Efectos diferenciales de ácido intragástrica y la capsaicina en el vaciado gástrico y la entrada aferente a la médula espinal de la rata y el tronco cerebral

Efectos diferenciales de ácido intragástrico y la capsaicina sobre el vaciado gástrico y los impulsos aferentes a la médula espinal y el tronco cerebral de rata
Resumen Antecedentes

ácido clorhídrico (HCl) es una amenaza potencial para la integridad de la mucosa gástrica y es conocida para contribuir al dolor abdominal superior. Hemos encontrado previamente que desafío de la mucosa gástrica con un exceso de HCl se señaliza al tallo cerebral de rata, pero no de la médula espinal, como se visualiza mediante la expresión de ácido ribonucleico c-fos mensajero (ARNm), un marcador sustituto de la excitación neuronal. Este estudio examinó si la exposición de la mucosa gástrica a la capsaicina, un estimulante de los aferentes nociceptivos que no daña la mucosa gástrica, se indica tanto el tronco cerebral y la médula espinal y si las diferencias en la señalización aferente de gástrico desafío HCl y la capsaicina se relacionan con diferentes efectos en el vaciado gástrico.
Resultados
las ratas se trataron por vía intragástrica con vehículo, HCl o capsaicina, la activación de las neuronas en el tronco cerebral y la médula espinal se visualizó mediante autorradiografía in situ de hibridación para el ARNm c-fos, y el vaciado gástrico deducida de la retención de administrado por vía intragástrica fluido. Respecto al vehículo, HCl (0,5 M) y la capsaicina (3,2 mM) el aumento de c-fos de la transcripción en el núcleo tractus solitarii por factores de 7,0 y 2,1, respectivamente. La capsaicina también causó un aumento 5,2 veces de la expresión de ARNm c-fos en la lámina I de la médula espinal torácica caudal, aunque el número de células de ARNm-positivo c-fos en esta lámina era muy pequeña. Por lo tanto, en promedio, sólo 0,13 y 0,68 células de ARNm-positivo c-fos se contaron en 0,01 mm secciones de la lámina unilateral I después de la administración intragástrica de vehículo y la capsaicina, respectivamente. En contraste, HCl intragástrico no inducir ARNm de c-fos en la médula espinal. La medición de la retención de fluido gástrico HCl reveló que suprime el vaciado gástrico, mientras que la capsaicina no lo hizo.
Conclusión
Los resultados de este estudio muestran que la exposición de la mucosa gástrica a HCl y la capsaicina se transmite diferencialmente al tronco del encéfalo y la médula espinal. Dado que sólo HCl bloques de vaciado gástrico, se plantea la hipótesis de que los dos estímulos son transducidas por diferentes vías aferentes. Deducimos que se señaliza HCl exclusivamente por las vías aferentes vagales gástricas mientras que la capsaicina es procesada por tanto aferentes vagales espinales e intestinales gástricos.
Antecedentes
gástricos enfermedades relacionadas con el ácido son algunos de los trastornos de la mucosa más frecuentes del tracto gastrointestinal superior. También hay pruebas de que el ácido clorhídrico (HCl) contribuye al dolor asociado con el reflujo gastro-esofágico y la enfermedad de úlcera péptica, así como para el dolor de pecho no cardiaco y dispepsia funcional [1-3]. chemonociception gástrica provocada por la exposición del estómago de rata a un exceso de HCl está mediada por las neuronas aferentes vagales, dado que la respuesta de dolor visceromotor a intragástrico administración (IG) de HCl es abolida por vagotomía bilateral, mientras que la respuesta visceromotor a la distensión permanece inalterada [4] . Este hallazgo es consistente con nuestra observación de que la administración IG de HCl se señaliza a la solitarii núcleo del tracto (NTS) del tronco cerebral de rata, el área central de terminación de los aferentes vagales, como se visualiza mediante la expresión de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) para el temprano inmediato gen c-fos, mientras que no la inducción de ARNm c-fos se ve en la médula espinal [5, 6]. Del mismo modo, el desafío gástrico con hidróxido de amonio induce ARNm y la proteína c-fos sólo en el tronco del encéfalo, pero no de la médula espinal, de la rata [7]. Mientras tanto HCl e hidróxido de amonio dañan la mucosa gástrica en concentraciones que causan traducción casi máxima del gen c-fos en el NTS [7], la capsaicina es una sustancia química que excita las neuronas aferentes gastrointestinales [8-10] sin causar daño a la