effetti differenziali di acido intragastrica e capsaicina sullo svuotamento gastrico e l'input afferenti al midollo spinale di ratto e del tronco cerebrale

effetti differenziali di acido intragastrica e capsaicina sullo svuotamento gastrico e l'ingresso afferenti al midollo spinale di ratto e del tronco cerebrale
Abstract
sfondo
Acido cloridrico (HCl) è una potenziale minaccia per l'integrità della mucosa gastrica ed è conosciuta di contribuire al dolore addominale superiore. Abbiamo già scoperto che sfida della mucosa gastrica con un eccesso di HCl viene segnalata al tronco cerebrale di ratto, ma non il midollo spinale, come visualizzato dal espressione di c-fos acido ribonucleico messaggero (mRNA), un marker surrogato di eccitazione neuronale. Questo studio ha esaminato se l'esposizione della mucosa gastrica alla capsaicina, uno stimolante della afferenti nocicettivi che non danneggia la mucosa gastrica, viene segnalata sia tronco cerebrale e del midollo spinale e se le differenze nella segnalazione afferente gastrica sfida HCl e capsaicina sono legati a diversi effetti sulla lo svuotamento gastrico.
Risultati
I ratti sono stati trattati intragastricamente con veicolo, HCl o capsaicina, attivazione dei neuroni nel tronco cerebrale e nel midollo spinale è stato visualizzato da ibridazione in situ autoradiografia per c-fos mRNA, e lo svuotamento gastrico deduce dalla ritenzione di intragastricamente somministrato fluido. Rispetto al veicolo, HCl (0,5 M) e capsaicina (3,2 mM) è aumentato c-fos trascrizione nel nucleo del tratto solitarii da fattori rispettivamente 7.0 e 2.1,. Capsaicina anche causato un aumento 5.2-fold di espressione mRNA c-fos in lamina I caudale midollo spinale toracico, anche se il numero di cellule positive mRNA-c-fos in questa lamina era molto piccola. Così, in media solo 0,13 e 0,68 le cellule mRNA-positivo c-fos sono stati contati a 0,01 mm sezioni della lamina unilaterale in seguito alla somministrazione intragastrica di veicolo e capsaicina, rispettivamente. Al contrario, intragastrica HCl omesso per indurre c-fos mRNA nel midollo spinale. Misurazione della ritenzione di liquidi gastrici rivelato che HCl soppresso lo svuotamento gastrico, mentre la capsaicina non ha fatto.
Conclusione
I risultati di questo studio mostrano che l'esposizione della mucosa gastrica di HCl e capsaicina è differenziale trasmesso al tronco encefalico e del midollo spinale. Poiché solo blocchi HCl svuotamento gastrico, si ipotizza che i due stimoli sono trasdotti da diverse vie afferenti. Ne deduciamo che HCl è segnalata esclusivamente dalle afferenze vagali gastrici mentre la capsaicina è trattati sia gastrici afferenze spinali vago e intestinali.
Sfondo
gastrici malattie acido-correlate sono tra le alterazioni della mucosa più diffusi del tratto gastrointestinale superiore. Vi sono anche prove che acido cloridrico (HCl) contribuisce al dolore associato a reflusso gastro-esofageo e ulcera peptica e per il dolore toracico non cardiaco e dispepsia funzionale [1-3]. chemonociception gastrico evocato da esposizione dello stomaco di ratto per eccesso di HCl è mediata dai neuroni afferenti vagali, dato che la risposta al dolore visceromotoria a intragastrico (IG) la somministrazione di HCl è abolito dal vagotomia bilaterale, mentre la risposta visceromotoria di distensione rimane inalterato [4] . Questo risultato è coerente con la nostra osservazione che la somministrazione IG di HCl viene segnalata al solitarii nucleo del tratto (NTS) del tronco cerebrale di ratto, l'area di terminazione centrale della afferenti del vago, come visualizzato dal espressione di acido ribonucleico messaggero (mRNA) per l'immediato inizio gene c-fos, mentre nessuna induzione di c-fos mRNA è visto nel midollo spinale [5, 6]. Analogamente, sfida gastrica con idrossido di ammonio induce c-fos mRNA e proteine ​​solo nel tronco cerebrale, ma non il midollo spinale, del ratto [7]. Mentre sia HCl e idrossido di ammonio danneggiano la mucosa gastrica a concentrazioni che causano la traduzione quasi massimale del gene c-fos nella NTS [7], la capsaicina è una sostanza chimica che stimola i neuroni afferenti gastrointestinali [8-10] senza causare danni al ratto stomaco [11]. Questo perché la capsaicina stimola i neuroni afferenti da gating transitori potenziale del recettore canali ionici di tipo vanilloidi 1 (TRPV1), che sono espressi da entrambi i neuroni afferenti vagali e spinali che innervano lo stomaco e l'intestino di ratto [12-16].
