PLoS ONE: Metabolomics In combinatie met multivariate data en Pathway analyse over de Potentiële Biomarkers in maagzweer en Interventie Effecten van Corydalis yanhusuo Alkaloid

Abstract

Metabolomics, de systematische analyse van de potentiële metabolieten in een specimen, wordt in toenemende mate toegepast op het ontdekken van biomarkers identificeren verstoord wegen, het meten van therapeutische doelen, en het ontdekken van nieuwe geneesmiddelen. Door het analyseren en verifiëren van de significant verschil in metabole profielen en veranderingen van metaboliet biomarkers, metabolomics stelt ons in staat om beter te begrijpen stof metabole routes die het mechanisme van de Traditionele Chinese Geneeskunde (TCM) kan verduidelijken. Corydalis yanhusuo
alkaloïde (CA) is een belangrijke component van Qizhiweitong (QZWT) voorschrift dat is gebruikt voor de behandeling van maagzweren eeuwen en het mechanisme volledig onduidelijk. Metaboliet profilering werd uitgevoerd door hoge-prestatie vloeistofchromatografie in combinatie met time-of-flight massaspectrometrie (HPLC /ESI-TOF-MS) in samenhang met multivariate data-analyse en analyse pathway. De statistiek software Mass PROFILLER Prossional (MPP) en statistische methode waaronder ANOVA en principal component analysis (PCA) werden gebruikt voor het ontdekken van nieuwe potentiële biomarkers om mechanisme van de CA te verduidelijken bij de behandeling van zuur geïnjecteerde ratten met een maagzweer. De veranderingen in de metabole profilering werden hersteld naar hun basis-line waarden na CA behandeling volgens de PCA score percelen. Tien verschillende potentiële biomarkers en zeven belangrijke metabolische pathways die bijdragen tot de behandeling van maagzweren ontdekt en geïdentificeerd. Onder de paden, sphingophospholipid metabolisme en vetzuurmetabolisme gerelateerd netwerk waren acuut verstoord. Kwantitatieve analyse Real-time PCR (RT-PCR) werden uitgevoerd om de expressie van genen betrokken bij de twee wegen voor het verifiëren van de bovenstaande resultaten te evalueren. De resultaten tonen aan dat veranderde biomarkers en paden bewijs kan leveren aan inzicht in de werking van het geneesmiddel mechanismen en stellen ons in staat om de productiviteit van het onderzoek in de richting van metabolomics drug discovery verhogen

Visum:. Tianjiao L, Shuai W, Xiansheng M, Yongrui B, Shanshan G, Bo L, et al. (2014) Metabolomics combinatie met multivariate data en Pathway analyse over de Potentiële Biomarkers in maagzweer en Interventie Effecten van Corydalis yanhusuo
Alkaloid. PLoS ONE 9 (1): e82499. doi: 10.1371 /journal.pone.0082499

Editor: Rakesh K. Srivastava, de Universiteit van Kansas Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 15 mei 2013; Aanvaard: 24 oktober 2013; Gepubliceerd: 15 januari 2014

Copyright: © 2014 Tianjiao et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Key Program van de Natural Science Foundation van de staat (nr 81241111). De Aglient en de financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen. De auteurs verklaren dat hun manuscript heeft geen relatie met Agilent Technologies Co, Ltd, met betrekking tot werkgelegenheid, consultancy, octrooien, producten in ontwikkeling of producten op de markt enz. Dit is onderdeel van een master~s project en staat los van elk intern project. Een van de overeenkomstige auteurs, Xiaorong Ran, is in dienst van Agilent Technologies Co, Ltd, die in de onderzoeksopzet, experimenten geholpen en /of analyses. Lei Wang wordt ook gebruikt door Agilent Technologies Co, Ltd, die het onderzoek heeft begeleid en geholpen bij het wijzigen van de grammaticale fouten in het manuscript. De auteurs bevestigen dat de werkgelegenheid door Agilent Technologoies hun aanhankelijkheid niet wijzigt een van de PLoS ONE beleid op het delen van gegevens en materialen.

