efeitos diferenciais de ácido intragástrico e capsaicina no esvaziamento gástrico e entrada de aferentes ao rato do cabo e diferenciais brainstem

efeitos espinhais de ácido intragástrico e capsaicina no esvaziamento gástrico e entrada de aferentes para a medula espinhal de ratos e tronco cerebral da arte abstracta
Fundo
ácido clorídrico (HCl) é uma ameaça potencial para a integridade da mucosa gástrica e é conhecida por contribuir para a dor abdominal superior. Encontraram-se anteriormente que a infecção das mucosas gástrica com excesso de HCl é sinalizada para o tronco cerebral de ratos, mas não na medula espinhal, como visualizado através de expressão de c-fos ácido ribonucleico mensageiro (ARNm), um marcador substituto de excitação neuronal. Este estudo examinou se a exposição da mucosa gástrica a capsaicina, um estimulante de aferentes nociceptivos que não danifica a mucosa gástrica, é sinalizada para ambos tronco cerebral e da medula espinhal e se as diferenças na sinalização aferente do gástrica desafio HCl e capsaicina estão relacionados com efeitos diferentes sobre esvaziamento gástrico.

Resultados os ratos foram tratados intragastricamente com veículo, HCl ou capsaicina, a activação de neurónios no tronco cerebral e na medula espinhal foi visualizada por autorradiografia hibridização in situ para o ARNm de c-fos e o esvaziamento gástrico deduzida a partir da retenção administrado intragastricamente de fluido. Em relação ao veículo, HCl (0,5 M) e capsaicina (3,2 mM) aumentaram a transcrição de c-fos no trato solitarii núcleo por factores de 7,0 e 2,1, respectivamente. A capsaicina também causou um aumento de 5,2 vezes da expressão de ARNm de c-fos em lâmina I da medula espinal torácica caudal, embora o número de células positivas de ARNm de c-fos nesta lâmina foi muito pequena. Assim, em média, apenas 0,13 e 0,68 células de ARNm-positivo c-fos foram contadas em secções de 0,01 mm a lâmina unilateral I após a administração intragástrica do veículo e da capsaicina, respectivamente. Em contraste, HCl intragástrica não induziu ARNm de c-fos na medula espinal. Medição da retenção de fluido gástrico revelou que HCl suprimido o esvaziamento gástrico, enquanto a capsaicina não o fez.
Conclusão
Os resultados deste estudo mostram que a exposição da mucosa gástrica para HCl e capsaicina é diferencialmente transmitidos para o tronco cerebral ea medula espinhal. Uma vez que apenas blocos HCl esvaziamento gástrico, é a hipótese de que os dois estímulos são transduzidas por diferentes vias aferentes. Inferimos que HCl é exclusivamente sinalizado por aferentes vagais gástricos enquanto a capsaicina é processado tanto por aferentes vagais da coluna vertebral e intestinal gástrica.
Fundo
doenças relacionadas com ácido gástrico estão entre as perturbações da mucosa mais prevalentes do trato gastrointestinal superior. Existe também evidência de que o ácido clorídrico (HCl) contribui para a dor associada com refluxo gastro-esofágico e úlcera péptica, bem como a dor no peito não cardíaca e dispepsia funcional [1-3]. chemonociception gástrica provocada por exposição do estômago de rato para o excesso de HCl é mediada pelos neurónios aferentes vagais, uma vez que a resposta de dor visceromotor para intragástrico administração (Ig) de HCl é abolido por vagotomia bilateral, enquanto que a resposta visceromotor à distensão permanece inalterado [4] . Este resultado é consistente com a nossa observação de que a administração IG de HCl é sinalizada no solitarii núcleo do trato (NTS) do tronco cerebral do rato, a área de terminação central da aferentes vagais, como visualizado por expressão de ácido ribonucléico mensageiro (mRNA) para o imediato início gene c-fos, enquanto que nenhuma indução de ARNm de c-fos é visto na espinal-medula [5, 6]. Do mesmo modo, o desafio com hidróxido de amónio gástrica induz ARNm e proteína de c-fos apenas no tronco cerebral, mas não na medula espinhal, da ratazana [7]. Embora ambos HCl e hidróxido de amónio ferir a mucosa gástrica em concentrações que causam a tradução próximo do máximo do gene c-fos no NTS [7], a capsaicina é uma substância química que excita neurónios aferentes gastrointestinal [8-10], sem causar danos ao estômago de ratos [11]. Isso ocorre porque a capsaicina estimula neurônios aferentes por gating transitórios receptores potenciais canais de iões de vanilóide tipo 1 (TRPV1), que são expressas por ambos os neurônios vagais aferentes e espinhal que inervam o estômago de ratos e intestino [12-16].
