PLOS ONE: Análisis del estómago y el intestino microbioma de la ostra (Crassostrea virginica) de Costa de Louisiana, USA

Extracto

Se utilizó un alto rendimiento pirosecuenciación para caracterizar microbioma intestinal del estómago y de contenido de Crassostrea virginica
, la ostra Pascua, que se obtiene a partir de dos sitios, uno en la bahía de Barataria (almecina Bay) y el otro en Terrebonne Bay (Lago Caillou), Louisiana, EE.UU.. microbioma de estómago en las ostras de la bahía de Hackberry fueron abrumadoramente dominados por Mollicutes más estrechamente relacionados con Mycoplasma
; una comunidad más rica dominada por Planctomyctes se produjo en los estómagos de ostras Lago Caillou. comunidades de la tripa para las ostras de ambos sitios se diferenciaban de las comunidades de estómago, y albergaba un conjunto relativamente diverso de filotipos. Filotipos más estrechamente relacionados con Shewanella
y una cepa Chloroflexi dominado la microbiota intestinal Lago Caillou y Almecina Bay, respectivamente. Mientras que muchos miembros de las microbioma del estómago y del intestino parecen ser transitorios u oportunistas, se identificó un microbioma núcleo putativo basado en filotipos que se produjeron en sólo todas las muestras del estómago o del intestino. El microbioma núcleo estómago putativo compuesto 5 UOT en 3 filos, mientras que el microbioma intestinal putativo núcleo contenía 44 UOT en 12 filos. Estos resultados revelaron colectivamente comunidades microbianas novedosas dentro del sistema de ostra digestivo, las funciones de la microbioma ostras son en gran parte desconocidos. Una comparación de microbioma de ostras de Luisiana con las comunidades bacterianas reportados para otros invertebrados marinos y peces indicó que microbioma moluscos eran más similares entre sí que a microbioma de los poliquetos, crustáceos decápodos y peces

Visto:. Rey GM, Judd C , Kuske CR, Smith C (2012) Análisis de estómago y el intestino microbioma de la ostra del este ( Crassostrea virginica
) de Costa de Louisiana, EE.UU.. PLoS ONE 7 (12): e51475. doi: 10.1371 /journal.pone.0051475

Editor: Josh Neufeld, Universidad de Waterloo, Canada |

Recibido: 8 de Junio, 2012; Aceptado: 5 Noviembre 2012; Publicado: 12 Diciembre, 2012

Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0

Financiación:. Los autores reconocen premio NSF financiación OCE-1.043.126 y GoMRI-LSU a GK para el apoyo de GK, CS y CJ. La secuenciación 454 Titanio fue proporcionado por un laboratorio nacional de Los Alamos Laboratory Dirección de Investigación y Desarrollo Grant (LDRD) a CRK (20080464ER). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

La ostra, Crassostrea virginica
, es bien conocido por su valor comercial y su importancia como un "ingeniero de ecosistemas" [1] - [3]. Se ha escrito mucho sobre su biología y ecología de las interacciones con las bacterias y otros microbios. Gran parte de las enfermedades de esta literatura ha enfatizado [4], [5] y la presencia de patógenos humanos, especialmente Vibrio parahaemolyticus
y V
. vulnificus
[6] - [9].

Muchos estudios han abordado otros aspectos de la ostra-bacterias interacciones. cristispira
ha sido identificado como un simbionte asociada con el estilo cristalino, una estructura digestivo moluscos [10]. Stappia gratis (ahora Labrenzia
) ha sido aislado de C
. gigas
y C
. virginica
, y en este último implicado como un antagonista para el agente etiológico de la enfermedad de menores [11] Oyster. estudios de cultivos dependientes han caracterizado Vibrio
y otros géneros asociados con los animales a granel y tejidos específicos [6] - [8], [12], [13] incluyendo la identificación de las bacterias "indígenas" en C . gigas
hemolinfa [14], [15]. Dichos estudios también han demostrado que un derrame de petróleo del Mediterráneo Oriental no afectó a las bacterias de ostras de los asociados [16]. Estudios independientes de cultivos han documentado los patrones de diversidad entre las diferentes poblaciones y tejidos, en comparación con los animales de criaderos y salvajes, e identificó la ε-proteobacterium, Arcobacter
, como un importante contribuyente a la comunidad microbiana de la ostra chilena , Tiostrea chiliensis
[17].