Introductie

Maagzweer is een wijdverspreide ziekte die veel mensen treft wereldwijd vanwege zijn hogere en hogere morbiditeit. Volgens de statistieken van 2005, was de incidentie van maagzweren was tot 80%, met name westerse wereld. Het heeft 40-80% van de terugkerende frequentie over de hele wereld. Maagzweren bij mensen treden vaak omwille van verschillende endogene en exogene factoren zoals stress, roken, voedingstekorten, zoutzuur, pepsine, Helicobacter pylori
, niet-steroïdale anti-inflammatoire drugsgebruik (NSAIDs), alcohol en infectie [1]. Hoewel deze factoren zijn gedacht te zijn betrokken bij de pathogenese van maagzweren, het mechanisme van zweervorming is nog niet precies duidelijk [2], [3]. TCM heeft toenemende acceptatie opgedaan over de hele wereld in de afgelopen jaren en wordt algemeen beschouwd als natuurlijk en onschadelijk [4], [5]. Therapieën collectief genaamd TCM worden vaak gebruikt voor de behandeling van maagzweren, die de Chinese kruidengeneeskunde en recept etc. omvat

QZWT recept samengesteld uit Corydalis yanhusuo
, Radix Glycyrrhizae Kopen en Radix Bupleuri
ect. zijn uitgebreid gebruikt om maagzweren harden eeuwen in China, door zijn aanzienlijke therapeutische prestatie in klinische toepassing [8] - [10]. We gezuiverd CA uit planten "Corydalis yanhusuo W.T. Wang" met de zuiverheid van 92%. De chemische bestanddelen van Corydalis yanhusuo
zijn onderzocht in onze vorige studie. Tetrahydropalmatine, corydaline, protopine et al waren de biologische activiteiten van Corydalis yanhusuo
. De structuren van de bestanddelen werden onderzocht. CA wordt erkend als de belangrijkste actieve component in zijn Corydalis yanhusuo
[6], en aangetoond dat antiulcer effect wordt gebruikt in de Chinese klinische praktijk gedurende vele jaren hebben [7]. Ook is gemeld dat CA bezit ontstekingsremmende werking [8], [9]. Echter, de gedetailleerde moleculaire mechanisme van CA in de behandeling van maagzweer niet goed begrepen.

Om het werkingsmechanisme van geneesmiddelen opsommen, metabolomics methode is op grote schaal gebruikt [10]. Metabolomics is een belangrijk onderdeel van systemen kennis, meer in het bepalen van de mondiale stofwisselingsprofiel door het detecteren duizenden kleine en grote moleculen in verschillende media, variërend van celkweken van menselijke biologische vloeistoffen zoals urine, speeksel en bloed [11], [12] , [13]. Het heeft een grote impact in het onderzoek van het ontdekken van biomarkers, en het identificeren van verstoorde wegen als gevolg van ziekte of behandeling met geneesmiddelen [14]. Door het analyseren en controleren van de specifieke vroege biomarkers van een ziekte, metabolomics stelt ons in staat om beter te begrijpen stof metabole routes die het mechanisme van de actie [15] kunnen verduidelijken.

Recente ontwikkelingen van instrumentatie en berekeningen hebben de gelijktijdige analyse van enabled een groot aantal metabolieten. HPLC met MS is bewezen een effectieve combinatie van metabolieten identificatie en kwantificering vanwege zijn uitstekende resolutie en gevoeligheid. Het doel van de huidige studie was om systematisch om het mechanisme van CA ontleden als een effectieve behandeling van maagzweren verkrijgen. De specifieke en unieke biochemische pathways van drugdoeltreffendheid kunnen worden geïdentificeerd, wanneer gekoppeld aan multivariate data-analysetechnieken. Het doel van deze studie is om meerdere metabolieten die het inzicht in het werkingsmechanisme van CA zou kunnen vergemakkelijken en de steun van de integratie daarvan in toekomstige verbetering van TCM therapie te identificeren.

Materialen en methoden

2.1 Ethische Verklaring

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde dier protocollen en richtlijnen die door de geneeskunde ethische toetsingscommissie voor dierproeven van Liaoning University of Traditional Chinese Medicine.

2.2 Animal Handling en Monstervoorbereiding

Zeven weken oude mannelijke SD ratten van 200-250 gram werden door het proefdier centrum van Dalian Medical University. De zorg en de behandeling van ratten waren in overeenstemming met de norm van specifiek pathogeenvrije. Maagzweer werd geïnduceerd in ratten volgens de werkwijze in een eerder rapport met een kleine wijziging [16], [17]. Drie dagen na de productie van maagzweren werden de ratten willekeurig verdeeld in vijf groepen: controle, model, CA hoge doseringsgroep (32,4 mg /ml), CA lage dosisgroep (10,8 mg /ml) en CA lage doseringsgroep (3,6 mg /ml). Alle ratten in groepen werden oraal actieve groep van de oplossing 1,5 ml eenmaal per dag (model en de controlegroep met zoutoplossing) gedurende 7 dagen. De ratten werden verboden geen voedsel gedurende 12 uur vóór de experimenten, maar kregen toegang tot water vrijelijk toegestaan.