L'obiettivo generale di questo studio esplorativo era testare se sfida mucosa gastrica con capsaicina e l'eccesso di HCl è differenzialmente trasmessa al tronco cerebrale di ratto e nel midollo spinale e se il trattamento differenziale dei due stimoli avviene a livello del tratto gastrointestinale superiore. Due serie di esperimenti sono stati effettuati per rispondere a queste domande. Nel primo studio, IG somministrata capsaicina e HCl sono stati confrontati i loro effetti sulla espressione di c-fos mRNA in NTS e caudale midollo spinale toracico che riceve l'input afferente densa dallo stomaco di ratto [17, 18]. E 'stato in particolare esaminato se la somministrazione di IG HCl e capsaicina ha un effetto diverso sui neuroni in specifiche lamine e nuclei del midollo spinale dorsale. Le concentrazioni di HCl (0,5 M) e capsaicina (0,64 e 3,2 M) testato in questi esperimenti sono stati selezionati da esperimenti precedenti. L'esposizione del ratto mucosa gastrica di HCl (0,5 M) provoca una induzione distintivo, ma submassimale di c-fos mRNA nel tronco cerebrale [5], mentre la somministrazione IG di 0,64 mM capsaicina è massimamente efficace nell'aumentare gastrica flusso ematico della mucosa in neuroni sensoriali -dipendente [19].
Poiché è stato accertato che la segnalazione afferente HCl e capsaicina al midollo spinale NTS ed è diversa, lo scopo del secondo studio era valutare se HCl e capsaicina influenza motilità gastrica e svuotamento modo differenziale. Si è motivato che l'entità della risposta c-fos il cavo NTS e midollo dipende sia dalla concentrazione delle sostanze chimiche e la durata della loro presenza nello stomaco. E 'stato precedentemente scoperto che la somministrazione di un eccesso di HCl IG inibisce lo svuotamento gastrico e altera pressione intragastrica [5, 20]. I risultati di questo studio rivelano che, a differenza di eccesso di HCl, la capsaicina non inibisce lo svuotamento gastrico. Si ipotizza quindi che sfida gastrica HCl viene segnalata esclusivamente al tronco cerebrale via afferenti vagali, perché viene mantenuto nello stomaco per un periodo prolungato di tempo, mentre entrambi afferenti spinali vagali e duodenali gastriche rispondere alla somministrazione IG di capsaicina, la svuotamento dei quali nel duodeno non è ritardato
. Risultati
Effetti di HCl e capsaicina per indurre c-fos mRNA nel NTS e nel midollo spinale (studio 1)
Come illustrato in precedenza [5, 21], amministrazione IG di 0,5 M HCl causato molti neuroni nel NTS per esprimere c-fos mRNA se confrontato con la somministrazione IG di soluzione fisiologica. Il numero di cellule mRNA-positive c-fos per girone visto dopo somministrazione IG di HCl era 7,0 volte più grande dopo somministrazione IG di soluzione fisiologica (Figura 1). Il numero di neuroni mRNA-positive c-fos per girone NTS conteggiato dopo somministrazione IG del veicolo tende ad essere superiore dopo la somministrazione di soluzione fisiologica, anche se questo effetto non era statisticamente significativa (Figura 1). Rispetto al veicolo, capsaicina (0.64 e 3.2 mM) potenziato il numero di neuroni mRNA-positive c-fos per girone NTS, questo effetto in funzione della concentrazione del farmaco. Come si vede in figura 1, solo la concentrazione di 3.2 mM capsaicina era in grado di aumentare significativamente l'induzione di c-fos mRNA di un fattore di 2,1. La distribuzione delle cellule mRNA-positive c-fos nella NTS dopo esposizione IG HCl (0,5 M) e capsaicina (3,2 mM) era irregolare, il maggior numero di cellule attivate verificano nella parte ventromediale del NTS [22]. Figura 1 Numero di cellule mRNA-positivo c-fos per sezione (0.01 mm) nel unilaterale NTS determinato 45 minuti dopo la somministrazione IG di NaCl (0,15 M), HCl (0,5 M), veicoli (Veh) e capsaicina (Cap, 0,64 e 3.2 mM). Mezzi + SEM, n come indicato. * P < 0.05 contro Veh, ** P < 0,01 contro NaCl.
