PLOS ONE: La metabolómica junto con multivariado y análisis de datos en Camino Los biomarcadores potenciales en la úlcera gástrica y efectos de la intervención de Corydalis yanhusuo Alkaloid

Extracto

La metabolómica, el análisis sistemático de los posibles metabolitos en una muestra biológica, ha sido cada vez más aplicada al descubrimiento de biomarcadores, la identificación de las vías perturbado, la medición de los objetivos terapéuticos, y el descubrimiento de nuevos fármacos. Mediante el análisis y la verificación de la diferencia significativa en los perfiles metabólicos y cambios de biomarcadores metabolito, la metabolómica nos permite entender mejor la sustancia vías metabólicas que pueden aclarar el mecanismo de la medicina tradicional china (MTC). Corydalis yanhusuo
alcaloide (CA) es un componente importante de Qizhiweitong (QZWT) con receta que se ha utilizado para el tratamiento de la úlcera gástrica durante siglos y su mecanismo no está claro por completo. metabolito de perfiles se realizó por cromatografía líquida de alta resolución combinada con espectrometría de masas de tiempo de vuelo (HPLC /ESI-TOF-MS) y en conjunto con el análisis de datos multivariados y análisis de la vía. El software de estadística de la misa Profiller Prossional (MPP) y el método estadístico que incluye ANOVA y análisis de componentes principales (PCA) se utilizaron para el descubrimiento de nuevos biomarcadores potenciales para aclarar el mecanismo de CA en el tratamiento de las ratas inyectadas con ácido úlcera gástrica. Los cambios en los perfiles metabólicos vuelven a sus valores iniciales después del tratamiento CA de acuerdo con las parcelas de puntuación de PCA. Diez biomarcadores potenciales diferentes y siete rutas metabólicas clave que contribuyen al tratamiento de la úlcera gástrica fueron descubiertos e identificados. Entre las vías, sphingophospholipid red relacionada con el metabolismo y el metabolismo de los ácidos grasos eran sumamente perturbado. Se realizó análisis cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para evaluar la expresión de genes relacionados con las dos vías para la verificación de los resultados anteriores. Los resultados muestran que el cambio de biomarcadores y vías pueden proporcionar evidencia de información sobre los mecanismos de acción de fármacos y nos permitirá aumentar la productividad de la investigación hacia el descubrimiento de drogas metabolómica

Visto:. Tianjiao L, W Shuai, Xiansheng M, Yongrui B, Shanshan G, Bo L, et al. (2014) La metabolómica junto con multivariado y análisis de datos en Camino Los biomarcadores potenciales en la úlcera gástrica y efectos de la intervención de Corydalis yanhusuo
de alcaloides. PLoS ONE 9 (1): e82499. doi: 10.1371 /journal.pone.0082499

Editor: Rakesh K. Srivastava, de la Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América

Recibido: 15 de mayo de 2013; Aceptado: 24 Octubre 2013; Publicado: 15 Enero 2014

Derechos de Autor © 2014 Tianjiao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Programa clave de la Fundación de Ciencias Naturales del Estado (Nº 81241111). El Aglient y los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:. Los autores declaran que su manuscrito no tiene relaciones con Agilent Technologies Co, Ltd, en relación con el empleo, consultoría, patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados etc. Esto es parte de un proyecto master~s y se distingue de cualquier proyecto interno. Uno de los autores correspondientes, Xiaorong Ran, se emplea por Agilent Technologies Co, Ltd, que ayudó en el estudio de diseño de experimentos, y /o análisis. Lei Wang también se emplea por Agilent Technologies Co, Ltd, que ha supervisado el estudio y ayudó en la modificación de los errores gramaticales en el manuscrito. Los autores confirman que el empleo por Agilent Technologoies no altera su adhesión a cualquiera de las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.