estómago de rata [11]. Esto se debe a la capsaicina estimula las neuronas aferentes colocando puertas del receptor potencial de los canales iónicos transitorios de vainilloide tipo 1 (TRPV1), que se expresan por ambas neuronas aferentes vagales y espinales que inervan el estómago y el intestino de rata [12-16]. México La finalidad general de este estudio exploratorio era probar si desafío de la mucosa gástrica con capsaicina y el exceso de HCl se transmite diferencialmente para el tronco cerebral y la médula espinal de rata y si el procesamiento diferencial de los dos estímulos tiene lugar a nivel del tracto gastrointestinal superior. Se realizaron dos series de experimentos para abordar estas cuestiones. En el primer estudio, IG administrada capsaicina y HCl se compararon en sus efectos sobre la expresión de ARNm de c-fos en el NTS y ​​en la médula espinal torácica caudal que recibe la entrada aferente más densa del estómago de rata [17, 18]. En particular, fue investigado si la administración IG de HCl y la capsaicina tiene un efecto distinto sobre las neuronas en láminas y núcleos de la médula espinal dorsal específica. Las concentraciones de HCl (0,5 M) y la capsaicina (0,64 y 3,2 M) a prueba en estos experimentos se seleccionaron a partir de experimentos anteriores. La exposición de la mucosa gástrica de rata a HCl (0,5 M) produce una inducción distintivo pero submáxima de ARNm c-fos en el tronco cerebral [5], mientras que la administración IG de la capsaicina 0,64 mM es la máxima eficacia en el aumento del flujo sanguíneo de la mucosa gástrica en una neurona sensorial de manera dependiente de [19].
Desde que se descubrió que la señalización aferente de HCl y la capsaicina a la médula espinal NTS y ​​es diferente, el objetivo del segundo estudio fue examinar si HCl y la influencia capsaicina la motilidad gástrica y el vaciado en de manera diferencial. Se razonó que la magnitud de la respuesta de c-fos en el cable de NTS y ​​la médula depende tanto de la concentración de los productos químicos y la duración de su presencia en el estómago. Previamente se ha encontrado que la administración IG de exceso de HCl inhibe el vaciado gástrico y altera la presión intragástrica [5, 20]. Los resultados de este estudio revelan que, a diferencia de un exceso de HCl, la capsaicina no inhibe el vaciado gástrico. Se plantea la hipótesis, por lo tanto, que desafío HCl gástrico se señaliza exclusivamente al tronco cerebral a través de las vías aferentes vagales, ya que es retenida en el estómago durante un período prolongado de tiempo, mientras que tanto los aferentes espinales vagales y duodenales gástricos responder a la administración IG de la capsaicina, la el vaciado de los cuales en el duodeno no se retarda.
Resultados
Efectos de HCl y la capsaicina para inducir c-fos mRNA en el NTS y ​​la médula espinal (estudio 1)
Como se ilustra anteriormente [5, 21], administración IG de M HCl 0,5 causó muchas neuronas en el NTS de expresar ARNm c-fos en comparación con la administración IG de solución salina fisiológica. El número de células de ARNm-positivo c-fos por sección visto después de la administración IG de HCl era 7,0 veces mayor que después de la administración IG de solución salina fisiológica (Figura 1). El número de neuronas de ARNm-positivo c-fos por sección NTS contado después de la administración IG de vehículo tendía a ser más alta que después de la administración de solución salina fisiológica, aunque este efecto no fue estadísticamente significativa (Figura 1). Respecto al vehículo, la capsaicina (0,64 y 3,2 mM) mayor el número de neuronas de ARNm-positivo c-fos por sección NTS, este efecto en función de la concentración del fármaco. Como puede verse en la figura 1, sólo la concentración de capsaicina 3,2 mM fue capaz de aumentar significativamente la inducción de ARNm c-fos en un factor de 2,1. La distribución de las células de ARNm-positivo c-fos en el NTS después de la exposición a IG HCl (0,5 M) y la capsaicina (3,2 mM) fue desigual, el mayor número de células activadas que se producen en la parte ventromedial de la NTS [22]. Figura 1 Número de células de ARNm-positivo c-fos por sección (0,01 mm) en el NTS unilateral determinó 45 min después de la administración IG de NaCl (0,15 M), HCl (0,5 M), vehículo (Veh) y la capsaicina (Cap, 0,64 y 3,2 mM). Los medios ± SEM, n tal como se indica. * P < 0,05 frente a Veh, ** P < 0,01 frente NaCl.