In accordo con i precedenti risultati [5], l'esposizione IG a 0,5 M HCl non è riuscito a indurre qualsiasi espressione di c-fos mRNA nella metà dorsale del midollo spinale caudale toracica. Così, il numero totale di cellule positive mRNA-c-fos per dorsali sezione midollare conteggiato dopo esposizione IG salina fisiologica era 1,30 ± 0,29 (n = 4) e dopo l'esposizione a IG HCl 1,33 ± 0,18 (n = 4). Questa mancanza di effetto di HCl è stata osservata anche quando la distribuzione di cellule mRNA-positive c-fos a LI, LII, LIII, LIV, LV, AX e IMLN dopo somministrazione IG di HCl è stata confrontata con quella dopo somministrazione IG di soluzione fisiologica ( Figura 2A). amministrazione IG di capsaicina (3,2 mM) similmente non è aumentata in modo significativo l'espressione di c-fos mRNA nel midollo spinale dorsale, dato che il numero totale di cellule mRNA-positive c-fos per girone contati dopo esposizione IG a veicolo era di 2,19 ± 0.32 (n = 6) e dopo l'esposizione IG alla capsaicina era 1,94 ± 0,23 (n = 7). L'analisi della distribuzione delle cellule mRNA-positive c-fos a LI, LII, LIII, LIV, LV, AX e IMLN rivelato, tuttavia, che la capsaicina causato un significativo aumento 5.2-fold di espressione mRNA c-fos in LI, che è andato in parallelo con una significativa riduzione nella formazione di c-fos mRNA in LIII e LIV (Figura 2B). Va notato che il livello di trascrizione c-fos era molto bassa, tipicamente inferiore a 0,7 cellule mRNA-positive c-fos a lamina sono stati contati in sezioni del unilaterale midollo spinale dorsale 0,01 mm (figura 2). Per questo motivo, gli esperimenti di HCl e capsaicina erano rigorosamente eseguiti in parallelo con quelli che coinvolgono la rispettiva soluzione di controllo /veicolo (figura 2). Figura 2 Numero di cellule mRNA-positive c-fos per girone (0.01 mm) in diverse lamine e le aree del unilaterale metà dorsale caudale midollo spinale toracico determinato 45 min dopo la somministrazione IG di (A) NaCl (0,15 M), HCl (0,5 M), (B) veicoli (Veh) e capsaicina (Cap, 3,2 mm). I grafici mostrano i conteggi per lamine I-V (LI-LV), zona X (AX) e il nucleo intermediolaterale (IMLN). Mezzi + SEM, n come indicato. * P < 0.05, ** P < 0,01 contro Veh.
Effetti di HCl e capsaicina sulla pressione intragastrica e il recupero del liquido gastrico (studio 2)
Il IGP di base misurato prima della somministrazione di qualsiasi mezzo era tra 400 e 500 Pa [20]. IG iniezione di un bolo di 2 ml di fluido aumentata IGP a un livello cui grandezza era indipendente dal fatto che il fluido iniettato era salina, HCl (0,35 M), veicolo o capsaicina (3.2 mM) come determinato 2-3 min dopo l'iniezione (Figura 3A ). Al contrario, la durata del successivo declino IGP dipendeva dalla natura del mezzo somministrata. Dopo l'iniezione di soluzione salina o di un veicolo, IGP è diminuito ad un tasso significativamente più veloce dopo l'iniezione di HCl o capsaicina, rispettivamente (Figura 3B). Così, in HCl e stomaci capsaicina esposti IGP non è caduto in modo significativo durante il periodo di osservazione di 30 minuti dopo l'iniezione, mentre in NaCl- e stomaci dei veicoli esposti IGP notevolmente diminuito a livelli di circa il 65% della IGP misurato 2-3 min post-iniezione (Figura 3B). Un altro effetto di HCl è stato quello di migliorare la ritenzione di liquidi gastrici come si deduce da un recupero del 100% del volume di fluido iniettato dallo stomaco 30 min dopo l'iniezione (Figura 3C). Al contrario, 30 min dopo la somministrazione di soluzione fisiologica, veicolo o capsaicina solo 30-60% del volume di fluido iniettato è stato recuperato (Figura 3C). Figura 3 Effetti di iniezione intragastrica di NaCl (0,15 M), HCl (0,35 M), veicolo (Veh) e capsaicina (Cap, 3.2 mM) in (A) aumento iniziale della pressione intragastrica (IGP), (B) momento successivo corso di IGP e (C) il recupero del fluido dallo stomaco. NaCl, HCl, Veh e Cap sono state iniettate in 2 ml in bolo. I valori come da tabella A rappresentano la IGP ha raggiunto 2-3 minuti dopo l'iniezione. I valori IGP misurati durante i periodi di 9-10 min e 29-30 min post-iniezione (pannello B) sono espressi come percentuale della crescita IGP iniziale registrato dopo l'iniezione 2-3 minuti, e il recupero del volume gastrico (pannello C ) misurata 30 min dopo l'iniezione in bolo è espresso come percentuale del volume di iniezione (2 ml). Mezzi + SEM, n = 6-13. ** P < 0,01 contro IGP misurato 2-3 minuti dopo l'iniezione; ++ P < 0,01 contro NaCl.