O objectivo global deste estudo exploratório foi para testar se a infecção das mucosas gástrica com capsaicina e o excesso de HCl é diferencialmente transmitida para o tronco cerebral e medula espinal de rato e se o processamento diferencial dos dois estímulos tem lugar ao nível do tracto gastrointestinal superior. Dois conjuntos de experimentos foram realizados para responder a estas perguntas. No primeiro estudo, administrado IG capsaicina e HCl foram comparados quanto aos seus efeitos sobre a expressão de ARNm de c-fos no NTS e na medula espinal torácica caudal que recebe a entrada de mais densa aferentes a partir do estômago de rato [17, 18]. Foi, em particular, investigaram se a administração IG de HCl e capsaicina tem um efeito distinto em neurónios em lâminas e núcleos da medula espinal dorsal específica. As concentrações de HCl (0,5 M) e capsaicina (0,64 e 3,2 M) testado nestas experiências foram seleccionados a partir de experiências anteriores. A exposição da mucosa gástrica do rato a HCl (0,5 M) provoca uma indução distinta mas submáxima de ARNm de c-fos no tronco cerebral [5], enquanto que a administração IG de capsaicina 0,64 mM é maximamente eficaz no aumento do fluxo de sangue na mucosa gástrica de um neurónio sensorial forma dependente [19].
Dado que se verificou que a sinalização aferente de HCl e capsaicina para a medula espinhal e NTS é diferente, o objectivo do segundo estudo foi examinar se HCl e motilidade gástrica capsaicina influência e esvaziamento de forma diferencial. foi fundamentado que a magnitude da resposta de c-fos na medula espinal NTS e depende tanto da concentração dos produtos químicos e a duração da sua presença no estômago. Verificou-se anteriormente que a administração IG de excesso de HCl inibe o esvaziamento gástrico e altera a pressão intragástrica [5, 20]. Os resultados deste estudo revelam que, ao contrário do excesso de HCl, a capsaicina não inibe o esvaziamento gástrico. A hipótese é, por conseguinte, que desafio HCl gástrico é exclusivamente um sinal para o tronco cerebral através de aferentes vagais, porque é retida no estômago durante um período prolongado de tempo, ao passo que ambos os aferentes espinais vagais e duodenais gástricas responder a administração IG de capsaicina, o esvaziamento dos quais para o duodeno não é retardado.

Resultados Efeitos de HCl e capsaicina para induzir mRNA c-fos no NTS e da medula espinhal (estudo 1)
Como ilustrado anteriormente [5, 21], administração IG de HCl 0,5 M causado muitos neurónios no NTS de expressar ARNm de c-fos, quando comparado com a administração IG de solução salina fisiológica. O número de células de ARNm-positivo c-fos por secção visto após a administração IG de HCl foi 7,0 vezes maior do que após a administração IG de solução salina fisiológica (Figura 1). O número de neurónios de ARNm-positivo c-fos por secção NTS contado após a administração IG de veículo tende a ser maior do que após a administração de solução salina fisiológica, embora este efeito não foi estatisticamente significativo (Figura 1). Em relação ao veículo, a capsaicina (0,64 e 3,2 mM) aumentou o número de neurónios de ARNm-positivo c-fos por secção NTS, este efeito, dependendo da concentração do fármaco. Como pode ser visto na Figura 1, apenas a concentração de capsaicina 3,2 mM foi capaz de aumentar significativamente a indução de ARNm de c-fos por um factor de 2,1. A distribuição de mRNA de células-positivo c-fos no NTS IG após exposição a HCl (0,5 M) e capsaicina (3,2 mM) foi desigual, o maior número de células activadas que ocorrem na parte ventromedial do NTS [22]. A Figura 1 Número de células de ARNm-positivo c-fos por secção (0,01 mm) no NTS unilateral determinada 45 minutos após a administração IG de NaCl (0,15 M), HCl (0,5 M), veículo (Veh) e capsaicina (Boné, 0,64 e 3,2 mM). Meios + SEM, n como indicado. * P < 0,05 contra Veh, ** P < 0,01 versus NaCl.