De acuerdo con los resultados anteriores [5], la exposición a la IG HCl 0,5 M no inducir a cualquier expresión de ARNm de c-fos en la parte dorsal de la médula espinal torácica caudal. Así, el número total de células de ARNm-positivo c-fos por sección de la médula espinal dorsal contado después de la exposición a IG solución salina fisiológica fue 1,30 ± 0,29 (n = 4) y después de la exposición a IG HCl 1,33 ± 0,18 (n = 4). Esta falta de efecto de HCl también se observó cuando la distribución de células de ARNm-positivo c-fos a LI, LII, LIII, LIV, LV, AX y IM.LN después de la administración IG de HCl se comparó con la después de la administración IG de solución salina fisiológica ( Figura 2A). administración IG de la capsaicina (3,2 mM) no pudo igualmente a aumentar de manera significativa la expresión de c-fos mRNA en la médula espinal dorsal, dado que el número total de células de ARNm-positivo c-fos por sección contados después de la exposición IG para vehículo fue 2,19 ± 0,32 (n = 6) y después de la exposición a la capsaicina IG era 1,94 ± 0,23 (n = 7). Análisis de la distribución de células de ARNm-positivo c-fos a LI, LII, LIII, LIV, LV, AX y IM.LN reveló, sin embargo, que la capsaicina provocó un aumento 5,2 veces significativo de la expresión de ARNm c-fos en LI, que pasó en paralelo con una disminución significativa en la formación de ARNm c-fos en LIII y LIV (Figura 2B). Cabe señalar que el nivel de transcripción de c-fos fue muy baja, como típicamente menos de 0,7 células de ARNm-positivo c-fos por lámina se contaron en las secciones de 0,01 mm de la dorsal unilateral de la médula espinal (Figura 2). Por esta razón, los experimentos con HCl y la capsaicina fueron estrictamente corren en paralelo con las destinadas a la solución de control respectivo /vehículo (Figura 2). Figura 2 Número de células de ARNm-positivo c-fos por sección (0,01 mm) en diversas láminas y las áreas de la media dorsal unilateral de la médula espinal torácica caudal determinado 45 min después de la administración IG de (A) NaCl (0,15 M), HCl (0,5 M), (B) vehículo (Veh) y la capsaicina (Cap, 3,2 mM). Los gráficos muestran los recuentos de las láminas I-V (LI-LV), el área X (AX) y el núcleo intermediolateral (IM.LN). Los medios ± SEM, n tal como se indica. * P < 0,05, ** P < 0,01 frente a Veh.
Efectos de HCl y la capsaicina en la presión intragástrica y de recuperación de fluido gástrico (estudio 2) Francia El IGP base medida antes de la administración de cualquier medio era entre 400 y 500 Pa [20]. inyección de IG de un 2 ml bolo de líquido aumentó IGP a un nivel cuya magnitud era independiente de si el fluido inyectado fue de solución salina, HCl (0,35 M), vehículo o capsaicina (3,2 mM) como 2-3 min después de la inyección determinado (Figura 3A ). Por el contrario, el curso temporal de la posterior disminución de IGP dependía de la naturaleza del medio administrada. Después de la inyección de solución salina o vehículo, IGP disminuyó a una velocidad significativamente más rápida que después de la inyección de HCl o de capsaicina, respectivamente (Figura 3B). Por lo tanto, en HCl y la capsaicina estómagos expuestos IGP no cayó significativamente durante el período de observación de 30 minutos después de la inyección, mientras que en NaCl- y estómagos de los vehículos expuestos IGP disminuido de manera significativa a niveles de alrededor del 65% de la IGP mide 2-3 min después de la inyección (Figura 3B). Otro efecto de HCl era para mejorar la retención de fluido gástrico como se deduce de una recuperación 100% del volumen de líquido inyectado desde el estómago 30 min después de la inyección (Figura 3C). En contraste, 30 min después de la administración de solución salina, vehículo o capsaicina solamente 30 a 60% del volumen de líquido inyectado se recuperó (Figura 3C). Figura 3 Efectos de la inyección intragástrica de NaCl (0,15 M), HCl (0,35 M), vehículo (Veh) y la capsaicina (Cap, 3,2 mM) en el (A) aumento inicial de la presión intragástrica (IGP), (B) de tiempo subsiguiente curso de IGP y (C) de recuperación de fluido desde el estómago. NaCl, HCl, Veh y Cap fueron inyectados en forma de bolo de 2 ml. Los valores que se muestran en el panel A representan el IGP alcanzó 2-3 minutos después de la inyección. Los valores medidos IGP durante los períodos de 9-10 min y 29-30 minutos después de la inyección (panel B) se expresan como un porcentaje de la subida inicial IGP registrada de 2-3 minutos después de la inyección, y la recuperación del volumen gástrico (panel C ) medido 30 min después de la inyección en bolo se expresa como un porcentaje del volumen de inyección (2 ml). Los medios ± SEM, n = 6-13. ** P < 0,01 frente IGP midió 2-3 min después de la inyección; ++ P < 0,01 frente NaCl.