Op de laatste dag, ratten waren diep verdoofd en vervolgens gedood. Bloed werd verzameld, plasma en serum werden via centrifugeren gescheiden bij 3000 rpm gedurende 15 min bij 4 ° C. De plasmamonsters werden verzameld en opgeslagen bij -80 ° C snel bevroren in vloeibare stikstof tot metabolomics analyse uitgevoerd. Vervolgens werden de magen langs de grote curvatuur gesneden, gewassen met zoutoplossing. Het gebied van de zweer werd gemeten met behulp van een kompas om zweer index te meten. Het gebied van ulcus gelijk aan de breedte van de zweer maal de lengte van de zweer. Voor histologische evaluatie werden maag weefselmonsters gefixeerd in neutraal gebufferde formaline gedurende 24 uur. Maag secties werden gedehydrateerd met gegradeerde ethanol, geleid door xyleen, en ingebed in paraffine. Paraffine secties (5 mm dikte) werden gekleurd met hematoxyline /eosine (HE). De andere gastrische zweren weefsels werden snel verwijderd en bevroren in vloeibare stikstof tot de extractie van totaal RNA weefsel.

2,3 metabole

Chromatografie 2.3.1.

Chromatografie werd uitgevoerd met behulp van een Agilent 1100 serie HPLC-systeem uitgerust met een quaternaire pomp, online ontgasser, autosampler en een thermostaat kolom compartiment. Het injectievolume werd vastgesteld op 4 pi. Alle monsters werden tijdens de analyse bij 4 ° C gehouden. De scheiding werd uitgevoerd op een 4,6 * 100 mm, ZORBAX SB-C18 kolom (Agilent, USA). De kolomtemperatuur werd ingesteld op 45 ° C. De mobiele fasen waren samengesteld uit 0,1% mierenzuur in water (oplosmiddel B) en 0,1% mierenzuur in acetonitril (oplosmiddel A), werd de stroomsnelheid ingesteld op 1 ml /min aan 1:03 splitsingsverhouding werd het verloop als volgt: een lineaire gradiënt van 70- 33% B over begin- 5.0 min, 33 -98% B over 5,0-12,0 min. Het eluens werd ingevoerd om de massaspectrometer direct. Na elke 10 monsters wordt geïnjecteerd, werd een samengevoegd monster als QC monster gevolgd door een lege geïnjecteerd om de stabiliteit en reproduceerbaarheid van de LC-MS systemen.

2.3.2 massaspectrometrie.

Voor massaspectrometrie, de Agilent 6220 TOF-MS met een elektrospray ionisatiebron (ESI) in negatieve modus gebruikt. Het debiet van het sterven gas (N2) werd vastgesteld op 9 l /min. De vernevelaar werd ingesteld op 45 psi. De overige optimale condities waren als volgt: sterven gastemperatuur van 350 ° C, fragment spanning van 120 V. Gegevens werden verzameld in de volledige scanmodus van m /z 50-1050 amu dan 0-12 min. De MS data werden verzameld zwaartepunt modus.

2.3.3 Multivariate data analyse.

Data analyseprocedure wordt getoond in Fig. 1. The Molecular Feature Extractor (MFE) algoritme in de Mis Hunter Kwalitatieve analyse software werd gebruikt om moleculaire eigenschappen-geïdentificeerde, ongerichte verbindingen extract - in elk van de data. De MFE algoritme zoekt naar massa signalen (ionen) die covariante zijn in de tijd, beschouwt mogelijke chemische relaties (isotopen, adducten, dimeren, multiple lading staten), en genereert een gewonnen verbinding chromatogram en samengestelde massaspectrum voor elk moleculaire functie. De onttrokken samengestelde lijst voor elk bestand werd geëxporteerd als Verbinding Exchange Format (CEF). Bestand voor verdere Mass Profiler Professional (versie B.2.00, Agilent) statistische analyse. De verkregen feature-bestanden voor elk monster werden verwerkt met ANOVA en PCA-analyse met gebruikmaking van de MPP software, die uitgelijnd, genormaliseerd, gevisualiseerd en gefilterd de moleculaire kenmerken (MFS), voor verdere verwerking [18], [19], [20], [ ,,,0],21]. Vervolgens hiërarchische clustering (conditie boom) werd op de gegevensbestanden. Hiërarchische cluster analyse is een statistische methode om de groep monsters zonder toezicht in de verschillende clusters of filialen van de hiërarchische boom. Op deze wijze worden de verhoudingen tussen de verschillende groepen weergegeven. De voorwaarde boom werd weergegeven als een heat map. De identiteit van biomarkers met significante veranderingen in de groepen werd bepaald door ID Browser kenmerken van MPP.