Discussione
I risultati dello studio mostrano che la somministrazione di corrente IG di HCl e capsaicina a ratti genera ingressi differenziali al NTS e toracico del midollo spinale, che è associato con effetti differenziali sullo svuotamento gastrico. Come descritto in precedenza [5, 7], segnalazione gastrica al tronco cerebrale e del midollo spinale è stato visualizzato mediante espressione del gene inducibile c-fos a livello di mRNA, un metodo che è stato stabilito come strumento standard in neuroanatomia funzionale a delineare stimolo attivazione -evoked dei neuroni [23, 24]. Trascrizione del gene c-fos inizia pochi minuti dopo l'eccitazione neuronale [23, 24] e nel NTS sembra essere massimo 45 minuti dopo il challenge HCl gastrico [5]. Sebbene l'esposizione a HCl (0,35-0,7 M) induce lesioni della mucosa gastrica in modo correlato alla dose, è dimostrato che la segnalazione afferente sfida HCl gastrico non è direttamente collegata alla formazione di lesioni della mucosa, perché l'espressione del c- fos gene nel NTS può essere stimolato da concentrazioni IG di HCl che inducono piccolo, all'occorrenza, danno epiteliale [5, 7]. Si è quindi, stato ipotizzato, [5, 7] che un massiccio aumento della H + ioni gradiente attraverso la barriera della mucosa gastrica è di per sé sufficiente per guidare H + ioni nella lamina propria, dove possono eccitare vagale fibre nervose afferenti direttamente [25, 26] o indirettamente tramite fattori neuroattivi rilasciati nel tessuto.
la distribuzione topografica delle cellule mRNA-positivo c-fos nella NTS era irregolare, ma simile dopo la somministrazione di IG HCl e capsaicina. Come già dimostrato da immunoistochimica [22], il più alto numero di neuroni HCl-attivati ​​è stato visto nella parte ventromediale della NTS. Oltre ingresso gastrico vagale [27], l'area della NTS riceve anche input da lamina spinale I neuroni attraverso il tratto spinosolitary [28-30]. Il contributo relativo degli ingressi vago e spinali a questa parte della NTS dopo stimolazione chimica dello stomaco resta da determinare.