Discusión
Los resultados del presente estudio muestran que la administración IG de HCl y la capsaicina en ratas genera entradas diferenciales a la NTS y ​​la médula espinal torácica, que está asociado con efectos diferenciales sobre el vaciado gástrico. Como se ha descrito anteriormente [5, 7], la señalización gástrico para el tronco cerebral y la médula espinal se visualizó mediante la expresión del gen inducible c-fos en el nivel de mRNA, un método que se ha establecido como una herramienta estándar en la neuroanatomía funcional para delinear el estímulo activación -evoked de las neuronas [23, 24]. La transcripción del gen c-fos comienza dentro de minutos después de la excitación neuronal [23, 24] y en el NTS parece ser máxima 45 min después de la exposición HCl gástrico [5]. Aunque la exposición a HCl (0,35-,7 ​​M) induce lesión de la mucosa gástrica de una manera relacionada con la concentración, hay evidencia de que la señalización aferente del desafío HCl gástrico no está directamente relacionada con la formación de lesión de la mucosa, debido a que la expresión de la c- fos gen en el NTS puede ser estimulado por concentraciones IG de HCl que inducen poco, si algún daño, epiteliales [5, 7]. Tiene, por lo tanto, ha planteado la hipótesis [5, 7] que un aumento masivo de la H + gradiente de iones a través de la barrera mucosa gástrica es de por sí suficiente para conducir H iones + en la lámina propia donde pueden excitar fibras nerviosas aferentes vagales ya sea directamente [25, 26] o indirectamente a través de factores neuroactivos liberados en el tejido.
la distribución topográfica de las células de ARNm-positivo c-fos en el NTS fue desigual pero similar después de la administración IG de HCl y la capsaicina. Como se indica anteriormente por inmunohistoquímica [22], se observó el mayor número de neuronas activadas-HCl en la parte ventromedial de la NTS. Aparte de la entrada gástrica vagal [27], esta zona de la NTS también recibe información de la lámina I neuronas de la médula a través del tracto spinosolitary [28-30]. sigue siendo la contribución relativa de las entradas vago y espinal a esta parte de la NTS después de la estimulación química del estómago que se determine. México La presente estudio confirma que el exceso de HCl gástrico no induce la proteína c-fos mRNA y c-Fos en el cuerno dorsal de la médula espinal torácica posterior [5, 7], que recibe la entrada más densa de las neuronas aferentes que inervan el estómago de rata [17, 18]. Hallazgos similares se han hecho la exposición siguiente de la mucosa gástrica de rata de hidróxido de amonio [7]. Por lo tanto, parecía como si desafío gástrica con productos químicos nocivos se indica mediante las vías aferentes vagales solamente, una conjetura que fue rechazado por el hallazgo de que la corriente de entrada aferente desde el estómago capsaicina expuesto se envía tanto a la médula espinal y el tronco cerebral. Este resultado está de acuerdo con la expresión de TRPV1, el receptor de la capsaicina, por tanto las neuronas aferentes vagales y espinal que inervan la rata tracto gastrointestinal [12-16]. rastreo retrógrado ha demostrado que el 80 y 71% de los nodose y de la raíz dorsal neuronas ganglionares que irrigan el estómago de rata, respectivamente, expresan TRPV1 [16]. Cuando se aplica directamente a la somata, la capsaicina excita 90% de las neuronas ganglionares de la raíz dorsal y 59% de las neuronas ganglionares de la nodose que se proyectan hacia el estómago de rata [31]. Mientras TRPV1 es fácil de detectar en los ganglios nudosos, el nivel de expresión de TRPV1 en la mayoría de las fibras nerviosas aferentes vagales dentro del estómago está por debajo del umbral de detección inmunohistoquímica [12]. Esta instancia podría explicar por qué la administración IG de la capsaicina induce comparativamente poca expresión de c-fos mRNA en el NTS. No creemos que el pequeño efecto de la capsaicina se debe a una dosificación inadecuada, ya que previamente se ha encontrado que la administración IG de la capsaicina de 0,64 mm es de máxima eficacia para aumentar el flujo sanguíneo de la mucosa gástrica en una neurona que dependen de manera sensorial [19].