De acordo com descobertas anteriores [5], a exposição IG a HCl 0,5 M não conseguiu induzir qualquer expressão de ARNm de c-fos na metade dorsal da medula espinal torácica caudal. Assim, o número total de células positivas de ARNm-c-fos por secção da medula espinal dorsal contadas após exposição IG para solução salina fisiológica foi 1,30 ± 0,29 (n = 4) e após exposição a HCl IG 1,33 ± 0,18 (n = 4). Esta falta de efeito de HCl também foi observado quando a distribuição de células de ARNm-positivo c-fos para LI, LII, LIII, LIV, LV, AX e IMLN após a administração IG de HCl foi comparado com que após a administração IG de solução salina fisiológica ( A Figura 2A). administração IG de capsaicina (3,2 mM) do mesmo modo não aumentar significativamente a expressão de c-fos mRNA na medula espinal dorsal, dado que o número total de células de ARNm-positivo c-fos por secção contadas após exposição IG ao veículo foi de 2,19 ± 0,32 (n = 6) e depois da exposição de IG para a capsaicina foi 1,94 ± 0,23 (n = 7). A análise da distribuição de células de ARNm-positivo c-fos para LI, LII, LIII, LIV, LV, AX e IMLN revelado, no entanto, que a capsaicina causou um aumento de 5,2 vezes significativa da expressão de mRNA c-fos em LI, que passou em paralelo com uma diminuição significativa na formação de ARNm de c-fos em LIII e LIV (Figura 2B). Deve notar-se que o nível de transcrição de c-fos foi muito baixa, como é tipicamente inferior a 0,7 células de ARNm-positivo c-fos por lâmina foram contadas nas secções 0,01 mm de espinal medula dorsal unilateral (Figura 2). Por esta razão, as experiências com HCl e capsaicina eram estritamente executado em paralelo com as que envolvem a solução respectivo controlo /veículo (Figura 2). Figura 2 Número de células de ARNm-positivo c-fos por secção (0,01 mm) em várias lâminas e áreas da metade dorsal unilateral da medula espinal torácica caudal determinada 45 minutos após a administração IG de (A) de NaCl (0,15 M), HCl (0,5 M), (B) veículo (Veh) e capsaicina (Tampão, 3,2 mM). Os gráficos mostram as contagens de lâminas I-V (LI-LV), a área X (AX) eo núcleo intermediolateral (IMLN). Meios + SEM, n como indicado. * P < 0,05, ** P < 0,01 versus Veh.
Efeitos de HCl e capsaicina sobre a pressão intragástrica e recuperação fluido gástrico (estudo 2)
O IGP linha de base medido antes da administração de qualquer meio era entre 400 e 500 Pa [20]. IG injecção de um bolus fluido 2 ml aumentado para um nível de IGP cuja magnitude foi independente do facto de o fluido injectado era solução salina, HCl (0,35 M), veículo ou capsaicina (3,2 mM) tal como determinado 2-3 min pós-injecção (Figura 3A ). Em contraste, o decurso no tempo da queda subsequente do IGP dependia da natureza do meio de administrado. Após a injecção de soro fisiológico ou do veículo, IGP diminuiu a uma taxa significativamente mais rápido do que depois da injecção de capsaicina HCl ou, respectivamente (Figura 3B). Assim, em HCl-estômagos e expostos à capsaicina IGP não caem significativamente durante o período de observação de 30 min após a injecção, enquanto que em NaCl- estômagos e expostas ao veículo IGP significativamente reduzido a níveis de cerca de 65% do IGP medido 03/02 min pós-injecção (Figura 3B). Outro efeito de HCl foi para aumentar a retenção de fluido gástrico tal como deduzido a partir de uma recuperação de 100% do volume do fluido injectado a partir do estômago 30 min pós-injecção (Figura 3C). Em contraste, 30 minutos após a administração de solução salina, veículo ou capsaicina única de 30-60% do volume de fluido injectado foi recuperado (Figura 3C). Figura 3 Efeito da injecção intragástrica de NaCl (0,15 M), HCl (0,35 M), veículo (Veh) e capsaicina (Tampão, 3,2 mM) sobre a (a) um aumento inicial da pressão intragástrica (IGP), (B) o tempo subsequente curso do IGP e (C) recuperação do fluido do estômago. De NaCl, HCl, Veh e Cap foram injectados como bolus de 2 ml. Os valores apresentados no painel A representam o IGP atingido 2-3 min após a injecção. Os valores medidos IGP durante os períodos de 9-10 min e 29-30 min após a injecção (painel B) são expressos como uma percentagem do aumento inicial IGP registados 2-3 minutos após a injecção, e a recuperação de volume gástrico (painel C ) medido 30 minutos depois da injecção de bolus é expresso como uma percentagem do volume de injecção (2 ml). Meios + SEM, n = 6-13. ** P < 0,01 versus IGP medido 2-3 min após a injecção; ++ P < 0,01 versus NaCl.
