PLoS ONE: Analisi di stomaco e dell'intestino microbiomes della Oyster orientale (Crassostrea virginica) da Coastal Louisiana, USA

Estratto

Abbiamo usato un throughput elevato pirosequenziamento per caratterizzare stomaco e intestino contenuti microbiomes di Crassostrea virginica
, l'ostrica di Pasqua, ottenuto da due siti, uno in Barataria Bay (Bagolaro Bay) e l'altro a Terrebonne Bay (lago di Caillou), Louisiana, Stati Uniti d'America. microbiomes stomaco ostriche di Bagolaro Bay sono stati prevalentemente dominate da Mollicutes più strettamente connesse con Mycoplasma
; una più ricca comunità dominata da Planctomyctes si è verificato nel Lago Caillou stomaci di ostriche. comunità Gut per le ostriche da entrambi i siti differivano dalle comunità di stomaco, e nutrivano un assemblaggio relativamente eterogeneo di filotipi. Filotipi più strettamente correlate a Shewanella
e un ceppo Chloroflexi dominato la flora intestinale Lago Caillou e Hackberry Bay, rispettivamente. Mentre molti membri dello stomaco e dell'intestino microbiomes sembravano essere transitori o opportunisti, un microbiome nucleo putativo è stato identificato sulla base di filotipi che si sono verificati solo in tutti i campioni di stomaco o nell'intestino. Il putativo microbiome nucleo stomaco comprende 5 OTU in 3 phyla, mentre il nucleo putativo intestino microbiome conteneva 44 OTU in 12 phyla. Questi risultati hanno rivelato collettivamente comunità microbiche innovative all'interno del sistema digestivo di ostriche, le funzioni del microbiome ostriche sono in gran parte sconosciuti. Un confronto di microbiomes da ostriche della Louisiana con le comunità batteriche riportati per altri invertebrati marini e pesci ha indicato che microbiomes molluschi erano più simili tra loro rispetto a microbiomes di policheti, decapodi e pesci

Visto:. Re GM, Judd C , Kuske CR, Smith C (2012) Analisi di stomaco e dell'intestino microbiomes della Oyster orientale ( Crassostrea virginica
) da Coastal Louisiana, Stati Uniti d'America. PLoS ONE 7 (12): e51475. doi: 10.1371 /journal.pone.0051475

Editor: Josh Neufeld, University of Waterloo, Canada |

Ricevuto: 8 giugno 2012; Accettato: 5 novembre 2012; Pubblicato: 12 dicembre 2012

Questo è un articolo ad accesso aperto, privo di tutti i copyright, e può essere liberamente riprodotto, distribuito, trasmesso, modificato, costruito su, o in altro modo utilizzato da chiunque per qualsiasi scopo legale. Il lavoro è reso disponibile sotto il dominio pubblico dedizione Creative Commons CC0

Finanziamento:. Gli autori riconoscono premio NSF OCE-1.043.126 e Gomri-LSU fondi per GK per il supporto di GK, CS e CJ. Il sequenziamento 454 Titanium è stato fornito da una Los Alamos National Laboratory laboratorio diretto di Ricerca e Sviluppo Grant (LDRD) a CRK (20080464ER). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

L'ostrica orientale, Crassostrea virginica
, è ben noto per il suo valore commerciale e l'importanza come "ingegnere ecosistema" [1] - [3]. I volumi sono stati scritti sulla sua biologia ed ecologia, tra cui le interazioni con i batteri e altri microbi. malattie Gran parte di questa letteratura ha sottolineato [4], [5] e la presenza di agenti patogeni umani, in particolare Vibrio
e V
. vulnificus
[6] - [9].

Molti studi hanno affrontato altri aspetti di ostriche batteri interazioni. Cristispira
è stato identificato come un simbionte associato con lo stile cristallino, una struttura digestivo molluschi [10]. Stappia
(ora Labrenzia
) è stato isolato da C
. gigas
e C
. virginica
, e in quest'ultimo implicato come antagonista per l'agente eziologico della Juvenile Oyster malattia [11]. Studi Cultura-dipendenti hanno caratterizzato Vibrio
e altri generi associati con gli animali alla rinfusa e tessuti specifici [6] - [8], [12], [13] compresa l'identificazione dei batteri "indigeni" in C . gigas
emolinfa [14], [15]. Tali studi hanno anche dimostrato che un Orientale fuoriuscita di petrolio del Mediterraneo non ha influenzato i batteri ostriche-associati [16]. studi culturali indipendenti hanno documentato i modelli di diversità tra le diverse popolazioni e tessuti, rispetto gli animali incubazione-raise e selvaggi, e ha individuato la ε-Proteobacterium, Arcobacter
, come un importante contributo alla comunità microbica del ostrica cilena , Tiostrea chiliensis
[17].