Como HCl, la capsaicina se administra en el estómago de rata no pudo mejorar significativamente la expresión general de ARNm c-fos en el medio dorsal de la médula espinal torácica posterior. Sin embargo, el análisis regional reveló que la capsaicina provocó neuronas en la lámina I superficial del cuerno dorsal de expresar c-fos mRNA, un efecto que no se observó después de la administración IG de HCl. Este hallazgo obtenido con capsaicina es consistente con la proyección de las neuronas aferentes viscerales a la lámina I y la parte superficial de la lámina II, así como a la lámina V y el área X de la rata y el gato de la médula espinal [17, 32]. Nuestros datos indican que la administración de capsaicina en la luz gástrica activa las neuronas sensoriales que se proyectan principalmente a la lámina I de la médula espinal. En vista de este hallazgo se puede descartar que la expresión de c-fos es un método inadecuado para visualizar la señalización de la luz gástrica a la médula espinal y que el fracaso de desafío HCl gástrico para inducir ARNm de c-fos en la médula espinal representa quimiorreceptores un resultado falso negativo. Aunque los sensores neuronales lo que se detecta un exceso de HCl en la luz gástrica no se conocen, es concebible que tanto los canales iónicos sensibles al ácido (ASIC) como ASIC3 TRPV1 y están involucrados [33]. Dado que tanto TRPV1 y ASIC3 se expresan por la mayoría de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal que irrigan el estómago de rata [16], parece poco probable que IG HCl no induce ARNm de c-fos en la médula espinal debido a que las fibras aferentes respectivos no llevan el ácido apropiado sensores.
en comparación con el número de neuronas que expresan ARNm c-fos en el NTS, el número de neuronas de ARNm-positivo c-fos en 0,01 mm secciones de la médula espinal era muy pequeña. Esto es probable que refleje que la entrada aferente desde el estómago de la rata a la médula espinal es de menor importancia con respecto a la entrada de la columna vertebral de los tejidos somáticos y que los aferentes espinales electrofisiológicamente caracterizados apenas inervan la mucosa del tracto gastrointestinal [34, 35]. El bajo nivel de transcripción c-fos en las láminas de la médula espinal dorsal estableció la obligación de realizar los experimentos que involucran HCl y la capsaicina estrictamente en paralelo con las destinadas a la solución de control /vehículo respectivo. Se postula que la aparentemente diferente distribución de las células de ARNm-positivo c-fos en la médula espinal dorsal de las ratas de control, como se muestra en los dos paneles de la Figura 2, no sólo puede reflejar la variabilidad inter-experimento, pero también la naturaleza diferente de la de control solución /vehículo: mientras que el vehículo para HCl era solución salina fisiológica, el vehículo para la capsaicina fue solución salina que contenía etanol y Tween 80.