Il presente studio conferma che l'eccesso di HCl gastrico non riesce a indurre c-fos mRNA e c-Fos proteina corno dorsale del midollo spinale toracico posteriore [5, 7], che riceve l'input più densa da neuroni afferenti che innervano il ratto stomaco [17, 18]. Risultati simili sono state fatte in seguito all'esposizione del ratto mucosa gastrica di idrossido di ammonio [7]. Sembrava così come sfida gastrica con sostanze chimiche nocive è segnalata da afferenze vagali solo una congettura che è stata respinta dalla constatazione corrente afferenti ingresso dallo stomaco capsaicina-esposto viene inviato sia al midollo spinale e del tronco cerebrale. Questo risultato è in linea con l'espressione di TRPV1, il recettore della capsaicina, da entrambi i neuroni afferenti vagali e spinali che innervano il ratto tratto gastrointestinale [12-16]. tracciamento retrogrado ha dimostrato che l'80 e il 71% delle nodose e radici dorsali dei neuroni gangliari che forniscono lo stomaco di ratto, rispettivamente esprimere TRPV1 [16]. Quando viene applicato direttamente al somata, capsaicina stimola il 90% dei neuroni gangliari della radice dorsale e il 59% dei neuroni gangliari nodose che proiettano allo stomaco di ratto [31]. Mentre TRPV1 è facile individuare nei gangli nodosi, il livello di espressione TRPV1 nella maggior parte delle fibre nervose afferenti vagali all'interno dello stomaco è inferiore alla soglia di rilevamento immunoistochimica [12]. Questo esempio potrebbe spiegare il motivo per cui la somministrazione IG di capsaicina induce relativamente piccola espressione di c-fos mRNA nel NTS. Non pensiamo che il piccolo effetto della capsaicina è dovuto al dosaggio insufficiente, in quanto è stato precedentemente trovato che la somministrazione IG di 0,64 mm capsaicina è massimamente efficace per aumentare gastrica flusso ematico della mucosa in modo neurone-dipendente sensoriali [19].
Come HCl, capsaicina somministrato nello stomaco di ratto non è riuscito a migliorare in modo significativo l'espressione complessiva di c-fos mRNA nella metà dorsale del posteriore toracico del midollo spinale. Tuttavia, un'analisi regionale rivelato che la capsaicina causato neuroni superficiale lamina I del corno dorsale di esprimere c-fos mRNA, un effetto che non è stato visto dopo somministrazione IG di HCl. Questo risultato ottenuto con capsaicina è coerente con la proiezione di neuroni afferenti viscerali a lamina I e la parte superficiale della lamina II nonché lamina V e la zona X del topo e gatto midollo spinale [17, 32]. I nostri dati indicano che la somministrazione di capsaicina nel lume gastrico attiva i neuroni sensoriali che proiettano principalmente lamina I del midollo spinale. In vista di tale individuazione si può escludere che l'espressione di c-fos è un metodo inadeguata per visualizzare chemoreceptor segnalazione dal lume gastrico al midollo spinale e che il guasto di sfida HCl gastrico per indurre c-fos mRNA nel midollo spinale rappresenta un risultato falso negativo. Anche se i sensori neurali in cui viene rilevato l'eccesso di HCl nel lume gastrico non sono noti, è concepibile che sia TRPV1 e canali ionici acido-sensing (ASIC), come ASIC3 sono coinvolti [33]. Dal momento che sia TRPV1 e ASIC3 sono espressi a maggioranza dei neuroni dei gangli della radice dorsale che forniscono lo stomaco di ratto [16], sembra improbabile che IG HCl non riesce a indurre c-fos mRNA nel midollo spinale in quanto i rispettivi afferenti non sopportano l'acido appropriato sensori.
confrontato con il numero di neuroni che esprimono c-fos mRNA nel NTS, il numero di neuroni mRNA-positive c-fos di 0,01 mm sezioni del midollo spinale era molto piccola. Questo riflette probabilmente che l'input afferente dallo stomaco di ratto al midollo spinale è minore rispetto all'ingresso midollo da tessuti somatici e che afferenze spinali electrophysiologically caratterizzato difficilmente innervano la mucosa del tratto gastrointestinale [34, 35]. Il basso livello di trascrizione c-fos nella lamine del midollo spinale dorsale ha reso obbligatorio per eseguire gli esperimenti che coinvolgono HCl e capsaicina rigorosamente in parallelo con quelle che coinvolgono la rispettiva soluzione di controllo /veicolo. Ipotizziamo che apparentemente diversa distribuzione delle cellule mRNA-positive c-fos nel midollo spinale dorsale ratti di controllo, come mostrato nelle due pannelli di figura 2, non solo può riflettere inter-esperimento variabilità ma anche la diversa natura del controllo /soluzione veicolo: mentre il veicolo per HCl era salina fisiologica, il veicolo per capsaicina veniva salina contenente etanolo e Tween 80.
l'effetto di IG capsaicina per aumentare c-fos induzione mRNA in lamina I del midollo spinale è stato associato con una significativa diminuzione dell'espressione di mRNA di c-fos in lamine III e IV. Non abbiamo alcuna spiegazione straight-forward per questa osservazione. Poiché lamine III e IV non sembrano ricevere input diretto dai visceri [17, 32], ipotizziamo che la riduzione della formazione di mRNA c-fos in queste lamine è un effetto indiretto di capsaicina. In teoria, viscerale ingresso afferenti tramite lamina neuroni I attiva vie inibitorie che deprimono l'eccitabilità della lamina III e IV neuroni.