a pesar de los estudios asociados a patógenos y la toma de huellas dactilares se acaban de resumir, y la importancia potencial de las bacterias para la adquisición de ostras de nutrientes, existe sorprendentemente poca información sobre el estómago y el intestino de ostras la diversidad microbioma. Aunque los valores de pH de los tejidos del estómago y del intestino son similares, y los tiempos de tránsito de partículas relativamente corto (aproximadamente 1-2 horas) durante la alimentación activa [18], no está claro si existen comunidades características de los contenidos de estos tejidos; es igualmente claro cómo microbioma pueden variar dentro de una población o entre poblaciones. Para abordar estas cuestiones, se obtuvieron dos grupos de animales por triplicado, un conjunto cada uno de Hackberry Bay y el lago de Caillou en la costa de Luisiana durante el verano de 2010. Estos dos sitios geográficamente distintos (Barataria Bay y Terrebonne Bay, respectivamente) representan las fuentes de importancia económica de las ostras , y la experiencia de los regímenes de salinidad y la variabilidad similares [19]. Hemos recogido por separado el contenido del estómago y del intestino, y secuenciado PCR-amplificación de 16S rRNA genes utilizando una plataforma de pirosecuenciación (Roche Diagnostics 454 de titanio). Los resultados revelaron una diferenciación sustancial entre microbioma del estómago y del intestino de los animales de un sitio (Lago Caillou), pero un poco menos de diferenciación para el segundo sitio (Almecina Bay). En particular, Mollicutes representó > 80% de todas las secuencias bacterianas en el microbioma del estómago de ostras Lago Caillou, pero < 10% de las ostras Almecina Bay. Estómago Otus también incluyó Actinobacteria, Chloroflexi, Firmicutes, Planctomycetes, proteobacterias y Spartobacteria. Chloroflexi, Mollicutes, Planctomycetes y Spartobacteria pueden comprender un microbioma estómago núcleo putativo, mientras Chloroflexi, Firmicutes, α-proteobacterias y Verrucomicrobia podría contribuir a un microbioma núcleo de tripa putativo.

Materiales y Métodos

Muestra colección

Las ostras se recogieron el 4 de agosto de 2010 de Hackberry Bay, una pequeña bahía cercana bahía de Barataria, Luisiana, EE.UU.. Este sitio no se vio afectada por el petróleo del derrame de petróleo de Deepwater Horizon [20]. ostras por triplicado se mantuvieron en hielo (< 6 h) para el procesamiento inicial en el Louisiana Sea Grant Oyster criadero, Grand Isle, LA, EE.UU.. Las válvulas externas se limpiaron a fondo para eliminar la contaminación de superficie, y luego, con cuidado abrieron dejando intacto el animal. El contenido del estómago de los animales individuales se muestrearon mediante agujas de 23 G y 1 cm ^{3 jeringas, produciendo aproximadamente 0,2 cm 3 de fluido, que se transfirió a estériles de 1,5 cm 3 tubos de microcentrífuga. contenido intestinal se obtuvieron mediante la localización de los intestinos de los animales individuales y luego, con cuidado la extrusión de material de intestino posterior del ano en recipientes estériles de 1,5 cm 3 tubos de microcentrífuga. El contenido del estómago y del intestino se transportaron en hielo a un laboratorio de la Universidad del Estado de Louisiana (LSU), donde se extrajo el ADN utilizando un kit de extracción de suelo MoBio PowerMax (Mobio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante con la adición de una congelación (a -80 ° C, 10 min) /descongelación (a 60 ° C, 5 min) ciclo se repitió tres veces. Un segundo conjunto de ostras recogidas el 1 de septiembre de 2010 de Caillou Bay (Caillou Lago), Louisiana, EE.UU. fueron procesados ​​de manera similar con la excepción de que los animales se transportaron en hielo al laboratorio LSU antes de la toma de muestras contenido del estómago y del intestino. Este sitio también se vio afectada por el derrame de petróleo de Deepwater Horizon. permisos de muestreo no eran necesarios para cualquiera de los sitios.}