Introducción

La úlcera gástrica es una enfermedad muy extendida que afecta a muchas personas en todo el mundo debido a su mayor y una mayor morbilidad. De acuerdo con las estadísticas de 2005, la incidencia de úlcera gástrica fue hasta el 80%, sobre todo el mundo occidental. Tiene 40-80% de la frecuencia recurrente en todo el mundo. úlcera gástrica en humanos se producen con frecuencia debido a diversos factores endógenos y exógenos, tales como el estrés, el tabaquismo, deficiencias nutricionales, ácido clorhídrico, pepsina, Helicobacter pylori
, no esteroides anti-inflamatorios consumo de drogas (AINE), el alcohol y infección [1]. Si bien estos factores han sido cree que participan en la patogénesis de las úlceras gástricas, el mecanismo de formación de la úlcera no es todavía entendido precisamente [2], [3]. TCM ha ganado aceptación en todo el mundo en los últimos años y se considera generalmente como ser natural e inofensivo [4], [5]. Terapias llamadas colectivamente la medicina tradicional china se usan comúnmente para tratar la úlcera gástrica, la cual incluye la medicina herbal china y la prescripción etc.

receta QZWT compone de Corydalis yanhusuo
, Radix Glycyrrhizae
y Radix Bupleuri
ect. se han utilizado ampliamente para curar la úlcera gástrica durante siglos en China, debido a su rendimiento terapéutico significativo en la aplicación clínica [8] - [10]. Se purificó CA de las plantas "Corydalis yanhusuo W.T. Wang" con la pureza de 92%. Los componentes químicos de los Corydalis yanhusuo
han sido investigados en nuestro estudio anterior. Tetrahidropalmatina, coridalina, protopine et al fueron las actividades biológicas de Corydalis yanhusuo
. Se examinaron las estructuras de los constituyentes. CA es reconocido como el principal componente activo en Corydalis yanhusuo
[6], y demostró tener efecto antiulceroso que se utiliza en la práctica clínica china durante muchos años [7]. También se ha informado de que CA posee efecto anti-inflamatorio [8], [9]. Sin embargo, el mecanismo molecular detallado de CA en el tratamiento de la úlcera gástrica no se entiende bien.

Para explicar el mecanismo de acción de los fármacos, la metodología de la metabolómica ha sido ampliamente utilizado [10]. Metabolómica es un componente importante de la biología de sistemas, especialmente en la determinación del perfil metabólico global mediante la detección de miles de moléculas pequeñas y grandes en diversos medios que van desde cultivos de células a los fluidos biológicos humanos tales como la orina, la saliva y la sangre [11], [12] , [13]. Tiene un gran impacto en la investigación de descubrimiento de biomarcadores, y la identificación de las vías perturbado debido a la enfermedad o el tratamiento de drogas [14]. Mediante el análisis y la verificación de los biomarcadores específicos para la primera de una enfermedad, la metabolómica permite comprender mejor las vías metabólicas de sustancias que pueden aclarar el mecanismo de acción [15].

Los recientes avances de la instrumentación e informática han permitido el análisis simultáneo de un gran número de metabolitos. HPLC junto con MS se ha demostrado ser una combinación eficaz para los metabolitos identificaciones y cuantificaciones debido a su excelente resolución y sensibilidad. El objetivo del estudio era obtener una visión sistemática para diseccionar el mecanismo de CA como un tratamiento eficaz para la úlcera gástrica. Las vías bioquímicas específicas y únicas de la eficacia del fármaco pueden ser identificados, cuando se combina con técnicas de análisis de datos multivariados. El propósito de este estudio es identificar varios metabolitos que podrían facilitar la comprensión del mecanismo de acción de CA y la ayuda de su incorporación en la futura mejora de la terapia de la medicina tradicional china.

Materiales y Métodos

2.1 Declaraciones éticas

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos y directrices establecidas por animales aprobados comité de ética de la medicina para los experimentos con animales de la Universidad de Liaoning de Medicina tradicional china.
Manipulación

2.2 animales y preparación de la muestra

Siete semanas de edad ratas SD macho de 200-250 g de peso, fueron proporcionados por el centro de animales experimental de la Universidad médica de Dalian. El cuidado y el manejo de las ratas eran de conformidad con el estándar de libres de patógenos específicos. Úlcera gástrica se indujo en las ratas de acuerdo con el método en un informe anterior con una ligera modificación [16], [17]. Tres días después de la producción de la úlcera gástrica, las ratas se distribuyeron aleatoriamente en cinco grupos: control, modelo, grupo de dosis alta CA (32,4 mg /ml), grupo de dosis media CA (10,8 mg /ml) y CA grupo de dosis baja (3,6 mg /ml). Todas las ratas, en grupos se les administró por vía oral de la solución de grupo activo 1,5 ml (grupos de modelos y de control con solución salina) una vez al día durante 7 días. Las ratas se les prohibió cualquier alimento durante 12 h antes de los experimentos, pero se les permitió el acceso al agua libremente.