Nonostante gli studi associati ai patogeni e impronte digitali sintetizzati sopra, e la potenziale importanza dei batteri per l'acquisizione di ostriche nutrienti, esiste sorprendentemente poche informazioni su di ostriche stomaco e dell'intestino diversità microbiome. Anche se i valori di pH dei tessuti dello stomaco e dell'intestino sono simili, e tempi di transito delle particelle relativamente breve (circa 1-2 ore) durante l'alimentazione attiva [18], non è chiaro se le comunità caratteristici esistono in il contenuto di questi tessuti; è altrettanto chiaro come microbiomes possono variare all'interno di una popolazione o tra le popolazioni. Per rispondere a queste domande, abbiamo ottenuto due gruppi di animali triplice copia, un set ciascuno da Hackberry Bay e il Lago di Caillou in Louisiana costiera durante l'estate 2010. Questi due siti geograficamente distinti (rispettivamente Barataria Bay e Terrebonne Bay,) rappresentano economicamente importanti fonti di ostriche e un'esperienza simile regimi di salinità e la variabilità [19]. Abbiamo raccolto separatamente stomaco e dell'intestino contenuti, e sequenziato PCR-amplificate geni 16S rRNA utilizzando una piattaforma pyrosequencing (Roche Diagnostics 454 titanio). I risultati hanno rivelato sostanziale differenziazione tra stomaco e intestino microbiomes di animali da un sito (Lago di Caillou), ma un po 'meno la differenziazione per il secondo sito (Hackberry Bay). In particolare, Mollicutes rappresentato il > 80% di tutte le sequenze batteriche nei microbiomes dello stomaco di ostriche Lago Caillou, ma < il 10% delle ostriche Hackberry Bay. Stomaco OTU comprendeva anche Actinobacteria, Chloroflexi, Firmicutes, Planctomycetes, Proteobacteria, e Spartobacteria. Chloroflexi, Mollicutes, Planctomycetes e Spartobacteria potrebbero comprendere un nucleo putativo microbiome stomaco, mentre Chloroflexi, Firmicutes, α-Proteobacteria e Verrucomicrobia potrebbe contribuire ad un putativo microbiome nucleo intestino.

Materiali e Metodi

Esempio collezione

Le ostriche sono stati raccolti il ​​4 agosto 2010 dalle Hackberry Bay, una piccola baia adiacente Barataria Bay, Louisiana, stati Uniti d'America. Questo sito è stato influenzato dalla olio dalla fuoriuscita di petrolio Deepwater Horizon [20]. ostriche triplicato si sono tenute in ghiaccio (< 6 ore) per l'elaborazione iniziale al Louisiana mare di Grant Oyster incubazione, Grand Isle, LA, Stati Uniti d'America. Le valvole esterni sono stati accuratamente puliti per eliminare la contaminazione superficiale, e poi accuratamente aperto lasciando intatta l'animale. contenuto dello stomaco dei singoli animali sono stati campionati utilizzando aghi 23 calibro e 1 cm ^{3 siringhe, ottenendo circa 0,2 cm 3 di liquido, che è stato trasferito a sterili 1,5 cm 3 tubi microcentrifuga. Gut contenuti sono stati ottenuti posizionando l'intestino dei singoli animali e poi accuratamente estrusione materiale hindgut dall'ano in sterili 1,5 cm 3 tubi microcentrifuga. Stomaco e intestino contenuti sono stati trasportati in ghiaccio ad un laboratorio alla Louisiana State University (LSU) in cui DNA è stato estratto utilizzando un kit di estrazione terreno Mobio PowerMax (Mobio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA) seguendo le istruzioni del produttore con l'aggiunta di un congelamento (a -80 ° C, 10 min) /disgelo (a 60 ° C, 5 min) ciclo ripetuto tre volte. Una seconda serie di ostriche raccolte il 1 ° settembre 2010 dalle Caillou Bay (Caillou Lago), Louisiana, Stati Uniti d'America sono stati trattati allo stesso modo, con l'eccezione che gli animali sono stati trasportati in ghiaccio al laboratorio LSU prima del campionamento stomaco e dell'intestino contenuti. Questo sito è stato anche influenzato dalla fuoriuscita di petrolio Deepwater Horizon. permessi di campionamento non sono stati richiesti per entrambi sito.}