Análisis de ADN

extractos de ADN de todas las muestras fueron amplificadas por PCR con el platino de alta fidelidad de la ADN polimerasa (Life Technologies Corp, La Jolla, CA) en reacciones de 25 l utilizando protocolos estándar, con la excepción de un 68 ° C temperatura de extensión, y cebadores 515f y 806r modificados con códigos de barras y los adaptadores para la secuenciación utilizando la plataforma de pirosecuenciación Roche 454 con la química de titanio [21]. Cada mezcla de reacción contenía 11,5 l de agua, 2,5 l de 10X tampón de alta fidelidad (Life Technologies Corp, La Jolla, CA), 0,75 l de mM dNTPs 100, 1 l MgSO _{4, 5 l de 0,5 mg ml ^{-1 BSA, 1,5 l de cada uno de 515f y 806r cebadores, 0,2 l de alta fidelidad de ADN polimerasa (Life Technologies Corp, La Jolla, CA), y 1 l de ADN extraído. Las mezclas de reacción se desnaturalizaron durante 3 min a 94 ° C, seguido por 26 ciclos de 94 ° C durante 1 min, 1 min a 54 ° C, y 2 min a 68 ° C, con una etapa de extensión de 10 min a 68 ° C después de los ciclos eran completos. reacciones por triplicado para cada muestra se agruparon, y después una mezcla final se preparó para la secuenciación mediante la adición de amplicones de cada muestra en la igualdad de masas. Pirosecuenciación se llevó a cabo por la instalación de secuenciación Laboratorio Nacional de Los Álamos, lo que resulta en un total de 237.842 en bruto lee con una longitud media de 295 pb. Secuencias se han presentado al servidor MG-RAST como 4501864.3-4501873.3 (http://metagenomics.anl.gov/linkin.cgi?project=1994).}}

Análisis de la secuencia

secuencias en bruto con puntuaciones de calidad fueron procesados ​​mediante tres tuberías. PANGEA [22] se utilizó para comparar la composición filogenético de las muestras para las que UOT fueron clasificados de MEGABLAST con una base de datos de referencia que contiene 170,273 secuencias de genes de longitud completa 16S rRNA de bacterias y arqueas aislamientos. De bajo nivel Lee fueron seleccionados utilizando los valores por defecto (puntuación de calidad media, 20; longitud mínima, 100 pb) [22]. Lee fueron agrupadas en base a los códigos de barras, que fueron recortados antes de MEGABLAST. Las secuencias fueron asignados al dominio /filo, clase /objeto /familia y los niveles de géneros y especies, respectivamente, utilizando los valores de umbral de similitud de 0,8, 0,9, 0,95 y 0,99 para [22]. Las secuencias no clasificadas por MEGABLAST se agruparon en UOT basado en los mismos umbrales de similitud. PANGEA también creó un segundo análisis en el que todas las muestras consistieron en un número igual de lee; estos conjuntos de datos de muestras normalizadas se construyeron utilizando secuencias elegidas al azar y sin reemplazo de los archivos de muestra seleccionados originales. Las composiciones de las muestras del estómago y del intestino se compararon mediante análisis de componentes principales (después de eliminar únicos secuencias representadas sólo una vez en el conjunto de datos), y después de la eliminación de las cianobacterias y las secuencias de cloroplastos eucariotas (y 16S rRNA mitocondrial de las células de algas en el estómago y los intestinos). De las restantes secuencias identificadas a nivel filo o inferior, secuencias representativas de Otus representa el ≥0.1% del total fueron comisariada manualmente usando MEGABLAST en GenBank. fueron reclasificadas como sea necesario ningún secuencias mal identificados por PANGEA

La tubería CloVR [23] fue utilizado con sus ajustes por defecto (por ejemplo, la puntuación de calidad media, 25; longitud mínima, 100 pb). para crear análisis basados ​​en las afiliaciones taxonómicos (es decir, composición de la muestra) y la secuencia de la filogenia. Para este propósito, CloVR utiliza una tubería híbrido que consiste en Mothur sub-rutinas que clasifican las secuencias con la base de datos RDP, y QIIME sub-rutinas para varios análisis estadísticos. Después de la eliminación de secuencias de cianobacterias y eucariotas, Otus clasificado por CloVR que representó ≥0.1% del restante lecturas fueron sometidos a manual de curación que el anterior TOTAL. Alineado secuencias representativas de clasificado, comisariada UOT se usaron entonces para un análisis rápido UniFrac (http://bmf2.colorado.edu/fastunifrac/) sobre la base de un árbol vecino a participar como entrada.