2.3.4 Biomarkers Identification.

De identificatie van potentiële biomarkers werd bepaald door Q-TOF (Xevo G2). De MS botsingsenergie is 35ev, en de gegevens werden verkregen in de negatieve ion modus is x (V4. MassLn1) software voor gegevensanalyse. De identiteit van de specifieke metabolieten werden bevestigd door elementen gegevens vergelijking van hun massa spectra met behulp van de elementaire samenstelling informatie die door de software.

2.3.5 Network en Pathway Analysis.

MPP software werd gebruikt om alle belangrijke (map verandering > 2) op de gereglementeerde en omlaag gereguleerd metabolieten en aanverwante biologische pathways. De potentiële markers geïdentificeerd werden vergeleken met de accurate massa lading verhouding in een aantal databases, waaronder HMDB, KEGG, METLIN, LIPID MAPS en PubChem, om gerelateerde paden te ontdekken. T-testen en opvouwen alter werden gebruikt om de statistische significantie in de paden bepalen. P-waarde < 0,05 en folder verandering > 2 werd beschouwd als criteria voor statistisch significant zijn en zou worden gekozen

2.6 moleculaire gegevens

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit de maag weefsels, waaronder controle, model en CA. groepen die een TRIZOL reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. cDNA werd gesynthetiseerd uit totaal RNA (1 ug) middels Transscript First-Strand cDNA Synthesis Kit SuperMix (Beijing andere genen Biotech, China). Kwantitatieve real time PCR (CFX96, BIO-RAD, USA) werd uitgevoerd met een TransStart ™ Green Top qPCR SuperMix kit (Beijing andere genen Biotech, China). Primers gebruikt voor het versterken S1Pr1, S1Pr3, SphK1, Got2 en Fabp1 waren van Invitrogen (S1Pr1: GenBank acc geen NM_017301, S1Pr3:.. GenBank acc geen XM_225216, SphK1:.. GenBank acc geen NM_133386, Got2:... GenBank acc No . NM_013177.2, Fabp1:.. GenBank acc geen NM_012556.2) en expressie van deze transcripten werd gekwantificeerd tegen huishoudingsgen β-actine, dat werd geamplificeerd met de primers 5'-TGGCACCACACTTTCTACAATGA-3 'en 5'-AGGGACAACACAGCCTGGAT- 3 '. Expressie van doelgenen werden geanalyseerd met de CFX Manager systeem (BIO-RAD, USA).

2.7 Statistische analyse

De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. SPSS 19.0 voor Windows werd gebruikt voor de statistische analyse. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van de ANOVA, met p < 0,05 ingesteld als het niveau van de statistische significantie