DNA Analisi

estratti di DNA da tutti i campioni sono stati amplificati da PCR con Platinum ad alta fedeltà DNA polimerasi (Life Technologies Corp, La Jolla, CA) in 25 reazioni microlitri utilizzando protocolli standard con l'eccezione di una temperatura di estensione 68 ° C, e primer 515f e 806R modificate con codici a barre e gli adattatori per il sequenziamento che utilizzano la piattaforma pyrosequencing Roche 454 con il titanio chimica [21]. Ogni miscela di reazione conteneva 11.5 acqua ml, 2,5 ml 10X ad alta fedeltà del buffer (Life Technologies Corp, La Jolla, CA), 0,75 ml di 100 mM dNTP, 1 ml MgSO _{4, 5 ml di 0,5 mg ml ^{-1 BSA, 1,5 ml per ciascuna delle 515f e 806R primer, 0,2 microlitri alta fedeltà DNA polimerasi (Life Technologies Corp, La Jolla, CA) e 1 ml di DNA estratto. miscele di reazione sono stati denaturati per 3 minuti a 94 ° C, seguita da 26 cicli di 94 ° C per 1 min, 1 min a 54 ° C e 2 min a 68 ° C, con una fase di estensione 10 min a 68 ° C dopo i cicli erano completi. Reazioni triplicato per ogni campione sono stati riuniti, e poi una miscela finale è stato preparato per la sequenza aggiungendo ampliconi da ciascun campione in masse uguali. Pyrosequencing è stato condotto dalla struttura di sequenziamento di Los Alamos National Laboratory, per un totale di 237.842 cruda legge con una lunghezza media di 295 bp. Le sequenze sono state presentate al server MG-RAST come 4501864.3-4501873.3 (http://metagenomics.anl.gov/linkin.cgi?project=1994).}}

Sequence Analysis

sequenze prime con punteggi di qualità sono stati elaborati utilizzando tre oleodotti. PANGEA [22] è stato utilizzato per confrontare la composizione filogenetica di campioni per i quali OTU sono stati classificati utilizzando Megablast con un database di riferimento contenente 170,273 full-length 16S rRNA sequenze di geni da batteri e Archaea gli isolati. Raw si legge sono stati proiettati utilizzando i valori predefiniti (punteggio di qualità media, 20; lunghezza minima, 100 bp) [22]. Legge erano raggruppate in base a codici a barre, che sono stati tagliati prima Megablast. Le sequenze sono stati assegnati a dominio /phylum, classe /ordine /famiglia e livelli di generi e delle specie, rispettivamente con valori di soglia somiglianza di 0,8, 0,9, 0,95 e 0,99 per [22]. Sequenze non classificati per Megablast sono stati raggruppati in OTU sulla base delle stesse soglie di similarità. PANGEA anche creato una seconda analisi in cui tutti i campioni consistevano di un ugual numero di letture; questi set di dati di esempio normalizzati sono stati costruiti utilizzando sequenze scelte a caso, senza la sostituzione dei file di esempio schermati originali. Le composizioni di campioni stomaco e intestino sono stati confrontati con analisi delle componenti principali, dopo l'eliminazione single (sequenze rappresentate solo una volta nel pieno set di dati), e dopo la rimozione dei cianobatteri e sequenze eucarioti (cloroplasti e 16S rRNA mitocondriale dalle cellule algali in stomaco e viscere). Dei restanti sequenze identificate a livello phylum o inferiore, sequenze rappresentative per OTU pari al ≥0.1% del totale sono stati curato manualmente utilizzando Megablast in GenBank. Eventuali sequenze erroneamente identificati da Pangea sono stati riclassificati come necessario

Il gasdotto CloVR [23] è stato utilizzato con le impostazioni predefinite (ad esempio, il punteggio di qualità media, 25; lunghezza minima, 100 bp). Di creare analisi sulla base di appartenenze tassonomiche (vale a dire, la composizione del campione) e la sequenza filogenesi. A questo scopo, CloVR utilizzata una pipeline ibrido costituito da Mothur sub-routine che classificati sequenze con il database RDP e QIIME sub-routine per varie analisi statistiche. Dopo la rimozione di cianobatteri e eucarioti sequenze, OTU classificati per CloVR che rappresentava il ≥0.1% del restante letture sono state sottoposte a curatela manuale come sopra totale. Allineato sequenze rappresentativi per classificate, a cura OTU sono stati poi utilizzati per un'analisi veloce UniFrac (http://bmf2.colorado.edu/fastunifrac/) sulla base di un albero vicino di casa, che unisce come input.