En el último día, las ratas fueron profundamente anestesiados y luego sacrificados. se recogió la sangre, plasma y suero se separaron mediante centrifugación a 3000 rpm durante 15 min a 4 ° C. Las muestras de plasma se recogieron y se almacenaron a -80 ° C se llevaron a cabo de flash congelado en nitrógeno líquido hasta el análisis metabolómica. Entonces, los estómagos se cortaron a lo largo de la curvatura mayor, se lavaron con solución salina. El área de la úlcera se midió por una brújula para medir el índice de úlcera. El área de la úlcera es igual a la anchura de los tiempos de úlcera de la longitud de la úlcera. Para la evaluación histológica, muestras de tejido gástrico se fijaron en formalina tamponada neutra durante 24 h. secciones del estómago se deshidrataron con etanol clasificado, pasó a través de xileno, y embebidos en parafina. Secciones de parafina (5 mm de espesor) se tiñeron con hematoxilina /eosina (HE). Los otros tejidos ulcerados gástricos se retiraron y se congelaron en nitrógeno líquido rápidamente hasta la extracción de ARN total de tejido.

2,3 perfiles metabólicos

cromatografía.

se realizó 2.3.1 Cromatografía utilizando un sistema de HPLC serie Agilent 1100 equipado con bomba cuaternaria, desgasificador en línea, muestreador automático, y compartimento de columna termostatizado. El volumen de inyección fue fijada en 4 l. Todas las muestras se mantuvieron a 4 ° C durante el análisis. La separación se realizó en un * 100 mm 4.6, columna ZORBAX SB-C18 (Agilent, EE.UU.). La temperatura de la columna se fijó en 45 ° C. Las fases móviles fueron compuestas de ácido fórmico 0,1% en agua (disolvente B) y ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo (disolvente A), la velocidad de flujo se estableció como 1 ml /min con relación de división 1:03, el gradiente se utilizó como sigue: un gradiente lineal de 70 a 33% de B durante 5,0 min inicialización, 33 -98% de B durante 5,0 a 12,0 min. El eluyente se introduce en el espectrómetro de masas directamente. Después de cada 10 muestras de la inyección, un grupo de muestras como la muestra de control de calidad seguido por un espacio en blanco se inyectó con el fin de garantizar la estabilidad y la repetibilidad de los sistemas de LC-MS.

2.3.2 La espectrometría de masa.

Para la espectrometría de masas, se utilizó el Agilent 6220 TOF-MS con una fuente de ionización electrospray (ESI) en modo negativo. La velocidad de flujo de gas de morir (N2) se estableció en 9 L /min. El nebulizador se fijó en 45 psi. Las demás condiciones óptimas fueron los siguientes: morir temperatura del gas de 350 ° C, tensión fragmento de 120 V. Los datos se recogieron en el modo de barrido completo desde m /z 50 a 1050 amu durante 0-12 min. Se recogieron los datos de MS en modo centroide.

2.3.3 análisis de datos multivariados.

procedimiento de análisis de los datos se muestra en la Fig. 1. El algoritmo Extractor característica molecular (MFE) en el software de análisis cualitativo misa Hunter se utilizó para extraer funciones-no identificados, compuestos moleculares no focalizados - en cada uno de los datos. El algoritmo MFE busca señales de masas (iones) que son covariantes en el tiempo, considera posibles relaciones químicas (isótopos, aductos, dímeros, múltiples estados de carga), y genera un espectro de masas cromatograma compuesto y compuesto extraído de cada característica molecular. La lista compuesto extraído de cada archivo se exporta como archivo de formato de intercambio de Compuesto (. CEF) para su posterior Mass Profiler Professional (versión B.2.00, Agilent) análisis estadístico. Los archivos de rasgos resultantes para cada muestra se procesaron mediante análisis ANOVA y PCA utilizando el software MPP, que se suman, normalizado, se visualizaron y se filtran las características moleculares (MFS), para su posterior procesamiento [18], [19], [20], [ ,,,0],21]. Posteriormente, se aplicó la agrupación jerárquica (árbol de condición) a los archivos de datos. análisis de agrupamiento jerárquico es un método estadístico para las muestras del grupo sin supervisión en diferentes agrupaciones o ramas del árbol jerárquico. De esta manera, se muestran las relaciones entre los diferentes grupos. El árbol condición se muestra como un mapa de calor. La identidad de los biomarcadores con cambios significativos en los grupos fue determinada por las características del navegador ID del MPP.