Discussão
Os resultados do estudo mostram que a administração IG de HCl e capsaicina para ratos gera entradas diferenciais para o NTS e da medula espinhal torácica, o que está associado a efeitos diferenciais sobre o esvaziamento gástrico. Tal como descrito anteriormente [5, 7], a sinalização gástrico para o tronco cerebral e da medula espinhal foi visualizado por expressão do gene induzível c-fos ao nível do ARNm, um método que tem sido estabelecido como uma ferramenta de padrão em neuroanatomy funcional para delinear o estímulo activação -evoked de neurônios [23, 24]. A transcrição do gene c-fos começa dentro de alguns minutos depois da excitação neuronal [23, 24] e no NTS parece ser máxima 45 minutos após a provocação HCl gástrico [5]. Embora a exposição a HCl (0,35-0,7 M) induz lesão da mucosa gástrica de uma maneira relacionada com a concentração, há evidências de que a sinalização aferente do desafio HCl gástrico não está directamente relacionada com a formação da lesão da mucosa, porque a expressão do c- gene fos no NTS pode ser estimulada por concentrações IG de HCl que induzem pouca, se alguma, dano epitelial [5, 7]. Tem, portanto, a hipótese [5, 7] que um aumento maciço do H + ion gradiente através da barreira da mucosa gástrica é por si só suficiente para conduzir H íons + para a lâmina própria, onde podem excitar fibras nervosas vagais aferentes quer directamente, [25, 26] ou indirectamente, através de factores neuroactivos libertados no tecido.
a distribuição topográfica de células de ARNm-positivo c-fos no NTS era irregular mas semelhante após a administração IG de HCl e capsaicina. Tal como mostrado anteriormente por imuno-histoquímica [22], o maior número de neurónios HCl-activado foi visto na parte ventromedial do NTS. Além de entrada gástrica vagal [27], esta área do NTS também recebe a entrada a partir de neurónios lâmina espinal I através do tracto spinosolitary [28-30]. A contribuição relativa das entradas vagais e da coluna vertebral para esta parte do NTS após a estimulação química do estômago permanece a ser determinada.