Il gasdotto Mothur [ ,,,0],24] è stato utilizzato con valori più rigorosi rispetto alle altre piattaforme per sequenza di taglio (ad esempio, una finestra mobile di 50 bp, con un punteggio di qualità di 35; lunghezza minima, 100 bp). La funzione di "classificare" del gasdotto Mothur è stato utilizzato per identificare la composizione del campione per rappresentare OTU ≥0.1% del database dopo la rimozione dei cianobatteri e sequenze eucariotiche. Le sequenze rimanenti sono stati curati come sopra. Queste sequenze cura più i minori Otus esclusi single sono stati usati per creare indici di diversità per i campioni indipendenti di identificazioni tassonomiche (ad esempio, Shannon, invertire Simpson e gli indici uniformità).

Risultati

Il pre routine di elaborazione dei tre tubazioni impiegate in questo studio hanno determinato marcatamente differenti numeri di sequenza per l'analisi (Tabella S1). PANGEA ha dato il numero più grande di leggere (199.592), e Mothur ha prodotto il minimo (45.626). Le sequenze più strettamente legati alla cianobatteri ed eucarioti (cloroplasti e 16S rRNA mitocondriale geni) ha dominato i set di dati tagliate (> 70%), indipendentemente dalle loro dimensioni (Tabella S1). Queste sequenze sono stati eliminati da ulteriori analisi. sequenze Singleton, dalla 0.5% (CloVR) al 5,9% (PANGEA) dei set di dati dopo pre-trattamento; queste sequenze sono state eliminate anche per ridurre al minimo l'impatto di errori di sequenziamento. sequenze chimerici non sono stati identificati in da Pangea, ma sembravano costituire solo una piccola frazione (< 0,2%). della sequenza totale set (Tabella S1) sulla base dei risultati di CloVR e Mothur

Diversi modelli apparsi costantemente . L'abbondanza relativa di OTU come percentuale del numero di sequenze analizzate mostrato che Lake Caillou ostriche stomaco e dell'intestino microbiome composizioni differivano sostanzialmente (Fig 1a;. Tabelle 1, 2). Un piccolo numero di mollicutes OTU dominato il primo, mentre Chloroflexi (per lo più Caldilineae), Firmicutes, γ-Proteobacteria e Verrucomicrobia (Spartobacteria) ha dominato il seguito. Tutte e tre le condotte anche rivelato differenze tra Hackberry Bay ostriche stomaco e dell'intestino microbiomes (Fig 1a;. Tabelle 1, 2), ma le differenze sono meno pronunciati rispetto a quelli per le ostriche Lake Caillou. Le differenze tra lo stomaco e l'intestino microbiomes Bagolaro Bay provocato principalmente da modeste variazioni in più linee (ad esempio, Chloroflexi, Firmicutes, α-proteobatteri, δ-Proteobacteria, Planctomycetes e Spartobacteria). Inoltre, ciascuna delle condotte hanno rivelato differenze fra i microbiomes delle due popolazioni di Hackberry Bay e il Lago di Caillou. Le differenze più notevoli si sono verificati tra le due serie di microbiomes stomaco, con un po 'meno la differenziazione tra i microbiomes intestinale (Fig. 1 bis, tabelle 1, 2).

Nonostante le molte somiglianze, PANGEA, CloVR e Mothur uscita differivano in aspetti importanti. Rispetto al CloVR e Mothur, PANGEA identificato meno Proteobacteria, Mollicutes e Verrucomicrobia a Hackberry Bay microbiomes ostriche allo stomaco, e meno Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, e Verrucomicrobia in microbiomes intestinale. PANGEA anche costantemente registrato una percentuale maggiore di sequenze "non classificati" che ha fatto CloVR o Mothur; PANGEA non ha identificato il 60% dei Hackberry Bay sequenze di ostriche di stomaco al di là del livello di dominio (Tabelle 1, 2).