Resultaat

3.1 Effect van CA op het azijnzuur geïnjecteerd-geïnduceerde maagzweer model
.

de experimentele model azijnzuur geïnjecteerd-geïnduceerde gastrische mucosale schade bij ratten wordt vaak gebruikt om de verbindingen op activiteit tegen maagzweren scherm, dat het dient als de belangrijkste oorzaak van maagzweren bij mensen [22]. Azijnzuur geïnjecteerd geïnduceerde intense maagslijmvlies schade in de vorming van de zweer in modelgroep (fig. 2A) ratten die een significant verschil is in vergelijking met de controlegroep (Fig. 2B). Pathologische observatie werd gebruikt om de schade azijn- zuur geïnduceerd in de oppervlakkige lagen van het maagslijmvlies ulteriorly confirme. Azijn- zuur-geïnduceerde maagzweren (fig. 2C) een uitholling effect op het slijmvlies, die gepaard ging met spier breuk en infiltratie van ontstekingscellen in de lagen vergeleken met de controlegroep (Fig. 2D). De resultaten tonen aan dat het model van maagzweren met succes werd gereproduceerd. De resultaten van het tijdsverloop toonde in Fig. 2E illustreert dat het gebied van de zweer bij ratten behandeld met CA bleef aanzienlijk kleiner in vergelijking met de respectievelijke waarden in het model ratten zevende dag, dus we kozen monsters de zevende dag voor analyse. Om de effecten van CA evalueren, zoals aangetoond in Fig. 2F, het gebied van maagzweren in CA doseringsgroepen significant gedaald in vergelijking met het model (p < 0,01). Onze experimentele resultaten suggereren dat CA effectief kan genezen van de maagzweer, met name de middelste dosisgroep. Het lijkt dat er een aanzienlijke overlap tussen de neuronale pathogenese die betrokken zijn bij ulcus genese en depressie. Het is daarom niet verwonderlijk dat medicatie voor de behandeling van depressieve episoden ook krachtige beschermende werking tegen maagzweren [23] kan uitoefenen. De reden waarom Californië middelste dosisgroep hebben een beter therapeutisch effect dan de hoge dosis groep kan zijn CA hoge dosis groep heeft een rol te zenuw te remmen. Het effect van CA werd onderzocht om verder te onderzoeken van het mechanisme.

3.2 Metabolomic Study

3.2.1 verwerven en verwerken van metabole profiel data.

De vertegenwoordiger van de totale ion chromatogrammen ( TIC) van plasmamonsters afgeleid van controle, model en CA dosisgroepen negatieve modes zijn weergegeven in Fig. 3 met de optimale bovenbeschreven LC-MS condities. Lage massa metabolieten moleculaire kon goed worden gescheiden in de korte tijd van 15 min. Om beter te visualiseren subtiele overeenkomsten en verschillen tussen deze complexe datasets zijn meerdere methoden patroonherkenning gebruikt om het plasma metaboloom ratten fenotype. Hier hiërarchische clustering analyse en PCA werden gebruikt om de metabole fenotypes classificeren en identificeren differenting metabolieten. Hiërarchische clustering analyse van metabolomics data toonden duidelijke scheiding tussen de controle, model-groep en CA dosisgroep (afb. 4). In de PCA scores, elk punt staat voor een individueel monster. De PCA resultaten worden weergegeven als score plots met vermelding van de spreiding van de monsters, die vergelijkbaar metabolomics composities aangeven wanneer geclusterd elkaar en compositorisch verschillende metabolomes bij verstuiven. De PSO scores plot konden de verschillende plasmamonsters te verdelen in verschillende blokken, respectievelijk, wat suggereert dat de metabole profielen zijn veranderd. Wat informatieanalist PCA in ons experiment toonde in Fig. 5, de controle- en modelgroepen significant verdeeld in twee klassen, wat aangeeft dat het model azijn- zuur-geïnduceerde maagzweer succes werd gereproduceerd. Meer subtiele veranderingen kan gevonden worden door de patroonherkenning aanpak-score percelen van PSO. PCA resultaten tonen dat het model groep ver van de resterende vier groepen, wat aangeeft dat veranderde biotransformatiepatroon gevolg van azijn- zuur-geïnduceerde aanzienlijk afwijken van anderen. De positie van de behandelingsgroep was dicht bij de controlegroep, wat suggereert dat veranderde biotransformatiepatroon veroorzaakt door CA. De resultaten manifest dat CA de abnormale metabole toestand kunnen veranderen en kunnen een verschillende behandeling mechanisme van azijnzuur zuur-geïnduceerde maagzweer hebben.