O presente estudo confirma que o excesso de HCl gástrico não consegue induzir a proteína c-fos mRNA e de c-fos em o corno dorsal da medula espinhal torácica posterior [5, 7], que recebe a entrada mais denso dos neurônios aferentes que inervam o estômago de ratos [17, 18]. Descobertas similares foram feitas após a exposição da mucosa gástrica de ratos com hidróxido de [7] amónio. Assim, parecia que desafio gástrica com produtos químicos nocivos é sinalizado por aferentes vagais única, uma conjectura que foi rejeitado pela constatação de que aferentes corrente de entrada a partir do estômago exposto-capsaicina é enviado tanto para a medula espinhal e no tronco cerebral. Este resultado está de acordo com a expressão de TRPV1, o receptor de capsaicina, por ambos os neurônios vagais aferentes e espinhal que inervam o tracto gastrointestinal do rato [12-16]. rastreio retrógrado revelou que 80 e 71% dos nodosos e radiculares dorsais neurónios ganglionares que abastecem o estômago de rato, respectivamente, expressam TRPV1 [16]. Quando aplicado directamente ao somata, capsaicina excita 90% dos neurónios do gânglio da raiz dorsal e 59% dos neurónios dos gânglios nodosos que se projectam para o estômago de rato [31]. Enquanto TRPV1 é fácil de detectar na gânglios nodosos, o nível de expressão na maioria dos TRPV1 fibras nervosas vagais aferentes dentro do estômago está abaixo do limiar de detecção imuno-histoquímica [12]. Este exemplo poderia explicar por que a administração IG de capsaicina induz relativamente pouca expressão de mRNA c-fos no NTS. Nós não pensamos que o pequeno efeito da capsaicina é devido à dosagem inadequada, porque já foi encontrado que a administração IG de capsaicina 0,64 mM é maximamente eficaz em aumentar o fluxo sanguíneo da mucosa gástrica em um dependente de neurônio forma sensorial [19].
como HCl, a capsaicina administrada no estômago de rato não conseguiu aumentar significativamente a expressão global de ARNm de c-fos na metade dorsal da medula espinal torácica posterior. No entanto, análise regional revelou que a capsaicina causou neurônios no superficial da lâmina I do corno dorsal para expressar c-fos mRNA, um efeito que não foi observado após a administração IG de HCl. Este achado obtido com capsaicina é consistente com a projecção de neurónios aferentes viscerais a lâmina I e a parte superficial da lâmina II, bem como a lâmina V e X área do rato e do gato medula espinhal [17, 32]. Os nossos dados indicam que a administração da capsaicina para o lúmen gástrico activa neurónios sensoriais que se projectam essencialmente a lâmina I da medula espinal. Em vista deste resultado, pode excluir-se que a expressão de c-fos é um método inadequado para visualizar quimiorreceptores sinalização a partir do lúmen gástrico para a medula espinhal e que a falta de desafio HCl gástrico para induzir ARNm de c-fos na medula espinal representa um resultado falso negativo. Embora os sensores neural através do qual o excesso de HCl é detectada no lúmen gástrico não são conhecidos, não se pode excluir que tanto TRPV1 e canais iónicos com sensor de ácido (ASICs), tais como ASIC3 estão envolvidos [33]. Uma vez que tanto TRPV1 e ASIC3 são expressos pela maioria dos neurônios do gânglio da raiz dorsal que abastecem o estômago de ratos [16], parece pouco provável que HCl IG falha para induzir mRNA c-fos na medula espinhal, porque os respectivos aferentes não suportar o ácido apropriado sensores.
em comparação com o número de neurónios que expressam ARNm de c-fos no NTS, o número de neurónios de ARNm-positivo c-fos em 0,01 mm de secções da espinal medula foi muito pequena. Isto poderá reflectir que a entrada de aferentes a partir do estômago de rato com a medula espinal é menor em relação à entrada da coluna vertebral a partir de tecidos somáticos e que aferentes espinais eletrofisiologicamente caracterizadas dificilmente inervam a mucosa do tracto gastrointestinal [34, 35]. O baixo nível de transcrição de c-fos nas lâminas da medula espinhal dorsal tornou obrigatório para executar os experimentos envolvendo HCl e capsaicina estritamente em paralelo com as que envolvem a solução de controle /veículo respectivo. Nós supomos que o aparentemente diferente distribuição das células de ARNm-positivo c-fos no interior da medula espinal dorsal de ratos de controlo, como mostrado nos dois painéis da Figura 2, não só pode reflectir a variabilidade inter-ensaio, mas também a natureza diferente do controlo solução /veículo: enquanto o veículo para o HCl foi solução salina fisiológica, o veículo para a capsaicina foi soro fisiológico contendo etanol e Tween 80. o efeito de
IG capsaicina para aumentar a indução de ARNm de c-fos em lâmina I da medula espinal foi associada com uma diminuição significativa da expressão do ARNm de c-fos em lâminas III e IV. Não temos qualquer explicação simples e direta para essa observação. Desde lâminas III e IV não parecem receber a entrada direta das vísceras [17, 32], os autores sugerem que a redução da formação de mRNA c-fos nestes lâminas é um efeito indireto da capsaicina. É concebível, input aferente visceral via I neurônios lâmina ativa vias inibitórias que deprimem a excitabilidade da lâmina III e IV neurônios.