La tubería Mothur [ ,,,0],24] fue utilizado con los valores más estrictos que los de otras plataformas para recortar secuencia (es decir, una ventana móvil de 50 pb con una puntuación media de calidad de 35; longitud mínima, 100 pb). Se utilizó la función de "clasificar" de la tubería Mothur para identificar la composición de la muestra para UOT que representa ≥0.1% de la base de datos después de eliminar cianobacterias y las secuencias eucariotas. Las secuencias restantes fueron curadas como anteriormente. Estas secuencias curada más los menores excluidos los únicos Otus se utilizaron para generar los índices de diversidad para las muestras independientes de identificación taxonómica (por ejemplo, Shannon, Simpson inverso de e índices de regularidad).

Resultados

El pre- rutinas de procesamiento de las tres tuberías empleadas en este estudio resultaron en muy diferentes números de secuencia para el análisis (Tabla S1). PANGEA produjo el número más grande leído (199.592), y Mothur produjo el menor (45.626). Secuencias más estrechamente relacionados con las cianobacterias y cloroplastos eucariotas (y mitocondrial 16S rRNA genes) dominaron los conjuntos de datos recortados (> 70%), independientemente de su tamaño (Tabla S1). Estas secuencias fueron eliminados de los análisis adicionales. simples secuencias representadas de 0,5% (CloVR) al 5,9% (PANGEA) de los conjuntos de datos después de tratamiento previo; estas secuencias también fueron eliminados para minimizar los impactos de la secuencia de error. secuencias quiméricas no se identificaron en por PANGEA, pero parecían constituir sólo una pequeña fracción (< 0,2%). de la secuencia total establecido (Tabla S1) basado en los resultados de CloVR y Mothur

Varios patrones aparecieron consistentemente . La abundancia relativa de UOT como un porcentaje del número de secuencias analizadas mostró que las composiciones de estómago de ostras y microbioma intestinal Lago Caillou diferían sustancialmente (Fig 1a;. Tablas 1, 2). Un pequeño número de mollicute UOT dominó los primeros, mientras que Chloroflexi (en su mayoría Caldilineae), Firmicutes, γ-Proteobacteria y Verrucomicrobia (Spartobacteria) dominó la tarde. Las tres tuberías también revelaron diferencias entre Almecina Bay estómago ostras y microbioma intestinal (Figura 1a;. Las tablas 1, 2), pero las diferencias fueron menos pronunciados que los de ostras Lago Caillou. Las diferencias entre el estómago y del intestino microbioma Almecina Bay se debió principalmente a cambios modestos en múltiples linajes (por ejemplo, Chloroflexi, Firmicutes, α-Proteobacteria, δ-Proteobacteria, Planctomycetes y Spartobacteria). Además, cada una de las tuberías reveló diferencias distintas entre los microbiomas de las dos poblaciones de Hackberry Bay y el lago Caillou. Las diferencias más notables se produjeron entre los dos conjuntos de microbioma del estómago, con algo menos de diferenciación entre el microbioma intestinal (Fig. 1a, los cuadros 1, 2).

A pesar de muchas similitudes, PANGEA, CloVR y salida Mothur difieren en aspectos importantes. En relación con CloVR y Mothur, PANGEA identificó menos proteobacterias, Mollicutes y Verrucomicrobia en microbioma de ostras estómago Almecina Bay, y menos Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, y Verrucomicrobia en microbioma intestinal. PANGEA también registró consistentemente un mayor porcentaje de secuencias "no clasificados", que hizo CloVR o Mothur; PANGEA no identificó el 60% de las secuencias de ostras estómago Almecina Bay más allá del nivel de dominio (Tablas 1, 2).

