molecular presumida foi procurado em ChemSpider (http://www.chemspider.com/), HMDB e outros bancos de dados para identificar as possíveis constituições químicas, e os dados MS /MS foram selecionados de acordo com as potenciais estruturas dos íons. A esfingosina-1-fosfato (S1P) e ácido esteárico foram tomados como exemplos para ilustrar fragmentos da estrutura e o processo de avaliação. A espectrometria de massa de informação primária e secundária foi analisada por Masslynx (4,1 visão, Waters) de software, em comparação com a base de dados, e os fragmentos de iões de 379,2488 (C _{18H 38NO 5P) foram mostrados na Fig. 6 A. Os principais iões do fragmento analisadas por triagem MS /MS foram m /z 224,080, 165,1254 e 82,0238, o que poderia corresponder a perdeu C 7H 15NO 5P, C 11H 17O, C 4H 4NO respectivamente. Finalmente, especulou-se como referindo-se depois de S1P e de acordo com o seu tamanho polaridade. Enquanto isso, os fragmentos de iões de ácido esteárico 284.2715 (C 18H 36o 2) (Fig. 6 B) foram 212,2419 (C 15H 32), 143,1359 (C 9H 19o), 117,0962 (C 6H 13o 2) e 83,0962 (C 6H 11).}

Os biomarcadores descritos acima foram provadas têm uma estreita relação com a formação e tratamento da úlcera gástrica. O significativamente acima regulada D-glicose, lisina, ácido úrico, ácido pirúvico, corticosterona, esfingosina-1-fosfato e regulada negativamente triptofano, glicocolato, ácido hexadecanedioic, ácido esteárico foram observadas no grupo de modelo em comparação com o grupo de controlo (Fig. 7 ). Esta diferença de metabólitos pode denotar o seu potencial como biomarcadores alvo para diferenciar úlcera gástrica e estados normais. Monitorização das alterações destes metabolitos podem prever o desenvolvimento da úlcera gástrica. Os biomarcadores 1, 2, 3, 4, 7, 8 foram diminuiu após o tratamento da CA, em contrário, os outros biomarcadores foram aumentadas. Além disso, a fim de caracterizar os efeitos anti-úlcera de CA com mais clareza, as alterações nas concentrações relativas de metabolitos alvo identificados em diferentes grupos foi analisado, verificou-se que o conteúdo destes marcadores chave mais perto grupo normal. Os resultados indicam o mecanismo para o tratamento de úlceras gástricas pode ser conseguida através da regulação destes marcadores significativamente e a sua interacção semelhante à da Fig. 8. Por exemplo, o ácido esteárico que chamado 17FA, tem relação com ácido tápsico embora a proteína Fabp1 (gordos proteína de ligação de ácido 1). A rede não só indica a interação entre biomarcadores, mas também fornece informações do potencial de proteínas, genes, enzimas e processos biológicos. Ele contribui para a descoberta de alvo durante a ocorrência e tratamento de úlcera gástrica e é condutora para o desenvolvimento de novas drogas para curar úlcera gástrica.

3.3 Determinação de níveis de mRNA para confirmar os biomarcadores

para confirmar nossas descobertas metabolômica, precisamos de alguns dados moleculares, por isso, identificou 5 mRNAs que estão relacionados com os 4 biomarcadores potenciais e 2 vias metabólicas com RT-PCR. o metabolismo dos esfingolípidos, incluindo S1Pr1, S1Pr3 e SphK1 foram examinados como mostrado na Fig. 8. Os resultados estão resumidos na Fig. 9. O nível de mRNA de S1Pr1, SIPr3 e SphK1 foram significativamente aumentado no grupo de modelo, os níveis de expressão foram 5,21, 2,54, 6,57 vezes em comparação com o grupo controle, que estava de acordo com os nossos resultados e os dados anteriores. Após o tratamento CA, os níveis de S1Pr1, S1Pr3 e SphK1 de expressão foram de volta ao nível basal. S1P é formado por duas cinases, esfingosina-cinase 1 e 2 (e SphK1 SphK2), mas não foram observadas diferenças na expressão SphK2 entre todos os grupos (dados não apresentados), o resultado foi consistente com as nossas constatações de rede. Aqui, podemos explicar um mecanismo potencial da CA no tratamento de úlcera gástrica, bloqueando S1P aumentando. Encontramos também uma expressão diminuída de Fabp1 e Got2 no grupo de modelo (Fig. 9), em comparação com o grupo controle. Mas CA faz grupos estavam perto com o grupo controle, que confirmou que o efeito terapêutico do CA estava relacionada com o metabolismo de ácidos graxos a partir do nível molecular.