el efecto de la capsaicina IG para aumentar c-fos mRNA de inducción en la lámina I de la médula espinal se asoció con una disminución significativa en la expresión de ARNm c-fos en las láminas III y IV. No tenemos ninguna explicación sencilla para esta observación. Dado que las láminas III y IV no parecen recibir el aporte directo de las vísceras [17, 32], la hipótesis de que la reducción de la formación de ARNm de c-fos en estas láminas es un efecto indirecto de la capsaicina. Es concebible que los impulsos aferentes viscerales a través de la lámina I neuronas inhibitorias activa las vías que deprimen la excitabilidad de la lámina III y IV neuronas. México La señalización aferente de la exposición de la mucosa gástrica a la capsaicina y el exceso de HCl se determina no sólo por la concentración de la sustancia química nociva, pero también por la duración de su presencia en el lumen gástrico. Previamente se ha encontrado que, en relación con la solución salina, la administración IG de HCl a ratas anestesiadas prolonga la retención de líquidos en la adaptación estómago y los retrasos de IGP [7, 20]. HCl inducida resultados de retención de fluidos gástricos de la inhibición del vaciado gástrico y fluido gástrico mejorada, bicarbonato y la secreción de moco [20, 36], pero el análisis del contenido gástrico estaba más allá del alcance de este estudio. inhibición evocado-HCl de vaciado gástrico está mediada por los reflejos neuronales que se inician tanto en el estómago y el duodeno [20, 37-40]. La concentración de HCl probado para sus efectos motores gastropyloric en ratas anestesiadas se redujo a 0,35 M, porque la anestesia debilita la gástrico barrera de la mucosa de HCl y la concentración de IG de HCl (0,5 M) a prueba por su efecto sobre la expresión central de c-fos induce extensa lesión en ratas anestesiadas pero causa daño gástrico menor en animales conscientes [5]. Como los experimentos revelaron, la exposición gástrica para HCl y la capsaicina modifica la motilidad gastropyloric de manera diferencial. Mientras que el vaciado gástrico fue bloqueado por HCl, pero dejó inalterada por la capsaicina, la adaptación de IGP fue impedido por tanto HCl y la capsaicina. El efecto de la capsaicina para retrasar la adaptación IGP puede estar relacionada con su capacidad para inducir la contracción o la relajación de la musculatura gástrica de rata, el tipo de respuesta en función de la dosis de la capsaicina y la región y el músculo capa gástrico en estudio [19, 41 a 43 ].
con respecto al efecto dispar de HCl IG y la capsaicina en la expresión de la médula c-fos es especialmente importante tener en cuenta que, a diferencia de HCl, la capsaicina no pudo mejorar la recuperación de fluido gástrico, lo que significa que el vaciado gástrico produjo irreprochable y IG capsaicina administrada fue transportado rápidamente en el intestino delgado superior. Por lo tanto, se podría argumentar que la respuesta de c-fos capsaicina-evocó en el NTS, que era más pequeño que el de HCl, y la médula espinal son debidas a la excitación por capsaicina provocada tanto de los aferentes gástricas e intestinales, mientras que el efecto excitatorio de HCl es limita en gran medida a los aferentes gástricos. El fracaso de desafío HCl gástrico para inducir la expresión de c-fos en la médula espinal no se puede explicar por la capacidad reportada de las vías aferentes vagales para activar vías descendentes y de ese modo inhibir la entrada aferente a la médula espinal [44, 45], porque vagotomía crónica bilateral falla para revelar cualquier aumento en la inducción del ARNm de c-fos vertebral debido al desafío de HCl gástrico [5]. Hay otras formas de explicar la capacidad diferencial de HCl IG y la capsaicina para inducir ARNm de c-fos en el NTS y ​​la médula espinal, pero el análisis de estos factores estaba más allá del alcance de este estudio. Por ejemplo, hay evidencia de que la capsaicina es poco absorbido en la pared gástrica [19], lo que también explica por qué IG capsaicina administrada es relativamente débil en la estimulación de las fibras aferentes vagales gástricas que se proyectan hacia el NTS, mientras que la capsaicina transportados a la parte superior del intestino pueden más llegar fácilmente y estimular las terminales nerviosas aferentes espinales en la lámina propia intestinal.
Debido a su naturaleza exploratoria, el presente estudio tiene sus limitaciones. Por lo tanto, es probable que el efecto diferencial de IG capsaicina y HCl administrada en vías aferentes vagales y espinales a depender no sólo de la velocidad de vaciado gástrico y la cinética de absorción de HCl y la capsaicina sino también de la extensión de la lesión de la mucosa y la magnitud de la sangre de la mucosa fluir. Mientras que la integridad de la mucosa gástrica se altera solamente por HCl [5, 7, 46], pero no por la capsaicina [11], el flujo sanguíneo de la mucosa gástrica es elevado por tanto la capsaicina [19] y backdiffusing HCl [46].