También se observaron diferencias en las afiliaciones de taxonomía de la UOT más abundante (Tabla 3). PANGEA, CloVR y Mothur toda informaron Planctomycetes como uno de dos microbioma de ostras estómago igualmente más abundantes en UOT Almecina Bay, pero las afiliaciones específicas dentro del Planctomycetes diferían. Las afiliaciones de la segunda OTU también diferían, incluyendo un Firmicute (PANGEA), Spartobacteria (CloVR) y mollicute (Mothur). Además, PANGEA reportó una secuencia relacionada con Mycoplasma móvil
OTU como el más abundante de microbioma intestinal Almecina Oyster Bay, mientras que las otras tuberías informó una cepa Chloroflexi (Tabla 3). Por el contrario, las tres tuberías mostraron mucho más cerca de un acuerdo para muestras Lago Caillou: toda encontró que un OTU estrechamente relacionado con M
. móvil
fue más abundante en el microbioma de estómago, y un OTU estrechamente relacionado con un Shewanella
sp. era más abundante en el microbioma intestinal. Los dos Shewanella
aislados informados, MOLA 59 (PANGEA) y THt8-1 (CloVR y Mothur), eran idénticos sobre las posiciones de nucleótidos analizadas. Sin embargo, Shewanella
sp. THt8-1 y Shewanella
sp. MOLA 59 se aislaron a partir de fuentes vegetales y marinos, terrestres, respectivamente.

Los análisis de la composición (phyla y clases) de la 284 clasificado UOT (Fig. 1b) reveló patrones que divergieron tanto de los basados ​​en la abundancia relativa de phyla y clases de entre todas las secuencias (Fig. 1a). En primer lugar, las diferencias entre microbioma del estómago y del intestino dentro de un sitio y en todos los sitios en base a la composición OTU fueron menos pronunciadas que las basadas en frecuencias de ocurrencia (Fig. 1a vs. 1b). Esto fue evidente para los principales (por ejemplo, Chloroflexi, Firmicutes, γ-Proteobacteria, δ-proteobacterias y Planctomyces) y menor (por ejemplo, arqueas, β-Proteobacteria, y Spartobacteria) contribuyentes a la composición OTU (Fig. 1b). En segundo lugar, el porcentaje de contribución de algunos filos y las clases a la UOT clasificado fue considerablemente sobre representado en relación con su abundancia en el conjunto de datos de secuencias, mientras que otros phyla y las clases están insuficientemente representadas de forma sustancial (Fig. 1a, b). Mollicutes estaban sobrerrepresentados en gran medida en Hackberry Bay y microbioma estómago Lago Caillou, pero insuficientemente representadas en microbioma intestinal. Chloroflexi y Planctomyces también fueron representadas en el lago Caillou intestino y el estómago de ostras de ostras y la tripa microbioma Almecina Bay, mientras α- y β-Proteobacteria están insuficientemente representadas en todos los microbioma (Fig. 1a, b).

Un patrón similar se observó cuando la composición filogenético de todos UOT que se produjo en microbioma estómago almecina Bay y el lago Caillou agrupados se comparó con la composición de la OTU que se produjo en o fueron compartidos (SHR-S) en ambos sitios. En particular, Chloroflexi, Mollicutes, Planctomyces y Spartobacteria estaban sobrerrepresentados entre el SHR-S Otus (Fig. 2). Del mismo modo, una comparación de UOT se producen en agrupados microbioma intestinal Almecina Bay y el lago Caillou con el intestino compartida Otus (SHR-G) mostró que Chloroflexi, Firmicutes, α-proteobacterias, Planctomyces y Verrucomicrobia estaban sobrerrepresentados (Fig. 2). El número de SHR-S Otus (44) fue mucho menor que el número de SHR-G Otus (112), el último de los cuales representaba casi el 40% de toda la UOT clasificado, y un porcentaje aún mayor de las que se encuentran en el intestino microbioma (Tabla 4).