3.4 Pathway Analysis

Uma análise mais detalhada das vias e redes influenciados por úlcera gástrica foi realizada por MPP. As vias mostras obtidos na Tabela 2. Usamos a de alta qualidade KEGG vias metabólicas como a base de conhecimento backend para identificar as vias mais relevantes, tais como o metabolismo dos esfingolípidos, ácido ciclo tricarboxylicacidcycle, metabolismo biotina e assim por diante, em que as vias 7 únicas ( listado no Quadro 1) para o grupo de modelo foi identificado. biomarcadores potenciais relacionadas com o metabolismo do ácido fólico, o metabolismo do ácido gordo, e as vias do metabolismo de Esfingolipídeos também foram conformados. Dos 6 metabolitos distintos identificados a partir destas vias, muitos estão em várias fases de progresso da úlcera gástrica. Alguns metabolitos significativamente alterados como glicocolato, ácido hexadecanedioic, e ácido esteárico ter sido encontrado e utilizado para explicar o mecanismo de ácidos gordos. Estes resultados sugerem que estas vias de destino mostrar as perturbações marcantes sobre a formação de úlcera gástrica e pode contribuir para o desenvolvimento da úlcera gástrica.

Discussão

As úlceras gástricas em seres humanos se repetem com frequência, ea dificuldade em tratá-los é indicado pelo ditado "uma vez que uma úlcera, sempre uma úlcera" [24]. Muitos factores podem aumentar a incidência de úlcera gástrica, mas o mecanismo não foi claramente compreendido. Por conseguinte, a eficácia do tratamento com fármaco depende não só na redução de factores prejudiciais, mas também sobre os metabolitos alterados que regulam a via de metabolismo. Em particular, a descoberta de marcadores que predizem o risco de úlcera gástrica irá proporcionar uma oportunidade para diagnosticar e permitir o tratamento farmacológico oportuna. QZWT foi usada para curar úlcera gástrica durante muitos anos na Ásia, embora o seu mecanismo permanece obscuro. Metabolómica juntamente com as ferramentas de dados multivariados que quantificam simultaneamente milhares de metabolitos em um organismo vivo foi utilizado para analisar os biomarcadores na úlcera gástrica [25]. Além disso, a compreensão de biomarcadores provocou novo interesse nas áreas de programas de descoberta de drogas e monitoramento de doenças, proporcionando valiosa em-avista sobre mecanismos da doença complexas [26]. Este estudo foi concebido, por conseguinte, para melhor elucidar o mecanismo subjacente de CA em regulação úlcera gástrica das vias metabólicas em vista global.

O modelo de úlcera gástrica em ratos foi reproduzido com sucesso. As amostras de plasma foram analisados ​​por HPLC /ESI-TOF-MS e análise estatística multivariada. Os resultados mostraram que a área da úlcera e perfis metabólicos dinâmicos após o tratamento CA foram fechadas para o grupo de controlo, demonstrando que o CA tinha eficácia terapêutica. Segundo a análise metabolômica, 10 biomarcadores potenciais e 7 vias metabólicas relacionadas foram identificados em nosso estudo. A D-glucose, lisina significativamente regulada negativamente, o ácido úrico, ácido pirúvico, corticosterona, esfingosina-1-fosfato e regulada para cima triptofano, glicocolato, ácido hexadecanedioic, ácido esteárico foram observadas no grupo de CA em comparação com o grupo do modelo. Além disso, o metabolismo do ácido fólico, o metabolismo do ácido gordo, e o metabolismo dos esfingolípidos e muitos outros metabolismo foram confirmados para ter um impacto sobre a úlcera gástrica. Temos determinar a expressão de ARNm relacionadas com o metabolismo dos esfingolípidos e metabolismo de ácidos gordos para validar o mecanismo. Muitas outras proteínas potenciais, genes, enzimas e bioprocessos fechado para outras vias precisam futuros experimentos para validar.