La segnalazione afferente di esposizione della mucosa gastrica alla capsaicina e l'eccesso di HCl è determinata non solo dalla concentrazione della sostanza chimica nociva, ma anche la durata della sua presenza nel lume gastrico. E 'stato precedentemente scoperto che, rispetto alla soluzione salina, la somministrazione IG di HCl a ratti anestetizzati prolunga ritenzione di liquidi nello stomaco e ritardi adattamento delle IGP [7, 20]. HCl-indotta risultati ritenzione dei fluidi gastrici da inibizione di svuotamento gastrico e del liquido gastrico avanzato, il bicarbonato e secrezione di muco [20, 36], ma l'analisi del contenuto gastrico era oltre lo scopo di questo studio. inibizione HCl evocato di svuotamento gastrico è mediata dai riflessi neurali che vengono avviate sia nello stomaco e duodeno [20, 37-40]. La concentrazione di HCl testato per i suoi effetti a motore gastropyloric nei ratti anestetizzati è stato ridotto a 0,35 M, in quanto l'anestesia indebolisce la barriera della mucosa gastrica di acido cloridrico e la concentrazione IG di HCl (0,5 M) testato per il suo effetto sull'espressione centrale c-fos induce vasta lesioni in ratti anestetizzati, ma provoca minore danno gastrico in animali coscienti [5]. Come gli esperimenti hanno rivelato, l'esposizione gastrico per HCl e capsaicina modificato motilità gastropyloric in modo differenziale. Mentre lo svuotamento gastrico è stato bloccato da HCl ma ha lasciato inalterato dalla capsaicina, l'adattamento della IGP è stato impedito sia HCl e capsaicina. L'effetto della capsaicina per ritardare IGP adattamento può essere correlata alla sua capacità di indurre contrazione o rilassamento della muscolatura gastrica di ratto, il tipo di risposta in funzione della dose di capsaicina e lo strato regione e muscolare gastrica in fase di studio [19, 41-43 ].
per quanto riguarda l'effetto disparati IG HCl e capsaicina sul midollo espressione c-fos era particolarmente importante notare che, a differenza di HCl, capsaicina omesso per migliorare il recupero del fluido gastrico, il che significa che lo svuotamento gastrico verificato intatta e IG capsaicina somministrata è stata rapidamente trasportata nel piccolo intestino superiore. Si potrebbe quindi sostenere che il c-fos risposta capsaicina-evocata nel NTS, che era più piccola di quella di HCl, e il midollo spinale sono dovute all'eccitazione capsaicina-evocato di entrambe le afferenze gastriche e intestinali, mentre l'effetto eccitatorio di HCl è in gran parte confinato afferenze gastrici. Il fallimento di sfida HCl gastrico per indurre l'espressione di c-fos nel midollo spinale non può essere spiegato dalla capacità riferito afferenti vagali per attivare vie discendenti e quindi inibire input afferenti al midollo spinale [44, 45], perché vagotomia cronica bilaterale fallisce di rivelare qualsiasi aumento spinale c-fos induzione mRNA causa di sfida gastrica HCl [5]. Ci sono altri modi per spiegare la diversa capacità di IG HCl e capsaicina per indurre c-fos mRNA nel NTS e del midollo spinale, ma l'analisi di questi fattori era oltre lo scopo di questo studio. Per esempio, vi è la prova che la capsaicina è poco assorbito nella parete gastrica [19], il che spiegherebbe anche perché IG capsaicina somministrata è relativamente debole per stimolare afferenze vagali gastrici sporgenti al NTS, mentre capsaicina trasportato al piccolo intestino superiore può più facilmente raggiungere e stimolare spinali terminali nervose afferenti nella lamina propria intestinale.
Grazie alla sua natura esplorativa, l'attuale studio ha i suoi limiti. Così, l'effetto differenziale di IG somministrata capsaicina e HCl su vie afferenti vagali e spinali possa dipendere non solo la velocità di svuotamento gastrico e la cinetica di assorbimento di HCl e capsaicina, ma anche dalla entità del danno mucosale e la grandezza di sangue mucosa flusso. Mentre l'integrità della mucosa gastrica viene disturbata solo da HCl [5, 7, 46] ma non da capsaicina [11], gastrica flusso ematico della mucosa è elevata sia capsaicina [19] e backdiffusing HCl [46].