Conclusión desafío
gástrico con HCl y la capsaicina se señaliza diferencialmente a la NTS y ​​la médula espinal, lo que indica que los dos estímulos son procesados ​​por las vías aferentes nociceptivas dispares. Desde HCl inhibe el vaciado gástrico, mientras que la capsaicina no lo hace, se infiere que la entrada aferente evocado-HCl a la NTS se transmite por las fibras aferentes vagales en el estómago, mientras que la activación de NTS y ​​la lámina vertebral I neuronas por la capsaicina está mediada tanto por vagal aferentes en el estómago y por los aferentes espinales en el intestino delgado superior. Se necesitan más experimentos para determinar cómo estas conclusiones se refieren a chemonociception gástrico. De acuerdo con nuestros datos de c-fos, nocicepción provocada por un exceso de HCl gástrico está mediada por las neuronas aferentes vagales [4], y permanece a la espera de ser examinado que las vías aferentes transmiten nocicepción evocada por la capsaicina gástrico. Mechanonociception evocado por la distensión del estómago es provocada por aferentes espinales [4], aunque la expresión de c-fos es visto tanto en la médula espinal y, en mayor medida, en el tronco cerebral [47].
Métodos
Animales Francia el estudio fue aprobado por un comité de ética en el Ministerio Federal de Educación, Ciencia y Cultura de la República de Austria y llevó a cabo de acuerdo con la Directiva del Consejo de Comunidades Europeas de 24 de noviembre de 1986 (86/609 /CEE) . Los experimentos fueron diseñados de tal manera que se reduzcan al mínimo el número de animales utilizados y su sufrimiento. Se utilizaron la misma edad ratas Sprague-Dawley (Abteilung für Labortierkunde und -genetik, Universidad de Medicina de Viena, Himberg, Austria) con un peso de 180-220 g. Se alojaron en grupos de cuatro en jaulas de plástico transparentes en condiciones estándar; luces encendidas desde las 6:00 AM hasta las 6:00 PM.
protocolos experimentales
Todos los experimentos se llevaron a cabo durante la fase de luz 8:00-12:00a.m.. Veinte horas antes de el inicio de los experimentos, las ratas fueron privados de comida para asegurar que el estómago estaba vacío en el momento de los experimentos, mientras que el agua estaba disponible ad libitum a lo largo de esta fase preparatoria. Además, las ratas se colocaron en grupos de dos en una rejilla de piso para evitar la coprofagia. Dos estudios con diferentes protocolos experimentales se llevaron a cabo.
Estudio 1 se llevó a cabo con animales no anestesiados. solución salina fisiológica (NaCl 0,15 M), HCl (0,5 M), la capsaicina (0,64 y 3,2 mM) o su vehículo se administraron IG en un volumen de 10 ml /kg a través de un bebé suave tubo de alimentación (diámetro exterior 2,2 mm; Portex, Hythe , REINO UNIDO). Después de 45 min, las ratas se sacrificaron mediante inyección intraperitoneal de una sobredosis de pentobarbital (200 mg /kg; Intervet, Viena, Austria) y su cable de tronco cerebral y la médula elimina rápidamente. La capsaicina (Sigma, Viena, Austria) se disolvió en un medio que contiene 10% de Tween 80, 10% de etanol y 80% de solución salina fisiológica para dar soluciones madre de 2 y 10 mg /ml (6,4 mM y 32) capsaicina. Estas soluciones madre se diluyeron con solución salina fisiológica para dar soluciones de ensayo de la capsaicina 0,64 y 3,2 mM, respectivamente. El vehículo para la capsaicina consistió en 1% de Tween 80, 1% de etanol y 98% de solución salina fisiológica