2.3.4 Biomarcadores de identificación.

La identificación de biomarcadores potenciales se determinó por Q-TOF (Xevo G2). La energía de colisión MS es 35ev, y se obtuvieron los datos en el modo de ion negativo, se utilizó software x (V4. MassLn1) para el análisis de datos. Las identidades de los metabolitos específicos fueron confirmados por la información comparada elementos de sus espectros de masas utilizando la información proporcionada por la composición elemental del software.
2.3.5 Red y Pathway Analysis.

Se empleó el software MPP

a todos significativo (cambio de carpeta > 2) hacia arriba y hacia abajo metabolitos regulados regulados y las vías biológicas relacionadas. Los marcadores potenciales identificados se compararon con la relación exacta masa de carga en algunas bases de datos, incluyendo HMDB, KEGG, METLIN, lípido MAPS y PubChem, para descubrir vías relacionadas. T-test y doblar-alter se utilizaron para determinar la significación estadística de las vías. valor de P < 0,05 y el cambio de carpeta > 2 se consideró como criterios para estadísticamente significativa y se seleccionarían

2.6 Datos Molecular

ARN total fue extraído a partir de tejidos de estómago incluyendo el control, el modelo y CA. grupos utilizando un reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. cDNA fue sintetizado a partir de ARN total (1 g) usando TransScript primer capítulo de síntesis de cDNA Kit Supermix (Beijing TRANSGEN Biotech, China). PCR cuantitativa en tiempo real (CFX96, Bio-Rad, EE.UU.) se realizó utilizando un kit TransStart ™ Top Verde qPCR Supermix (Beijing TRANSGEN Biotech, China). Los cebadores utilizados para amplificar S1Pr1, S1Pr3, SphK1, Got2 y Fabp1 fueron de Invitrogen (S1Pr1: GenBank acc sin NM_017301, S1Pr3:.. GenBank acc sin XM_225216, SphK1:.. GenBank acc sin NM_133386, Got2:... GenBank Acc no . NM_013177.2, Fabp1:.. GenBank acc no NM_012556.2) y la expresión de estas transcripciones se cuantificó en contra de la limpieza de genes β-actina, que se amplificó usando los cebadores 5'-TGGCACCACACTTTCTACAATGA-3 'y 5'-AGGGACAACACAGCCTGGAT- 3 '. Los niveles de expresión de los genes diana fueron analizados utilizando el sistema Administrador de CFX (Bio-Rad, EE.UU.).

2.7 Análisis estadístico

Los datos se expresan como media ± SEM. SPSS 19.0 para Windows se utilizó para el análisis estadístico. Los datos se analizaron mediante el ANOVA, con p < 0,05 fija como el nivel de significación estadística

Resultado

3.1 Efecto de la CA en el ácido acético inducida inyectada modelo de úlcera gástrica
.

el modelo experimental de daño de la mucosa gástrica inducida por ácido acético inyectado en ratas se emplea a menudo para detectar los compuestos para su actividad anti-úlcera en la que sirve como la causa principal de la úlcera gástrica en los seres humanos [22]. El ácido acético inducida inyectado intenso daño de la mucosa gástrica en la formación de la úlcera en el grupo de ratas modelo (Fig. 2A) que tiene una diferencia significativa en comparación con el grupo control (Fig. 2B). observación patológica se utilizó para confirme el daño de la inducida por ácido acético en las capas superficiales de la mucosa gástrica ulteriormente. inducida por ácido acético úlceras gástricas (Fig. 2C) tiene un efecto de erosión de la mucosa, que fue acompañado por fractura muscular y la infiltración de células inflamatorias en las capas en comparación con el control (Fig. 2D). Los resultados demostraron que el modelo de úlcera gástrica se reprodujo con éxito. Los resultados del tiempo de curso mostraron en la Fig. 2E ilustran que el área de la úlcera en ratas tratadas con CA se mantuvo significativamente menor en comparación con los valores respectivos en las ratas modelo en el séptimo día, por lo que lo elegimos muestras del séptimo día para su análisis. Para evaluar los efectos de CA, como se demuestra en la Fig. 2F, el área de la úlcera gástrica en los grupos de dosis CA se redujo significativamente en comparación con el modelo de grupo (p < 0,01). Nuestros resultados experimentales sugieren que la CA puede curar efectivamente la úlcera gástrica, en particular el grupo de dosis media. Parece que hay una marcada superposición entre las vías patogénicas neuronales implicados en la génesis de la úlcera y la depresión. Por lo tanto, no es sorprendente que la medicación para el tratamiento de episodios depresivos también puede ejercer efecto protector potente contra la úlcera gástrica [23]. La razón por la CA grupo de dosis media tiene un mejor efecto terapéutico que el grupo de dosis alta puede ser grupo de dosis alta CA tiene una función para inhibir los nervios. El efecto de la CA fue examinado para investigar más a fondo el mecanismo.