A sinalização aferentes de exposição da mucosa gástrica à capsaicina e HCl em excesso é determinada não só pela concentração do produto químico nocivo, mas também por a duração da sua presença no lúmen gástrico. anteriormente Verificou-se que, em relação à solução salina, a administração IG de HCl a ratos anestesiados prolonga a retenção de fluido no estômago e atrasos adaptação do IGP [7, 20]. HCl-gástricas induzidas resultados da retenção de fluido de inibição de esvaziamento gástrico e fluido gástrico reforçada, bicarbonato e secreção de muco [20, 36], mas a análise do conteúdo gástrico estava para além do âmbito do presente estudo. inibição de HCl-evocada de esvaziamento gástrico é mediada por meio de reflexos neurais que são iniciadas tanto no estômago e no duodeno [20, 37-40]. A concentração de HCl testados para os seus efeitos motores gastropyloric em ratos anestesiados foi reduzida para 0,35 M, por anestesia enfraquece a barreira da mucosa gástrica de HCl e a concentração IG de HCl (0,5 M) testados para o seu efeito sobre a expressão do centro de c-fos induz extensa lesão em ratos anestesiados, mas causa danos gástrica menor em animais conscientes [5]. Como as experiências revelaram, exposição a HCl gástrica e motilidade gastropyloric capsaicina modificado de uma maneira diferencial. Enquanto o esvaziamento gástrico foi bloqueada com HCl mas deixado inalterado pela capsaicina, a adaptação do IGP foi impedido por ambos HCl e capsaicina. O efeito da capsaicina para atrasar adaptação IGP pode estar relacionada com a sua capacidade para induzir a contracção ou relaxamento da musculatura gástrica do rato, do tipo de resposta em função da dose de capsaicina e a camada muscular e região gástrica em estudo [19, 41-43 ].
no que diz respeito ao efeito díspares de HCl IG e capsaicina sobre a expressão de c-fos espinal era particularmente importante observar que, ao contrário de HCl, a capsaicina falhou para melhorar a recuperação de fluido gástrico, o que significa que o esvaziamento gástrico ocorreu intacta e IG capsaicina administrada foi rapidamente transportado para o intestino delgado superior. Por conseguinte, poderia ser argumentado que a resposta c-fos evocada por capsaicina no NTS, que foi menor do que a HCl, e da medula espinhal são devido à excitação evocada por capsaicina de ambos os aferentes gástricos e intestinais, enquanto o efeito excitatório de HCl é essencialmente limitados ao aferentes gástricas. A falha de desafio HCl gástrico para induzir a expressão de c-fos na medula espinal não pode ser explicada pela capacidade reportada das fibras aferentes vagais para activar vias descendentes e deste modo inibir a entrada de aferentes para a medula espinhal [44, 45], porque vagotomia crónica bilateral falhar para revelar qualquer aumento na indução de mRNA c-fos vertebral devido ao desafio HCl gástrico [5]. Há outras maneiras de explicar a capacidade diferencial de HCl IG e capsaicina para induzir mRNA c-fos no NTS e da medula espinhal, mas a análise desses fatores foi além do escopo deste estudo. Por exemplo, há provas de que a capsaicina é pouco absorvida na parede gástrica [19], o que também explicaria porque IG capsaicina administrada é comparativamente fraca na estimulação aferentes vagais gástricos que se projectam para o NTS, ao passo que a capsaicina transportados para o intestino delgado superior pode mais chegar facilmente e estimular terminações nervosas aferentes na coluna vertebral a lâmina própria intestinal.
Devido à sua natureza exploradora, o presente estudo tem suas limitações. Assim, o efeito diferencial de IG administrado capsaicina e HCl em vias aferentes vagais e da coluna vertebral é provável que dependem não só da velocidade de esvaziamento gástrico e a cinética de absorção de HCl e capsaicina, mas também sobre a extensão da lesão da mucosa e da magnitude de sangue da mucosa fluxo. Embora a integridade da mucosa gástrica é perturbada apenas por HCl [5, 7, 46], mas não por capsaicina [11], o fluxo de sangue na mucosa gástrica é elevado por tanto a capsaicina [19] e backdiffusing HCl [46].