Estudio 2 se realizó con animales que se anestesiaron con fenobarbital (230 mg /kg por vía intraperitoneal; Sigma). Y se colocan en una mesa termostatizado a mantener su temperatura rectal a 37 grados Celsius [20]. Las ratas fueron entonces equipados con una cánula traqueal para facilitar la respiración espontánea. Una cánula en la vena yugular izquierda se utiliza para la infusión continua de solución salina fisiológica (1,5 ml /h) para evitar la deshidratación. Después de una laparotomía media un catéter IG (diámetro exterior: 2,2 mm) se insertó en el estómago a través del esófago y el estómago enrojecida [20]. Con su punta se posiciona en la región de corpus, el catéter se utiliza para registrar la presión intragástrica (IGP) a través de un transductor de presión, así como para inyectar fluido en y drenarlo desde el estómago [20]. Este método de medición IGP se ha descrito y validado en un estudio anterior [20]. Después de un periodo de equilibrio de 30 min, a 2 ml de bolo fluido se inyecta lentamente en el estómago durante un período de 5 s y se deja en el estómago durante un período de 30 min después de lo cual se drenó el estómago y el peso del fluido recuperado determinado . La recuperación de líquido del estómago (una medida indirecta del vaciado gástrico) se expresó como un porcentaje del peso del fluido administrado en el estómago [20]. Cada rata se sometió a las pruebas de inyección 4 /recuperación a intervalos de 15 minutos durante el cual el estómago se deja vacío. En primer lugar, dos ensayos de cebado con solución salina se llevaron a cabo, seguido bien por un ensayo de prueba con solución salina y un ensayo de prueba con HCl (0,35 M) o por un ensayo de prueba con vehículo y una prueba de ensayo con capsaicina (3,2 mM). IGP se promedió durante los períodos de 2-3 min, 9-10 min y 29-30 min después de la inyección. Desde tal como se describe antes [20] el aumento máximo de IGP post-inyección variada debido a las diferencias en la velocidad de inyección, el IGP promedio durante el período de 2-3 minutos después de la inyección se tomó como 100% y la IGP registrada durante la observación subsiguiente períodos expresan como un porcentaje de ese valor de referencia.
in situ hibridación autorradiografía Francia El tronco del encéfalo y la médula espinal fueron retirados rápidamente y se congelaron en hielo seco en polvo. secciones coronales (0,01 mm) se cortaron en serie desde el tronco cerebral en la extensión rostrocaudal del área postrema y el caudal de la médula espinal torácica con un criostato [5, 6, 22]. Cada sexta sección se procesó para la hibridación in situ con una sonda de oligodesoxirribonucleótido marcado en el extremo con [ 35S] desoxiadenosina 5 'de la 3 (α-tio) trifosfato como se describe anteriormente [6]. Las secciones se sumergieron en emulsión fotográfica Ilford K5 y, después de 18-25 días de exposición en cajas selladas a 4 grados centígrados, se desarrollaron los autorradiogramas y las secciones de contraste con hematoxilina y coverslipped [6]. La especificidad del procedimiento fue demostrada por la ausencia de cualquier señal de hibridación cuando las secciones de control se hibridaron con una mezcla de sonda marcada con un exceso de 100 veces de sonda no marcada ( "frío").
Los autorradiogramas se examinaron en un Coded forma con un microscopio de luz (Axiophot, Zeiss, Oberkochen, Alemania) acoplado a un sistema de análisis de imagen por ordenador (Imaging, St. Catharines, Ontario, Canadá). Las células se consideran c-fos mRNA-positivo cuando su densidad de grano era al menos 10 veces más alto que el de fondo [6]. Con el fin de mejorar la fiabilidad de los resultados cuantitativos, se evaluaron 5 secciones del tronco cerebral y 7-10 secciones de la médula espinal de cada animal. Estas secciones se seleccionan de tal manera que eran 0,05 mm separados unos de otros a fin de evitar que las mismas células se contaron dos veces. Las células de ARNm-positivo c-fos por sección se contaron de manera unilateral en el NTS en el nivel de la área postrema y en el medio dorsal de la médula espinal a nivel torácico caudal (T8-T12). Estas estructuras se identifican de acuerdo con Molander y Grant [48] y Paxinos y Watson [49]. En el medio dorsal de la médula espinal, la distribución de células de ARNm-positivo c-fos para láminas IV (LI-LV), zona X (AX) alrededor del canal central y el núcleo intermediolateral (IM.LN) se evaluó de acuerdo a la rata citoarquitectura espinal descrito por Molander et al.

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