Ao analisar e verificar os biomarcadores precoces específicas de uma doença, metabolômica nos permite entender melhor os processos patológicos e vias metabólicas substância . Acreditamos que o biomarcador e via análises têm um grande potencial para explorar e esclarecer a ação terapêutica do TCM. No presente estudo, caracterizamos interacção biomarcador redes envolvem proteínas, genes, enzimas e bioprocesso como mostrado na Fig. 8. S1P ato extracelularmente como um ligando para os receptores específicos-S1PRs, é agora reconhecido como regulador de diversos processos fisiológicos e patológicos, incluindo doenças inflamatórias, tais como artrite reumatóide, doença inflamatória dos intestinos, sepsia e [27], [28]. A inflamação que ocorre na mucosa do tracto gastrointestinal, desse modo, faz com que a úlcera gastrointestinal [29]. Os nossos resultados mostram que a AC pode diminuir a expressão de S1P e seus receptores, incluindo S1Pr1 e S1Pr3, para aliviar problemas de inflamação para aliviar a formação de úlceras gástricas [30]. S1P é formado por SphK1 SphK2 e [31]. SphK1 pode activa a via de NF-kB, que iniciada pela grande molécula de sinalização inflamatória TNF-α. Em breve, o NF-kB e TNF-α está intimamente relacionado para formar e curar úlcera gástrica [32], [33]. Nós também descobrimos que a deficiência de SphK1 (não SphK2) inibe significativamente a úlcera gástrica, indicando que SphK1 pode desempenhar um papel fundamental na úlcera gástrica. Assim, o metabolismo dos esfingolípidos pode ser um alvo viável para o tratamento da úlcera gástrica.

O ácido esteárico, glicocolato e ácido hexadecanedioic mudou causar metabolismo de ácidos graxos transtorno de encerramento para a incidência e reabilitação de úlcera gástrica [34], [35] . ácidos gordos, incluindo o ácido esteárico etc, comumente vistos como a fonte de energia, têm atraído o interesse de pesquisa e de saúde pública, devido aos seus efeitos na saúde humana e doenças. Os ácidos graxos são benéficos para a promoção da saúde,. ácido esteárico, glicocolato e hexadecanedioic são regulados por Fabp1, a enzima de proteína gordo 1. Na análise de RT-PCR de ligação de ácido, a baixa expressão da Fabp1 no grupo modelo sugere que a actividade de inibição da Fabp1 pode reduzir o ácido esteárico, glicocolato e ácido hexadecanedioic e levar a distúrbios do metabolismo de ácidos graxos. Portanto aumentou a resposta inflamatória e disfunção mitocondrial e promover a formação de úlcera. No entanto, a CA pode equilibrar esta desordem através do aumento da expressão de Fabp1 [36]. Glutâmico oxaloacético transaminase-2 (Got2) é uma enzima importante no ciclo do ácido tricarboxylicacidcycle (ciclo de TCA). A inibição de TCA severamente causada pela diminuição da Got2 irá contribuir para a formação de úlcera gástrica. Os metabolitos de aminoácidos, tais como o triptofano e os seus metabolitos in vivo têm um grande papel no metabolismo de triptofano. O mais importante é que os distúrbios do metabolismo de triptofano podem causar transtorno TCA. TCA desempenhar um papel na cicatrização da úlcera gástrica [37]. Down-regulação da expressão do mRNA Got2 no grupo modelo e aumento da regulação em grupos CA foram previamente demonstrado em nosso resultado. Todos estes dados indicam claramente que o mecanismo molecular de CA tratamento de úlcera gástrica foi intimamente correlacionados com os seus efeitos no balanço de TCA. Estes resultados implicam os efeitos CA podem ser mediados através de proteínas, enzimas, e via de metabolismo.

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