3.2 Estudio de Metabolómica

3.2.1 adquisición y procesamiento de datos de perfiles metabólicos.

Los cromatogramas de iones totales representativas ( TIC) de muestras de plasma derivados de control, modelo, y los grupos de dosis de Ca en los modos negativos se presentan en la Fig. 3 mediante el uso de las condiciones óptimas LC-MS descritos anteriormente. metabolitos de bajo peso molecular se pudieron separar bien en el corto tiempo de 15 min. Con el fin de visualizar mejor las similitudes y diferencias sutiles entre estos conjuntos de datos complejos, se emplean múltiples métodos de reconocimiento de patrones al fenotipo del metaboloma plasma de ratas. En este caso, el análisis de agrupamiento jerárquico y PCA se utilizaron para clasificar los fenotipos metabólicos e identificar los metabolitos diferenciar a los. análisis de agrupamiento jerárquico de la metabolómica datos mostró la segregación clara entre el control, el grupo modelo y el grupo de dosis CA (Fig. 4). En las puntuaciones de PCA, cada punto representa una muestra individual. Los resultados del ACP se muestran como gráficos de puntuación que indica la dispersión de las muestras, las cuales indican la metabolómica composiciones similares cuando se agrupan y compositivamente metabolomes diferentes cuando se dispersa. El puntuaciones de trama PCA podría dividir las diferentes muestras de plasma en diferentes bloques, respectivamente, lo que sugiere que los perfiles metabólicos han cambiado. En relación con el analista de información de PCA en nuestro experimento mostró en la Fig. 5, los grupos de control y de modelo se dividieron en dos clases significativamente, lo que indica que el modelo de la úlcera gástrica inducida por ácido acético se reproduce con éxito. Más cambios sutiles pueden ser encontrados por las parcelas de reconocimiento de patrones enfoque de puntuación de PCA. PCA resultados muestran que el modelo de grupo estaba muy lejos de los cuatro grupos restantes, lo que indica que el patrón metabólico cambiado el resultado de inducida por el ácido acético puede ser significativamente diferente de los demás. La posición del grupo de tratamiento estaba cerca con el grupo control, lo que sugiere que el patrón metabólico modificado fue causado por CA. Los resultados manifiestan que CA podría cambiar el estado metabólico anormal y puede tener un mecanismo diferente tratamiento de la úlcera gástrica inducida por ácido acético.