Conclusão
gástrico desafio com HCl e a capsaicina é diferencialmente sinal para o NTS e da medula espinal, o que indica que os dois estímulos são processados ​​por vias aferentes nociceptivos díspares. Desde HCl inibe o esvaziamento gástrico, enquanto que a capsaicina não faz, infere-se que a entrada de aferentes HCl-evocadas para o NTS é transmitida por aferentes vagais no estômago, enquanto a activação de NTS e lâmina de coluna vertebral I neurónios por capsaicina é mediada tanto por vagal aferentes no estômago e por aferentes espinais no intestino delgado superior. Outras experiências são necessárias para determinar como estas conclusões dizem respeito a chemonociception gástrico. De acordo com os nossos dados c-fos, nocicepção induzida por HCl gástrico em excesso é mediada pelos neurónios aferentes vagais [4], e aguarda-se a ser examinado que vias aferentes retransmitir nocicepção evocada por capsaicina gástrico. Mechanonociception evocado pela distensão do estômago é provocada por aferentes espinais [4], embora a expressão de c-fos é visto tanto na espinal medula e, em maior medida, no tronco cerebral [47].
Métodos
Animals
o estudo foi aprovado por uma comissão de ética no Ministério Federal de Educação, Ciência e Cultura da República da Áustria e conduzidas de acordo com a Directiva do Conselho das Comunidades Europeias de 24 de Novembro de 1986 (86/609 /CEE) . As experiências foram concebidas de tal maneira que o número de animais utilizados e o seu sofrimento foi minimizado. Foram utilizados ratos Sprague-Dawley fêmeas da mesma idade (Abteilung für Labortierkunde und -genetik, Universidade Médica de Viena, Himberg, Áustria) pesando 180-220 g. Foram alojados em grupos de quatro em gaiolas de plástico transparentes sob condições normais; luzes estavam acesas a partir de 06:00 até 18:00. protocolos experimentais

Todas as experiências realizadas durante a fase de luz 8:00-00:00. Vinte horas antes do início dos experimentos, os ratos foram privados de alimentos para garantir que o estômago estava vazio no momento dos experimentos, enquanto a água estava disponível ad libitum ao longo desta fase preparatória. Além disso, os ratos foram colocados em grupos de dois a uma grelha de chão para evitar a coprofagia. Dois estudos com diferentes protocolos experimentais foram realizados.
Estudo 1 foi realizado com animais não anestesiados. salina fisiológica (0,15 M de NaCl), HCl (0,5 M), a capsaicina (0,64 e 3,2 mM) ou o seu veículo foram administrados IG a um volume de 10 ml /kg por meio de um lactente macio tubo de alimentação (diâmetro externo 2,2 milímetros; Portex, Hythe , Reino Unido). Após 45 min os ratos foram sacrificados por injecção intraperitoneal de uma sobredose de pentobarbital (200 mg /kg; Intervet, Viena, Áustria) e a sua medula espinal e do tronco cerebral removido rapidamente. A capsaicina (Sigma, Viena, Áustria) foi dissolvido em um meio contendo 10% de Tween 80, 10% de etanol e 80% de solução salina fisiológica para se obter soluções de reserva de 2 e 10 mg /ml (6,4 e 32 mM) capsaicina. Estas soluções de reserva foram, em seguida, diluída com solução salina fisiológica para se obter soluções de teste de capsaicina 0,64 e 3,2 mM, respectivamente. O veículo para a capsaicina consistiu em 1% de Tween 80, 1% de etanol e 98% de solução salina fisiológica