Le differenze sono state osservate anche in le affiliazioni tassonomiche del più abbondante OTU (Tabella 3). PANGEA, CloVR e Mothur tutti segnalati Planctomycetes come uno dei due altrettanto più abbondanti OTU a Hackberry Bay microbiomes ostrica allo stomaco, ma le affiliazioni specifiche all'interno del Planctomycetes differivano. Le affiliazioni del secondo OTU anche differivano, tra cui un firmicutes (PANGEA), Spartobacteria (CloVR) e mollicutes (Mothur). Inoltre, PANGEA ha riportato una sequenza relativa a Mycoplasma
cellulare come il OTU più abbondante per Hackberry Bay ostriche microbiomes intestinale, mentre le altre condotte hanno riportato un ceppo Chloroflexi (Tabella 3). Al contrario, le tre condotte hanno mostrato molto più vicino accordo per i campioni Lago Caillou: tutto ha trovato che un OTU strettamente legato al M
.
cellulare era più abbondante in microbiomes stomaco, e un OTU strettamente legato ad un Shewanella
sp. era più abbondante in microbiomes intestinale. I due Shewanella
isolati riferito, MOLA 59 (PANGEA) e THt8-1 (CloVR e Mothur), erano identici negli posizioni nucleotidiche analizzati. Tuttavia, Shewanella
sp. THt8-1 e Shewanella
sp. MOLA 59 sono stati isolati da fonti vegetali e marini terrestri, rispettivamente.

L'analisi della composizione (phyla e classi) del 284 classificati OTU (fig. 1b) ha rivelato i modelli che divergevano leggermente da quelli a base di relativa abbondanza di phyla e classi tra tutte le sequenze (Fig. 1a). In primo luogo, le differenze tra stomaco e intestino microbiomes all'interno di un sito e tra i siti in base alla composizione OTU erano meno pronunciati rispetto a quelli basati sulle frequenze di occorrenza (Fig. 1 bis contro 1b). Questo è stato evidente per i grandi (ad esempio, Chloroflexi, Firmicutes, γ-Proteobacteria, δ-Proteobacteria e Planctomyces) e minori (ad esempio, Archaea, β-Proteobacteria, e Spartobacteria) collaboratori di composizione OTU (fig. 1b). In secondo luogo, il contributo percentuale di alcuni phyla e classi per l'classificato OTU è stato sovrarappresentato notevolmente rispetto al loro abbondanza nel set di dati di sequenza, mentre altri phyla e classi sono state sostanzialmente sottorappresentati (Fig. 1a, b). Mollicutes sono stati notevolmente sovrarappresentati in Hackberry Bay e microbiomes stomaco Lago Caillou, ma sottorappresentate in microbiomes intestinale. Chloroflexi e Planctomyces sono stati sovrarappresentati nel lago di Caillou ostriche intestino e Bagolaro Bay ostriche stomaco e dell'intestino microbiomes, mentre α- e β-Proteobacteria erano sottorappresentate in tutti microbiomes (Fig. 1a, b).

Un modello analogo è stato osservato quando la composizione filogenetica di tutto OTU che si sono verificati nel pool Hackberry Bay e il Lago di Caillou microbiomes stomaco è stato confrontato con la composizione di OTU che si sono verificati o sono stati condivisi (SHR-S) in entrambi i siti. In particolare, Chloroflexi, Mollicutes, Planctomyces e Spartobacteria erano sovrarappresentate tra i SHR-S OTU (Fig. 2). Allo stesso modo, un confronto tra OTU che si verificano in pool Hackberry Bay e il Lago di Caillou microbiomes intestino con l'intestino condiviso OTU (SHR-G) ha mostrato che Chloroflexi, Firmicutes, α-Proteobacteria, Planctomyces e Verrucomicrobia sono stati sovrarappresentati (Fig. 2). Il numero di SHR-S OTU (44) era molto più piccola rispetto al numero di SHR-G OTU (112), l'ultima delle quali ha rappresentato quasi il 40% di tutte le OTU classificate, e uno ancora più grande percentuale di quelle che si trovano nell'intestino microbiomes (Tabella 4).

OTU che si è verificato in modo univoco in stomaco o nell'intestino microbiomes sia Hackberry Bay e le popolazioni di ostriche Lago Caillou (SHRU-S, SHRU-G) ha rappresentato un altro sottogruppo distinto. Il microbiome SHRU-S è stata rappresentata da solo 5 dei 44 SHR-S OTU in soli 3 phyla /classi, e rappresentavano solo il 2,1% del totale 284 OTU identificato nello stomaco collettiva e microbiomes intestinali (Tabella 4). Al contrario, il microbiome SHRU-G è rappresentato dal 44 del 112 SHR-G OTU 12 phyla /classi, e rappresentano il 15,5% di tutti identificati OTU (Tabella 4). La composizione di SHR-S e SHRU-S microbiome OTU differiva notevolmente, mentre le differenze tra i microbiomes SHR-G e G-SHRU erano confinati a meno phyla e classi (Fig. 2).