3.2.2 Identificatie van potentiële biomarkers.

De kleine-molecule metabolieten van significante verschillen (T-test, p < 0,05) werden doorzocht door de software van MPP. De potentiële markers werden geïdentificeerd met behulp van de "ID browser" om te zoeken in Metlin database (http://metlin.scripps.edu/) en vergeleken met de accurate massa lading verhouding in een aantal databases, waaronder HMDB (http: //www. hmdb.org/), KEGG (http://www.genome.jp/kegg/), LIPID KAARTEN (http://dev.lipidmaps.org:25424/), en PubChem (http: //pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/). We kunnen de waarschijnlijke naam van potentiële biomarkers kennen door de eerste stap. In de huidige studie werden 10 potentiële biomarkers geïdentificeerd (tabel 1). De precieze molecuulmassa van verbindingen met significante veranderingen in de fracties werd bepaald binnen meetfouten (< 5 ppm) van Waters Xevo G2 QTOF en ondertussen de potentiële elementaire samenstelling, graad van onverzadiging en fractionele isotopen overvloed aan verbindingen verkregen. De veronderstelde moleculaire formule werd gezocht in het Farmacotherapeutisch Kompas (http://www.chemspider.com/), HMDB en andere databases naar de mogelijke chemische grondwetten te identificeren, en MS /MS gegevens werden gescreend om de mogelijke structuren van de ionen te bepalen. Sfingosine-1-fosfaat (S1P) en stearinezuur werden als voorbeeld fragmenten van de structuur en het beoordelingsproces illustreren. De primaire en secundaire massaspectrometrie informatie geanalyseerd door Masslynx (gezichtsvermogen 4,1, water) software, tegenover database en ionen fragmenten van 379,2488 (C _{18H 38NO 5P) worden getoond in Fig. 6 A. De belangrijkste fragment ionen door MS /MS screening geanalyseerd waren m /z 224,080, 165,1254 en 82,0238, die zouden kunnen overeenkomen met verloren C 7H 15NO 5P, C 11H 17O, C 4 H 4NO respectievelijk. Ten slotte werd gespeculeerd als S1P na verwijzend en volgens hun polariteit grootte. Ondertussen ion fragmenten stearinezuur 284.2715 (C 18H 36o 2) (fig. 6 B) waren 212,2419 (C 15H 32), 143,1359 (C 9H 19o), 117,0962 (C 6H 13O 2) en 83,0962 (C 6H 11).}

De hierboven beschreven werden bewezen biomarkers hebben nauwe relatie met de vorming en behandeling van maagzweren. De aanzienlijk opgereguleerd D-glucose, lysine, urinezuur, pyrodruivenzuur, corticosteron, sphingosine-1-fosfaat en downgereguleerde tryptofaan, glycocholaat, hexadecanedioic, stearinezuur werden waargenomen in het model vergeleken met controlegroep (Fig. 7 ). Dit verschil van metabolieten kunnen hun potentieel aan te duiden als gerichte biomarkers voor de differentiatie van maagzweren en een normale staten. Monitoring wijzigingen van deze metabolieten de ontwikkeling van maagzweren voorspellen. Biomarkers 1, 2, 3, 4, 7, 8 waren verminderd na behandeling van CA, in tegenstelling, zijn de andere biomarkers toegenomen. Bovendien, teneinde tegen zweren effecten van CA duidelijker karakteriseren, veranderingen in de relatieve concentraties van doelwit metabolieten geïdentificeerd in verschillende groepen werd geanalyseerd, hebben wij gevonden dat de inhoud van deze belangrijke markers dichter bij normale groep. De resultaten geven het mechanisme voor de behandeling van maagzweren kan worden bereikt door de regulering van deze aanzienlijk markers en hun interactie met fig. 8. bijvoorbeeld stearinezuur die 17fa genoemd, heeft relatie met thapsic zuur hoewel het eiwit Fabp1 (vetzuur bindend eiwit 1). Het netwerk geeft niet alleen de interactie tussen biomarkers, maar ook informatie over mogelijke eiwitten, genen, enzymen en biologische processen. Het draagt ​​bij tot de ontdekking van target tijdens het optreden en de behandeling van maagzweren en bevorderen de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen tegen maagzweer genezen.

3.3 Bepaling van mRNA-niveaus voor het bevestigen biomarkers

metabolomics onze bevindingen te bevestigen, hebben we wat moleculaire gegevens, dus geïdentificeerd 5 mRNA's die verband houden met de potentiële biomarkers 4 en 2 metabole routes met RT-PCR. Sfingolipide metabolisme, waaronder S1Pr1, S1Pr3 en SphK1 werden onderzocht zoals getoond in Fig. 8. De resultaten zijn samengevat in Fig. 9. Het mRNA-niveau van S1Pr1, SIPr3 en SphK1 significant opgereguleerd in de modelgroep, de expressieniveaus waren 5,21, 2,54, 6,57 keer vergeleken met de controlegroep, die in overeenstemming met onze eerdere bevindingen en gegevens. Na CA behandeling, de expressie niveaus van S1Pr1, S1Pr3 en SphK1 waren terug naar basaal niveau. S1P wordt gevormd door twee kinasen, sphingosine kinase 1 en 2 (SphK1 en SphK2), maar geen verschillen waargenomen in SphK2 expressie onder alle groepen (gegevens niet getoond), het resultaat was in overeenstemming met onze bevindingen netwerk. Hier kunnen we een potentieel mechanisme van CA in de behandeling van maagzweer blokkeert S1P verhogen leggen. We vonden ook een verminderde expressie van Fabp1 en Got2 in model groep (fig. 9), in vergelijking met de controlegroep. Maar CA doet groepen waren in de buurt van de controlegroep, die bevestigden dat het therapeutisch effect van CA was gerelateerd aan vetzuurmetabolisme van moleculair niveau.