Estudo 2 foi realizada com animais que foram anestesiados com fenobarbital (230 mg /kg por via intraperitoneal; Sigma). E colocados sobre uma mesa com termostato a manter a temperatura rectal a 37 graus Celsius [20]. Os ratos foram em seguida equipado com uma cânula traqueal para facilitar a respiração espontânea. Uma cânula na veia jugular esquerda foi utilizado para a infusão contínua de solução salina fisiológica (1,5 ml /h) para evitar a desidratação. Depois de uma laparotomia na linha média de um cateter IG (diâmetro externo: 2,2 milímetros) foi inserido no estômago através do esófago, do estômago e corou [20]. Com a sua ponta posicionada na região do corpo, o cateter foi usado para registar a pressão intragástrica (IGP) através de um transdutor de pressão, bem como para injectar fluido para dentro e para drenar a partir do estômago [20]. Este método de medição IGP tem sido descrito e validado em um estudo anterior [20]. Após um período de equilibração de 30 min, a 2 ml de bolus fluido foi injectada lentamente no estômago durante um período de 5 segundos e deixado no estômago durante um período de 30 min após o qual o estômago foi drenado e o peso do fluido recuperado determinada . A recuperação de fluido a partir do estômago (uma medida indirecta do esvaziamento gástrico) foi expressa como uma percentagem do peso do fluido administrado no estômago [20]. Cada rato foi submetido a ensaios de injecção 4 /recuperação em intervalos de 15 minutos durante o qual o estômago foi deixado vazio. Primeiro, dois ensaios de priming com solução salina foram realizadas, seguido quer por um ensaio de teste com solução salina e um ensaio de teste com HCl (0,35 M) ou por um ensaio de teste com veículo e um ensaio de teste com capsaicina (3,2 mM). IGP foi calculada a média para os períodos de 2-3 min, 9-10 min e 29-30 min após a injecção. Uma vez que, como descrito anteriormente [20], o aumento do pico do IGP pós-injecção variada devido às diferenças na velocidade de injecção, o IGP média durante o período de 2-3 minutos pós injecção foi tomada como 100% e o IGP registada durante a observação subsequente períodos expresso como uma percentagem do valor de referência que.
A hibridação in situ autorradiografia
O tronco cerebral e da medula espinhal foram rapidamente removidos e congelados em gelo seco em pó. cortes coronais (0,01 mm) foram cortados em série a partir do tronco cerebral no ramal rostrocaudal da área postrema e da medula espinhal torácica caudal com um criostato [5, 6, 22]. Cada quinta secção foi processada para hibridação in situ com uma sonda de oligodesoxirribonucleótido marcado no 'final com [ 35S] desoxiadenosina 5' a 3 trifosfato (α-tio) tal como descrito anteriormente [6]. As secções foram mergulhadas em emulsão fotográfica Ilford K5 e, após 18-25 dias de exposição em caixas fechadas a 4 graus Celsius, desenvolveram-se os autorradiogramas e as secções contrastadas com hematoxilina e lamínulas [6]. A especificidade do procedimento foi provado pela ausência de qualquer sinal de hibridação quando as secções de controlo foram hibridados com uma mistura de sonda marcada com um excesso de 100 vezes de não marcado ( "frio") sonda.
Os autorradiogramas foram analisados ​​num Coded mesmo com um microscópio de luz (Axiophot, Zeiss, Oberkochen, Alemanha) acoplado a um sistema de análise de imagem computadorizada (Imaging, St. Catharines, Ontario, Canadá). As células foram consideradas c-fos mRNA-positivas quando a sua densidade de grãos era pelo menos 10 vezes maior do que o fundo [6]. A fim de aumentar a fiabilidade dos resultados quantitativos, foram avaliadas 5 secções de tronco cerebral e 7-10 secções da espinal medula de cada animal. Estas secções foram seleccionadas de tal modo que eles eram de 0,05 mm, afastadas uma da outra, de modo a evitar que as mesmas células foram contadas duas vezes. As células de ARNm-positivo c-fos por secção foram contadas de forma unilateral no NTS ao nível da área postrema e na metade dorsal da medula espinal ao nível torácico caudal (T8-T12). Estas estruturas foram identificadas de acordo com Molander e Grant [48] e Paxinos e Watson [49]. Na metade dorsal da medula espinal, a distribuição de células de ARNm-positivo c-fos para lâminas IV (LI-LV), a área X (AX) em torno do canal central e o núcleo intermediolateral (IMLN) foi avaliada de acordo com o rato

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