Conclusione sfida
gastrica con HCl e capsaicina è differenziale segnalato al NTS e del midollo spinale, che indica che i due stimoli vengono elaborati da vie afferenti nocicettive disparate. Dal HCl inibisce lo svuotamento gastrico, mentre la capsaicina non lo fa, si deduce che l'ingresso afferenti HCl-evocata al NTS è trasmesso da afferenze vagali nello stomaco, mentre l'attivazione di NTS e lamina vertebrale I neuroni di capsaicina è mediata sia dai vagale afferenti nello stomaco e afferenze spinali nel piccolo intestino superiore. Ulteriore sperimentazione è necessaria per determinare in che modo questi risultati si riferiscono a chemonociception gastrica. In accordo con i nostri dati c-fos, nocicezione indotta da eccesso di HCl gastrico è mediata dai neuroni afferenti vagali [4], e attende di essere esaminata, che vie afferenti relè nocicezione evocato da capsaicina gastrica. Mechanonociception evocata dalla distensione dello stomaco è originato dallo afferenze spinali [4], anche se espressione di c-fos è visto sia nel midollo spinale e, in misura maggiore, nel tronco cerebrale [47].
Metodi
Animali
lo studio è stato approvato da un comitato etico presso il Ministero federale dell'Istruzione, della Scienza e della Cultura della Repubblica d'Austria e condotta secondo la direttiva del Consiglio Comunità europee del 24 novembre 1986 (86/609 /CEE) . Gli esperimenti sono stati progettati in modo tale che il numero di animali utilizzati e la loro sofferenza stato minimizzato. Female ratti Sprague-Dawley di pari età (Abteilung für Labortierkunde und -genetik, Medical University di Vienna, Himberg, Austria) del peso di 180-220 g sono stati utilizzati. Essi sono stati alloggiati in gruppi di quattro in gabbie trasparenti di plastica in condizioni standard; luci erano accese dalle 6:00 alle 06:00. protocolli sperimentali

Tutti gli esperimenti hanno avuto luogo durante la fase di luce 8:00-12:00. Ventiquattro ore prima l'inizio di esperimenti i ratti sono stati privati ​​di cibo per garantire che lo stomaco era vuoto al tempo degli esperimenti, mentre l'acqua era disponibile ad libitum corso di questa fase preparatoria. Inoltre, i ratti sono stati collocati in gruppi di due su una griglia pavimento per evitare coprofagia. Due studi con diversi protocolli sperimentali sono stati effettuati.
Studio 1 è stato condotto con animali non anestetizzati. salina fisiologica (0,15 M NaCl), HCl (0,5 M), capsaicina (0.64 e 3.2 mM) o il suo veicolo sono stati somministrati IG ad un volume di 10 ml /kg attraverso un infante morbido tubo di alimentazione (diametro esterno 2,2 millimetri; Portex, Hythe , UK). Dopo 45 min i ratti sono stati sacrificati mediante iniezione intraperitoneale di una overdose di pentobarbital (200 mg /kg; Intervet, Vienna, Austria) e il loro tronco cerebrale e del midollo spinale rapidamente rimosso. Capsaicina (Sigma, Vienna, Austria) è stato sciolto in un mezzo contenente 10% di Tween 80, 10% etanolo e 80% soluzione salina fisiologica per dare soluzioni madre di 2 e 10 mg /ml (6,4 e 32 mM) capsaicina. Queste soluzioni madri sono state poi diluiti con soluzione salina fisiologica per dare soluzioni di test di 0,64 e 3,2 mm capsaicina, rispettivamente. Il veicolo per la capsaicina composto da 1% Tween 80, 1% di etanolo e 98% soluzione salina fisiologica
Studio 2 è stata eseguita con animali che sono stati anestetizzati con fenobarbital (230 mg /kg per via intraperitoneale; Sigma). E collocato su un tavolo termostatato a mantenere la temperatura rettale a 37 gradi Celsius [20]. I ratti sono stati poi dotati di una cannula tracheale per facilitare la respirazione spontanea. Una cannula nella vena giugulare sinistra è stata utilizzata per l'infusione continua di soluzione fisiologica (1,5 ml /h) per evitare la disidratazione. Dopo una linea mediana laparotomia catetere IG (diametro esterno 2,2 mm) è stato inserito nel stomaco attraverso