Oltre alla variabilità tra lo stomaco e l'intestino composizione filogenetica, i microbiomes variavano tra le ostriche replicare da ogni sito. Per alcuni phyla e classi, abbondanze relative erano simili tra le repliche, e la variabilità (espressa come l'errore standard della media) era simile per ciascuno dei tre gasdotti (vedi ad esempio Mollicutes e α-Proteobacteria in stomaco e intestino microbiomes, rispettivamente; Tabella 1, 2). Tuttavia, in molti casi repliche variava notevolmente, e il grado di variabilità differiva tra tubazioni. Mollicutes nell'intestino microbiome Hackberry Bay, per esempio, sono stati osservati solo in 1 di 3 repliche di CloVR e Mothur, ed erano sproporzionatamente abbondante in una replica in base al PANGEA (Tabella 2)
.

La variabilità tra le repliche è stato catturato mediante analisi di cluster (Fig. 3) e l'analisi dei componenti principali (PCA) dei risultati CloVR utilizzando distanze UniFrac (Fig. 4a, b), e anche dalla PCA delle abbondanze relative classificate OTU (Fig. S1). I risultati di un cluster analysis utilizzando la metrica ponderata UniFrac hanno dimostrato che lo stomaco lago Caillou replica e Bagolaro Bay intestino replicati ciascuno cluster distinti formati, e che i singoli replicati erano relativamente vicini in lontananza. I campioni rimanenti stomaco e dell'intestino erano molto meno coerente, con repliche risolti a distanze maggiori. Non ponderata UniFrac PCA ha dimostrato che il lago di Caillou microbiomes intestinale raggruppati insieme sull'asse uno e due, ma che si replica per gli altri microbiomes erano molto più dispersa, anche se le distinzioni tra i siti e tra intestino e lo stomaco è rimasto evidente (Fig. 4a). Ponderata UniFrac PCA, che ha considerato le abbondanze relative di OTU, ha dimostrato che il lago Caillou stomaco e intestino Bagolaro Bay replicati ciascuno formato cluster relativamente stretti su entrambi gli assi, mentre per le altre repliche microbiomes furono dispersi (Fig. 4b). I due microbiomes stomaco è rimasta ben separati su PCA asse 1, ma i microbiomes intestinale raggruppati insieme (Fig. 4b).

Discussione

Vi presentiamo qui le prime analisi dettagliate dei Crassostrea virginica
stomaco e intestino microbioma composizioni. La dimensione del campione (animali triplice copia per ciascuno dei due siti) e di singolo limite di estrapolazione tempo di campionamento dei risultati, ma forniscono una serie di nuove intuizioni. Precedenti studi hanno sottolineato i membri coltivabili della comunità intestino, animali interi, agenti patogeni (umane e ostriche), o gruppi specifici che possono contribuire alla digestione, per esempio, Cristispira
[5], [8] - [11] , [13], [25]. approcci senza coltivazione hanno rivelato Arcobacter
(ε-Proteobacteria) come un importante contributo alla comunità microbiche di intere ostriche cileni, Tiostrea chilensis
, ma non sono stati segnalati associazioni specifiche intero tessuto [17 ]. Hernadez-Zárate e Olmos-Soto [26] hanno usato FISH specifici per gruppo e PCR per identificare i batteri in C
. gigas
tessuti, ma non hanno sequenza ampliconi della PCR o una relazione abbondanze relative di specifici gruppi filogenetici. Recentemente, uno studio PCR e DGGE di C
. virginica
ha riportato differenze spaziali e stagionali di microbiomes animali interi per due popolazioni da Maine (Stati Uniti d'America), ma la composizione filogenetica non è stato valutato qualitativamente o quantitativamente [27], né sono variazioni tra i singoli animali stato descritto.

parziali sequenze di geni 16S rRNA derivati ​​da alta pyrosequencing rendimento come quello usato in questo studio rivelano differenze nella composizione di ostriche microbiome a diversi livelli, anche se alcuni dettagli della composizione variano con il gasdotto scelto per l'analisi della sequenza (ad esempio, le tabelle 1 , 2). Vedere informazioni di supporto S1 per ulteriore discussione di queste differenze, che non toccano i modelli di variazione tra stomaco e intestino microbiomes o variazioni tra i siti.