3.2.2 Identificación de biomarcadores potenciales.

La pequeña molécula metabolitos de diferencias significativas (t-test, p < 0,05) fueron registrados por el software del MPP. Los marcadores potenciales se identificaron utilizando el "navegador ID" para buscar en la base de datos Metlin (http://metlin.scripps.edu/) y se compara con la relación de carga de masa exacta en algunas bases de datos, incluyendo HMDB (http: //www. hmdb.org/), KEGG (http://www.genome.jp/kegg/), lípido (MAPS http://dev.lipidmaps.org:25424/), y PubChem (http: //pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/). Podemos conocer el nombre probable de biomarcadores potenciales a través del primer paso. En el presente estudio, 10 biomarcadores potenciales fueron identificados (Tabla 1). La masa molecular exacta de los compuestos con cambios significativos en los grupos se determinó dentro de los errores de medición (< 5 ppm) por Waters Xevo G2 QTOF, y mientras tanto, la composición elemental potencial, se obtuvieron grado de insaturación y la abundancia isotópica fraccional de compuestos. La fórmula molecular de TQ se buscó en Propiedades físicas (http://www.chemspider.com/), HMDB y otras bases de datos para identificar las posibles constituciones químicas, y MS /MS datos fueron examinados para determinar las posibles estructuras de los iones. La esfingosina-1-fosfato (S1P) y ácido esteárico se tomaron como ejemplos para ilustrar fragmentos de la estructura y el proceso de evaluación. La información espectrometría de masas primaria y secundaria se analizó por Masslynx (visión 4.1, Waters) software, en comparación con la base de datos, y los fragmentos de iones de 379,2488 (C _{18H 38NO 5P) se muestra en la Fig. 6 A. Los principales iones de fragmentos analizados por detección MS /MS fueron m /z 224,080, 165.1254 y 82.0238, que podría corresponder a perdido C 7H 15NO 5P, C 11H 17O, C 4 H 4NA respectivamente. Por último, se especuló como S1P después refiriéndose y de acuerdo a su tamaño polaridad. Mientras tanto, los fragmentos de iones de ácido esteárico 284.2715 (C 18H 36o 2) (Fig. 6 B) fueron 212.2419 (C 15 H 32), 143.1359 (C 9H 19O), 117.0962 (C 6 H 13O 2) y 83.0962 (C 6 H 11).}

Los biomarcadores descritos anteriormente se demostró tienen una estrecha relación con la formación y el tratamiento de la úlcera gástrica. El significativamente hasta D-glucosa regulada, lisina, ácido úrico, ácido pirúvico, corticosterona, esfingosina-1-fosfato y triptófano regulada hacia abajo, glicocolato, ácido hexadecanodioico, se observaron ácido esteárico en el grupo de modelo en comparación con el grupo control (Fig. 7 ). Esta diferencia de metabolitos puede denotar su potencial como biomarcadores específicos para la diferenciación de la úlcera gástrica y estados normales. Seguimiento de los cambios de estos metabolitos puede predecir el desarrollo de la úlcera gástrica. Los biomarcadores 1, 2, 3, 4, 7, 8 disminuyeron tras el tratamiento de la CA, en cambio, se aumentaron los otros biomarcadores. Además, con el fin de caracterizar antiulcerosos efectos de CA más claramente, se analizaron los cambios en las concentraciones relativas de metabolitos objetivo identificadas en los diferentes grupos, se ha encontrado que el contenido de estos marcadores clave más cerca de grupo normal. Los resultados indican que el mecanismo para el tratamiento de úlceras gástricas puede lograrse a través de la regulación de estas significativamente los marcadores y su interacción como la figura. 8. Por ejemplo, el ácido esteárico que llama 17FA, tiene relación con el ácido tápsico aunque la proteína Fabp1 (graso proteína de unión a ácido 1). La red no sólo indica la interacción entre los biomarcadores, sino que también proporciona información de proteína potencial, genes, enzimas y procesos biológicos. Contribuye al descubrimiento de destino durante la ocurrencia y el tratamiento de la úlcera gástrica y es conductor para el desarrollo de nuevos fármacos para curar la úlcera gástrica.

3.3 Determinación de los niveles de ARNm para confirmar los biomarcadores

para confirmar nuestros hallazgos metabolómica, necesitamos algunos datos moleculares, así que hemos identificado 5 ARNm que están relacionados con los 4 posibles biomarcadores y 2 vías metabólicas con RT-PCR. metabolismo de los esfingolípidos, incluyendo S1Pr1, S1Pr3 y SphK1 se examinaron como se muestra en la Fig. 8. Los resultados se resumen en la Fig. 9. El nivel de ARNm de S1Pr1, SIPr3 y SphK1 se upregulated significativamente en el grupo de modelo, los niveles de expresión fueron 5,21, 2,54, 6,57 veces en comparación con el grupo control, lo que estaba de acuerdo con nuestros resultados y los datos anteriores. Después del tratamiento CA, los niveles de expresión de S1Pr1, S1Pr3 y SphK1 volvieron a nivel basal. S1P está formado por dos quinasas, la esfingosina quinasa 1 y 2 (SphK1 y SphK2), pero no se observaron diferencias en la expresión SphK2 entre todos los grupos (datos no mostrados), el resultado fue consistente con los hallazgos de la red. Aquí, podemos explicar un mecanismo potencial de CA en el tratamiento de la úlcera gástrica mediante el bloqueo de S1P en aumento. También se encontró una disminución de expresión de Fabp1 y Got2 en grupo de modelo (Fig. 9), en comparación con el grupo control. Pero CA hace grupos estaban cerca con el grupo control, lo que confirmó que el efecto terapéutico de CA estaba relacionado con el metabolismo del ácido graso desde el nivel molecular.