l'esofago e stomaco lavata [20]. Con la sua punta essendo posizionata nella regione corpus, il catetere è stato utilizzato per registrare la pressione intragastrica (IGP) tramite un trasduttore di pressione, nonché per iniettare il fluido in entrata e svuotarlo dallo stomaco [20]. Questo metodo di misura IGP è stato descritto e validato in uno studio precedente [20]. Dopo un periodo di equilibrazione di 30 min, a 2 ml bolo fluido stata iniettata lentamente nello stomaco per un periodo di 5 s e lasciato nello stomaco per un periodo di 30 min, dopo di che lo stomaco è stato drenato e il peso del fluido recuperato determinata . Il recupero del liquido dallo stomaco (una misura indiretta di svuotamento gastrico) è stata espressa come percentuale del peso del fluido somministrato nello stomaco [20]. Ogni ratto è stato sottoposto a prove di iniezione 4 /recupero a intervalli di 15 minuti durante i quali lo stomaco è stato lasciato vuoto. Innanzitutto, due studi priming con soluzione salina sono state effettuate, seguiti mediante un test di prova con soluzione salina e una prova test con HCl (0,35 M) o da un test di prova con veicolo ed un test di prova con capsaicina (3,2 mM). IGP è stato in media per i periodi di 2-3 minuti, 9-10 min e 29-30 min dopo l'iniezione. Da quanto descritto in precedenza [20] il sorgere picco IGP post-iniezione varia a causa delle differenze di velocità di iniezione, l'IGP in media durante il periodo di 2-3 minuti dopo l'iniezione è stato preso come 100% e l'IGP registrata durante la successiva osservazione periodi espressi come percentuale di tale valore di riferimento.
ibridazione in situ autoradiografia
Il tronco cerebrale e il midollo spinale sono stati rapidamente rimossi e congelati in ghiaccio secco in polvere. Sezioni coronali (0,01 mm) sono stati tagliati in serie dal tronco alla estensione del rostrocaudale postrema e caudale midollo spinale toracico con un criostato [5, 6, 22]. Ogni sesta sezione è stato elaborato per l'ibridazione in situ con una sonda oligodeoxyribonucleotide marcato a 'fine con [35S ] deossiadenosina 5' 3 (α-tio) trifosfato, come descritto in precedenza [6]. Le sezioni sono state immerse in Ilford K5 emulsione fotografica e, dopo 18-25 giorni di esposizione in scatole sigillate a 4 gradi Celsius, si sono sviluppati i autoradiogrammi e le sezioni di contrasto con ematossilina e coprioggetto [6]. La specificità del procedimento è stata dimostrata dall'assenza di qualsiasi segnale di ibridazione quando sezioni di controllo sono stati ibridati con una miscela di sonda marcata con un eccesso di 100 volte di sonda non marcata ( 'fredda').
I autoradiogrammi sono stati esaminati in un Coded modo con un microscopio ottico (Axiophot, Zeiss, Oberkochen, Germania) accoppiato ad un sistema di analisi di immagine computerizzata (Imaging, St. Catharines, Ontario, Canada). Le cellule sono state considerate c-fos mRNA-positivo quando la loro densità grano era almeno 10 volte superiore al fondo [6]. Al fine di migliorare l'affidabilità dei risultati quantitativi, sono stati valutati 5 sezioni tronco cerebrale e 7-10 sezioni midollo spinale da ogni animale. Queste sezioni sono state scelte in modo che erano 0,05 mm l'uno dall'altro in modo da evitare che le stesse cellule sono state contate due volte. Le cellule mRNA-positive c-fos per girone stati contati unilateralmente nel NTS a livello di postrema e nella parte dorsale del midollo spinale a livello toracico caudale (T8-T12). Queste strutture sono state individuate in base al Molander e Grant [48] e Paxinos e Watson [49]. Nella metà dorsale del midollo spinale, la distribuzione delle cellule mRNA-positive c-fos a lamine IV (LI-LV), zona X (AX) attorno al canale centrale e il nucleo intermediolaterale (IMLN) è stata valutata secondo il ratto citoarchitettura spinale descritto da Molander et al.

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