3.4 Pathway Analysis

Meer gedetailleerde analyse van de paden en netwerken beïnvloed door maagzweer werd uitgevoerd door MPP. De paden verkregen shows in Tabel 2. We gebruiken de hoogwaardige KEGG metabole routes als de backend kennisbasis de meest relevante paden, zoals sfingolipide metabolisme, tricarboxylicacidcycle zuurcyclus, biotine metabolisme enzovoort identificeren, waarbij 7 unieke pathways ( in Tabel 1) van de genoemde modelgroep geïdentificeerd. Potentiële biomarkers gerelateerd aan foliumzuurmetabolisme, vetzuurmetabolisme en sfingolipide metabolisme routes werden gelijkvormig. Van de 6 verschillende metabolieten geïdentificeerd uit deze trajecten, velen zijn in verschillende stadia van ontwikkeling van de maagzweer. Sommige metabolieten significant veranderd zoals glycocholaat, hexadecanedioic zuur en stearinezuur zijn gevonden en gebruikt om het vetzuur mechanisme toe. Deze resultaten suggereren dat deze doelstelling paden tonen de sterke verstoringen over de vorming van maagzweren en kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van maagzweren.

Discussie

Maagzweren bij mensen komen vaak terug, en de moeilijkheid in te behandelen wordt aangegeven door het gezegde "Zodra een zweer, een zweer altijd" [24]. Vele factoren kunnen de incidentie van maagzweren te verhogen, maar het mechanisme is niet duidelijk begrepen. Daarom is de effectiviteit van therapie hangt niet alleen af ​​van de vermindering van schadelijke factoren, maar ook van de gewijzigde metabolieten die het metabolisme reguleren route. Met name zal de ontdekking van biomarkers die het risico van maagzweren voorspellen gelegenheid te diagnosticeren en mogelijk farmacologische behandeling tijdig leveren. QZWT werd gebruikt om maagzweren harden vele jaren in Azië, hoewel het werkingsmechanisme onduidelijk blijft. Metabolomics combinatie met multivariate gereedschappen die gelijktijdig kwantificeren duizenden metabolieten in een levend organisme werd gebruikt om de biomarkers maagzweer [25] te analyseren. Bovendien, begrip van biomarkers is nieuwe interesse op het gebied van drug discovery programma's en het toezicht op de ziekte leidde, waardevolle in-gezichten over complexe ziekte mechanismen [26]. Deze studie werd dan ook bedoeld om het onderliggende mechanisme van de CA op maagzweren regulering van de metabole routes in een globale visie verder te ontrafelen.

Het model van maagzweren bij ratten werd met succes gereproduceerd. Plasma monsters werden geanalyseerd met HPLC /ESI-TOF-MS en multivariate statistische analyse. De resultaten toonden aan dat het gebied van de zweer en dynamische metabolische profielen na CA behandeling met de controlegroep waren gesloten, waaruit blijkt dat Californië had therapeutische werkzaamheid. Volgens metabolomics analyse werden 10 potentiële biomarkers en 7 gerelateerde metabole routes die in onze studie. De aanzienlijk downgereguleerde D-glucose, lysine, urinezuur, pyrodruivenzuur, corticosteron, sphingosine-1-fosfaat en opgereguleerd tryptofaan, glycocholaat, hexadecanedioic zuur, stearinezuur werden waargenomen in de CA groep tegenover modelgroep. Bovendien foliumzuurmetabolisme, vetzuurmetabolisme en sfingolipide metabolisme en vele andere metabolisme werden bevestigd gevolgen voor maagzweren hebben. We bepalen de expressie van mRNA's met betrekking tot sfingolipide metabolisme en vetzuurmetabolisme het mechanisme valideren. Vele andere potentiële eiwitten, genen, enzymen en bioprocestechnologie gesloten voor andere routes moeten toekomstige experimenten te valideren.