3.4 Análisis Pathway

Un análisis más detallado de las vías y redes influenciados por la úlcera gástrica se realizó por MPP. Las vías obtenido muestra en la Tabla 2. Se utilizan la alta calidad KEGG vías metabólicas como la base de conocimientos de back-end para identificar las vías más relevantes, como el metabolismo de los esfingolípidos, ciclo del ácido tricarboxylicacidcycle, el metabolismo de la biotina y así sucesivamente, de los cuales 7 vías únicas ( enumerados en la Tabla 1) para el modelo de grupo fue identificado. también se conformaron biomarcadores potenciales relacionados con el metabolismo del ácido fólico, el metabolismo de ácido graso, y las vías de metabolismo de los esfingolípidos. De los 6 metabolitos distintos identificados a partir de estas vías, muchos se encuentran en distintas etapas de desarrollo de la úlcera gástrica. Algunos metabolitos cambiado significativamente como glicocolato, ácido hexadecanodioico, ácido esteárico y se han encontrado y se utiliza para explicar el mecanismo de ácidos grasos. Estos resultados sugieren que estas vías de destino muestran las perturbaciones marcadas más de la formación de la úlcera gástrica y podrían contribuir al desarrollo de la úlcera gástrica.

Discusión

Las úlceras gástricas en humanos se repiten con frecuencia, y la dificultad en el tratamiento de ellos se indica mediante el adagio "una vez una úlcera, siempre una úlcera" [24]. Hay muchos factores que pueden aumentar la incidencia de úlcera gástrica, pero el mecanismo no se ha entendido con claridad. Por lo tanto, la eficacia del tratamiento farmacológico depende no sólo de la disminución de los factores perjudiciales, sino también en los metabolitos modificados que regulan la ruta de metabolismo. En particular, el descubrimiento de biomarcadores que predicen el riesgo de úlcera gástrica proporcionará una oportunidad para diagnosticar y permitir el tratamiento farmacológico oportuna. QZWT se utiliza para curar la úlcera gástrica durante muchos años en Asia aunque su mecanismo no está claro. La metabolómica, junto con herramientas de datos multivariados que cuantifican de manera simultánea miles de metabolitos en un organismo vivo se utilizó para analizar los biomarcadores en la úlcera gástrica [25]. Además, la comprensión de los biomarcadores ha despertado un nuevo interés en el campo de los programas de descubrimiento de fármacos y seguimiento de la enfermedad, proporcionando valiosa en miras de unos complejos mecanismos de la enfermedad [26]. Por tanto, este estudio fue diseñado para dilucidar el mecanismo subyacente de CA sobre la regulación de la úlcera gástrica de las vías metabólicas en una visión global.

El modelo de la úlcera gástrica en ratas fue reproducido con éxito. Las muestras de plasma se analizaron por HPLC /ESI-TOF-MS y el análisis estadístico multivariado. Los resultados mostraron que el área de la úlcera y perfiles metabólicos dinámicos después del tratamiento CA se cerraron con el grupo control, lo que demuestra que CA tenía eficacia terapéutica. Según el análisis de la metabolómica, 10 biomarcadores potenciales y 7 vías metabólicas relacionadas fueron identificados en nuestro estudio. La D-glucosa, lisina significativamente regulada hacia abajo, ácido úrico, ácido pirúvico, corticosterona, esfingosina-1-fosfato y regulada hasta triptófano, glicocolato, ácido hexadecanodioico, se observaron ácido esteárico en el grupo de CA en comparación con el grupo de modelo. Además, el metabolismo de ácido fólico, el metabolismo de ácidos grasos y el metabolismo de esfingolípidos y muchos otros metabolismo se confirmaron a tener un impacto en la úlcera gástrica. Tenemos determinar la expresión de los ARNm relacionados con sphingolipid metabolismo y el metabolismo de ácidos grasos para validar el mecanismo. Muchas otras posibles proteínas, genes, enzimas y bioprocesos cerrados a otras vías necesitan futuros experimentos para validar.