Nel complesso, i risultati mostrano differenze sostanziali tra stomaco e dell'intestino microbiomes, e tra le microbiomes stomaco di animali provenienti da Hackberry Bay e il lago di Caillou (ad esempio, figura 1a, b e 2;. tabelle 1, 2). Inoltre, le composizioni microbiome dei singoli animali ripetute variano (Fig. 3, 4). Le variazioni tra stomaco e intestino microbiomes probabilmente riflettono i dettagli del sistema digestivo, ma le differenze tra i siti e tra le repliche suggeriscono che la composizione microbiome potrebbe rispondere a fattori locali, e forse a differenze genetiche tra gli individui. variabilità Analoga è stata riportata per altri animali [28], [29].

Oyster Stomaco Microbiome

In base alla frequenza di occorrenza OTU, microbioma stomaco di ostriche della Louisiana può esistere in a almeno due stati. Mollicutes più strettamente connesse con Mycoplasma
schiacciante dominano le sequenze classificati (> 80%) di uno stato rappresentate da ostriche lago Caillou (Fig 1a;. Tabelle 1, 3). Nessun altra classe contribuisce più di circa 2%. Planctomycetes dominano (23% -33%) il supplente dichiarazione che di ostriche Hackberry Bay (Fig 1a;. Tabelle 1, 3) - ma molti altri gruppi si verificano anche nello stomaco di questi ostriche a abbondanze modeste, ad esempio, Chloroflexi (8 %), Firmicutes (9% -11), Mollicutes (5% -9%), Proteobacteria (5% -12%), e Verrucomicrobia (3% -14%). Inoltre, due allo stesso modo abbondante OTU che appartengono a diversi phyla (Planctomyces e sia Firmicutes, Tenericutes o Verrucomicrobia) dominare Hackberry Bay stomaci ostriche a livello di specie (distanza evolutiva = 0.03; Tabella 3). La percentuale di classificati OTU rappresentato da vari phyla e delle classi è anche coerente con due stati distinti per microbioma stomaco (Fig. 2), anche se le differenze sono meno pronunciate per questa metrica che per le stime di frequenza a base di composizione. UniFrac PCA (ponderata e non ponderata) e cluster analysis fornire sostegno supplementare per il concetto di "due stati" (Fig. 3, 4).

Il significato fisiologico ed ecologico di questi microbiomes ostriche stomaco è incerta. Dominanza di Mollicutes o Planctomycetes è un po 'insolito rispetto ad altri microbiomes [28], [30] - [32], anche se Mollicutes appaiono abbondanti nella ghiandola digestiva delle ostriche Sydney roccia ( Saccostrea glomerata
) e nel nell'intestino del abalone, Haliotis discus hannai
[33], [34]. Mollicutes sono stati riportati anche nelle cellule dell'intestino calice di ostriche sulla base di prove microscopiche [25], e documentato per altri invertebrati e interiora di pesce dalla cultura-based e metodi molecolari ecologici [30], [35] - [42]. In caso contrario, relativamente poco si sa circa le loro associazioni con i sistemi digestivi invertebrati. In effetti, i ruoli ecologici di Mollicutes più in generale rimangono incerte, con alcune segnalazioni di patogenesi nei pesci e invertebrati selezionati [43] -. [46], ma altri rapporti che indicano una qualche forma di commensalism [30], [39]

Finora, la prova genomica offre pochi spunti, dal momento che il repertorio genetico di Mycoplasma
mobile, il taxon più strettamente legato alla ostrica OTU, è limitato nella sua portata [47]. M
. ZuluTrade Mobile congeneri a stomaco ostriche potrebbe semplicemente proliferare utilizzando substrato prodotta dal host o altri microbi durante la digestione; suggerimenti simili sono stati fatti per conto di associazioni mollicutes con i coralli d'acqua fredda [39]. Tuttavia, la possibilità che Mollicutes potrebbe contribuire in simbiosi per i loro ospiti non può essere respinta.

Il ruolo del Planctomyces nel sistema digestivo è anche incerta. Anche se sono ecologicamente importanti membri della batterioplancton marino, funzionalmente diversi e connessi con alghe, invertebrati e vertebrati [48], [49], di solito si verificano relativamente basse abbondanze in microbiomes intestinali (< circa il 5%) [30] - [32]. Tuttavia, i risultati di questo studio suggeriscono che le condizioni sconosciuti in favore Hackberry Bay ostriche stomaco Planctomycete proliferazione (Tabella 1).