Door het analyseren en controleren van de specifieke vroege biomarkers van een ziekte, metabolomics stelt ons in staat om beter te begrijpen pathologische processen en inhoud metabole routes . Wij zijn van mening dat de biomarker en pathway-analyses hebben een groot potentieel om te verkennen en de therapeutische werking van TCM te verduidelijken. In de huidige studie hebben wij biomarker interactienetwerken omvatten eiwitten, genen, enzymen en bioprocess zoals getoond in Fig gekarakteriseerd. 8. S1P handeling extracellulair als een ligand voor de specifieke receptoren-S1PRs wordt nu erkend als regulator van vele fysiologische en pathofysiologische processen, waaronder ontstekingsziekten, zoals reumatoïde artritis, ontstekingsdarmziekte, sepsis en [27], [28]. Ontsteking die optreedt in het slijmvlies van het maagdarmkanaal, daardoor veroorzaakt maagdarmzweer [29]. Onze resultaten tonen dat de expressie van CA S1P en zijn receptoren, waaronder S1Pr1 en S1Pr3 kan verminderen, om ontstekingen te verlichten om de vorming van maagzweren [30] verlichten. S1P wordt gevormd door SphK1 en SphK2 [31]. SphK1 kan actief de NF-KB-route, die op initiatief van de belangrijkste inflammatoire signaalmolecuul TNF-α. In het kort, is NF-KB en TNF-α nauw verwant te vormen en te genezen maagzweren [32], [33]. We vonden ook dat het tekort aan SphK1 (niet SphK2) significant remt maagzweer, wat aangeeft dat SphK1 een centrale rol in maagzweer kunnen spelen. Aldus kan het sfingolipide metabolisme een levensvatbare doelwit voor de behandeling van maagzweer zijn.

stearinezuur, glycocholaat en hexadecanedioic zuur veranderd vetzuurmetabolisme veroorzaken stoornis sluiten de incidentie en herstel van maagzweren [34], [35] . Vetzuren, zoals stearinezuur etc, algemeen gezien als de bron van energie, hebben belangstelling voor onderzoek en de volksgezondheid, aangetrokken als gevolg van hun gevolgen voor de menselijke gezondheid en ziekten. Vetzuren zijn gunstig voor de gezondheidsbevorderende. Stearinezuur, glycocholaat en hexadecanedioic worden gereguleerd door Fabp1, het enzym vetzuur-eiwit 1. In de analyse van RT-PCR, de lage expressie van Fabp1 in model groep suggereert dat Fabp1 activiteit remmen van stearinezuur, glycocholaat en hexadecanedioic zuur kan verminderen , en leiden tot vetzuurmetabolisme stoornis. Daarom verhoogde de ontstekingsreactie en mitochondriale dysfunctie en het bevorderen van de vorming van maagzweren. Echter, CA deze aandoening evenwicht met het verhogen van de expressie van Fabp1 [36]. Glutaminezuur-oxaalazijnzuur transaminase 2 (Got2) is een belangrijk enzym in de tricarboxylicacidcycle zuurcyclus (TCA cyclus). De ernstig remming TCA veroorzaakt door de afgenomen van Got2 zal bijdragen tot de vorming van maagzweren. De metabolieten van aminozuren zoals tryptofaan en zijn metabolieten in vivo een zeer grote rol in tryptofaan metabolisme. Het belangrijkste is dat tryptofaan verstoord TCA aandoening veroorzaken. TCA spelen een rol bij de genezing maagzweer [37]. Down-regulatie van Got2 mRNA expressie in model groep en up-regulatie in Californië groepen werden eerder aangetoond in ons resultaat. Al deze gegevens geven duidelijk aan dat het moleculaire mechanisme van CA behandelen maagzweer nauw gecorreleerd met de balans gevolgen TCA. Deze resultaten impliceren de CA effect kan worden gemedieerd door eiwitten, enzymen en metabolisme route.

• PLoS ONE: De Verminderd Expressie van pro-angiogene groeifactoren en hun receptoren in de maag Zweren van Cirrotische Patients
• PLoS ONE: In Vivo Antioxidant en antiulcer activiteit van petehboon ethanol Leaf Extract tegen-Ethanol geïnduceerde maagzweer in Rats