Mediante el análisis y la verificación de los biomarcadores específicos para la primera de una enfermedad, la metabolómica nos permite comprender mejor los procesos patológicos y las vías metabólicas de sustancias . Creemos que el biomarcador y la vía de análisis tiene un gran potencial para explorar y clarificar la acción terapéutica de la medicina tradicional china. En el estudio actual, hemos caracterizado la interacción biomarcador redes implican proteínas, genes, enzimas y bioprocesos, como se muestra en la Fig. 8. S1P acto extracelularmente como un ligando para sus específicos receptores de S1PRs, se reconoce ahora como regulador de muchos procesos fisiológicos y fisiopatológicos, incluyendo trastornos inflamatorios, tales como artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, y la sepsis [27], [28]. La inflamación que se produce en la mucosa del tracto gastrointestinal, por lo tanto, hace que la úlcera gastrointestinal [29]. Nuestros resultados muestran que CA puede disminuir la expresión de S1P y sus receptores, incluyendo S1Pr1 y S1Pr3, para aliviar problemas de inflamación para aliviar la formación de úlceras gástricas [30]. S1P está formado por SphK1 y SphK2 [31]. SphK1 puede activa la ruta de NF-KB que inició por la importante molécula de señalización inflamatoria TNF-α. En resumen, el NF-kappa B y TNF-α está estrechamente relacionado con formar y curar la úlcera gástrica [32], [33]. También se encontró que la deficiencia de SphK1 (no SphK2) inhibe significativamente la úlcera gástrica, lo que indica que SphK1 puede jugar un papel fundamental en la úlcera gástrica. Así, el metabolismo de los esfingolípidos puede ser un objetivo viable para el tratamiento de la úlcera gástrica.

ácido esteárico, glicocolato y ácido hexadecanodioico cambiaron causa metabolismo de ácidos grasos trastorno de cierre a la incidencia y la rehabilitación de la úlcera gástrica [34], [35] . ácidos grasos, incluyendo el ácido esteárico, etc., comúnmente vistos como fuente de energía, han atraído el interés de la investigación y la salud pública, debido a sus efectos sobre la salud y las enfermedades humanas. Los ácidos grasos son beneficiosos para la promoción de la salud. El ácido esteárico, glicocolato y hexadecanodioico están regulados por Fabp1, la enzima de ácido graso de la proteína de unión 1. En el análisis de RT-PCR, la baja expresión de Fabp1 en grupo de modelo sugiere que la actividad Fabp1 inhibición puede reducir el ácido esteárico, glicocolato y ácido hexadecanodioico y llevar a la alteración del metabolismo de los ácidos grasos. Por lo tanto el aumento de la respuesta inflamatoria y disfunción mitocondrial y promover la formación de úlceras. Sin embargo, CA puede equilibrar este trastorno mediante el aumento de la expresión de Fabp1 [36]. Glutámico-oxalacético transaminasa 2 (Got2) es una enzima importante en el ciclo del ácido tricarboxylicacidcycle (ciclo de Krebs). El severamente la inhibición de TCA causado por la disminución de Got2 contribuirá a la formación de úlcera gástrica. Los metabolitos de aminoácidos tales como triptófano y sus metabolitos in vivo tienen un amplio papel en el metabolismo del triptófano. El más importante es que los trastornos del metabolismo del triptófano puede causar trastornos del TCA. TCA jugar un papel en la curación de la úlcera gástrica [37]. El descenso de regulación de la expresión de ARNm Got2 en el grupo de modelo y de regulación en grupos de CA se demostró anteriormente en nuestro resultado. Todos estos datos indican claramente que el mecanismo molecular de CA el tratamiento de la úlcera gástrica se correlacionó estrechamente con sus efectos de equilibrio en TCA. Estos resultados implican los efectos CA pueden ser mediados a través de proteínas, enzimas, y vía de metabolismo.

• PLOS ONE: La disminución de expresión de factores de crecimiento proangiogénicos y sus receptores en las úlceras gástricas de pacientes cirróticos
• PLOS ONE: antioxidante in vivo y la actividad antiulcerosa de Parkia speciosa hoja etanólico Extracto contra inducidas por etanol úlcera gástrica en ratas