Si è tentati di speculare qui, come altri hanno altrove [50], che Pirellula
-come membri del microbiome ostrica sfruttano polisaccaridi algali solfati di crescita, dal momento che numerosi geni putativamente codificanti per gli enzimi sulfohydrolase sono stati osservati in Rhodopirellula Baltica
genoma [51], e dal momento che i polisaccaridi solfati potrebbero essere comunemente ingerito da ostriche come conseguenza del consumo fitoplancton. La possibilità di utilizzare i polisaccaridi solfati sarebbe quindi fornire una spiegazione per Planctomycete abbondanza. Purtroppo, le relazioni filogenetiche tra R
. Baltica
e planctomycete OTU identificato in questo studio non sono sufficienti a sostegno di tali deduzioni. Tuttavia, tutti i Blastopirellula
, Pirellula
, e Rhodopirellula
isolati caratterizzato fino ad oggi utilizzare una vasta gamma di zuccheri semplici non-solfato [48], [49], [ ,,,0],52], almeno alcuni dei quali sono probabile che si verifichi nel tratto digerente di ostriche come biomassa algale viene idrolizzato.

Oyster Gut microbiome

il microbiome ostrica intestino ospita un più speciose o OTU-ricchi comunità di quanto non faccia la microbiome stomaco sulla base di specie osservate (S _{OB) e ACE e Chao1 stimatori diversità (Tabella 5). Questi indici indicano anche che lo stomaco e budella di ostriche Lago Caillou porto meno OTU di ostriche Hackberry Bay. Così, OTU ricchezza varia tra i tessuti di ostriche (ad esempio, stomaco e intestino), come è stato ben documentato per il microbioma umano [53], ma sembra anche variare tra le popolazioni. La fonte di variazioni di ricchezza tra le popolazioni di ostriche è sconosciuta.}

Le variazioni di ricchezza, nonostante, microbioma intestinale non è necessariamente più diversificata rispetto alla microbiome stomaco sulla base di Shannon e inversa indici di Simpson e lo stimatore uniformità, ognuno dei quali sono simili per l'intestino microbiome Lago Caillou e le due microbiomes Bagolaro Bay (Tabella 5). Questa somiglianza indica che in alcuni casi la struttura della diversità microbiome ostriche (ricchezza e planarità) è indipendente dal sistema digestivo e la composizione phylotype. Al contrario, tutti gli indici di diversità per la microbiome stomaco Lago Caillou sono sostanzialmente inferiori per stomaci Hackberry Bay, e inferiore a quella per entrambi microbiomes intestinali pure. Questo può essere attribuito al predominio nel lago di Caillou stomaci di ostriche di mollicutes OTU (ad esempio, la tabella 5 e Fig. 1 bis).

La composizione del microbiomes intestinali dalle ostriche della Louisiana è diversa da quella di altri molluschi e da quello di altri animali marini e non marini (Fig. 5). Gruenthal [54] ha dimostrato che Proteobacteria dominano (> 80%) le microbiomes budello della California nero ( Haliotis cracherodii
) e abalone bianco ( H
sorenseni
. ); Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomyces e Verrucomicrobia sembrano essere assenti da entrambi. Huang et al. [41] indicano che Mollicutes e δ-Proteobacteria dominano l'intestino del piccolo abalone. Cardoso et al. [55] Relazione che Bacteroidetes e Firmicutes dominano l'intestino della lumaca gasteropode, Achatina Fulica
. Firmicutes insieme a Bacteroidetes, Proteobacteria e Actinobacteria dominano il coraggio di altri invertebrati (ad esempio, le termiti-suolo di alimentazione [56] e scarafaggi [57]) e vertebrati (ad esempio, pesci marini erbivori [58]; carpa erbivora, [31], [ ,,,0],59] e primati [60]), mentre Mollicutes dominano il coraggio di alcuni pesci [30], [36]. Al contrario, conto Proteobacteria per solo circa il 20% della composizione dell'intestino delle ostriche in questo studio, Chloroflexi, Planctomyces e Verrucomicrobia sono ciascuno relativamente abbondante, e Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, e Mollicutes ogni contribuiscono circa il 10% o meno (Fig. 1a;. tabella 3)

Queste differenze nella composizione tra i sistemi intestinali derivano dagli effetti delle molteplici variabili che interagiscono, tra cui l'architettura intestinale, fisiologia digestiva, la dieta, e la misura in cui ospita e microbiomes si sono evoluti in simbiosi [61 ] - [63].

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