UOT que se produjo de forma única en el estómago o el intestino microbioma de los dos almecina Bay y las poblaciones de ostras Lago Caillou (SHRU-S, SHRU-G) representa otro sub-grupo distinto. El microbioma SHRU-S estuvo representada en sólo 5 de los 44 SHR-S UOT en sólo el 3 phyla /clases, y representó sólo el 2,1% del total de 284 OTU identificado en el estómago colectiva y microbioma intestinal (Tabla 4). Por el contrario, el microbioma SHRU-G estuvieron representados por 44 de los 112 SHR-G UOT en 12 phyla /clases, y representó el 15,5% de UOT todos identificados (Tabla 4). La composición de SHR-S y S-SHRU microbioma UOT difería notablemente, mientras que las diferencias entre el microbioma SHR-G y G-SHRU se limitaron a menos filos y clases (Fig. 2).

Además de la variabilidad entre el estómago y el intestino composición filogenético, el microbioma variaron entre las ostras replicados de cada sitio. Para algunos phyla y clases, abundancias relativas fueron similares entre repeticiones, y la variabilidad (expresado como el error estándar de la media) fue similar para cada uno de los tres canales de proceso (véase, por ejemplo Mollicutes y α-Proteobacteria en microbiomas del estómago y del intestino, respectivamente; Tabla 1, 2). Sin embargo, en muchos casos repeticiones variar sustancialmente, y el grado de variabilidad difería entre tuberías. Mollicutes en el microbioma intestinal Almecina Bay, por ejemplo, se observaron en sólo 1 de 3 repeticiones por CloVR y Mothur, y eran desproporcionadamente abundante en una réplica de acuerdo con PANGEA (Tabla 2)
.

La variabilidad entre los distintos recipientes fue capturado mediante análisis de agrupamiento (Fig. 3) y el análisis de componentes principales (PCA) de los resultados CloVR utilizando UniFrac distancias (Fig. 4a, b), y también por PCA de las abundancias relativas de UOT clasificado (Fig. S1). Los resultados de un análisis de conglomerados utilizando la métrica UniFrac ponderada mostraron que el estómago Lago Caillou replica y Almecina Bay intestino se replica cada uno distintas agrupaciones formadas, y que las repeticiones individuales eran relativamente cerca en la distancia. Las muestras de estómago y de intestino restantes eran mucho menos coherente, con repeticiones resueltos a mayores distancias. No ponderado UniFrac PCA mostró que el Lago Caillou microbiomas intestinales agrupados juntos en el eje de uno y dos, pero que se replica para las otras microbiomas eran mucho más dispersa, a pesar de las diferencias entre sitios y entre intestino y el estómago siendo evidentes (Fig. 4a). Ponderada UniFrac ACC, que considera las abundancias relativas de UOT, mostró que el Lago Caillou estómago y el intestino Almecina Bay repeticiones cada uno formado grupos relativamente reducidos en ambos ejes, mientras que las otras réplicas para microbioma se dispersaron (Fig. 4b). Los dos permanecieron microbioma estómago bien separados en el eje PCA 1, pero el microbioma intestinal agrupados juntos (Fig. 4b).

Discusión

Presentamos aquí los primeros análisis detallados de Crassostrea virginica composiciones
estómago y microbioma intestinal. El tamaño de la muestra (por triplicado animales para cada uno de los dos sitios) y el tiempo de muestreo único límite de la extrapolación de los resultados, pero proporcionan una serie de nuevos puntos de vista. Estudios previos han hecho hincapié en los miembros de la comunidad cultivables intestino, animales enteros, patógenos (humanos y ostras), o grupos específicos que podrían contribuir a la digestión, por ejemplo, cristispira
[5], [8] - [11] , [13], [25]. enfoques libre de cultivo han revelado Arcobacter gratis (ε-Proteobacteria) como un importante contribuyente a las comunidades microbianas de ostras chilenas enteros, Tiostrea chilensis
, pero las asociaciones específicas de tejido entero no se han reportado [17 ]. Hernádez-Zárate y Olmos Soto [26] han utilizado PEZ grupo específico y PCR para identificar bacterias en C
. gigas
tejidos, pero no lo hicieron secuencia de amplicones de PCR o informan de las abundancias relativas de los grupos filogenéticos específicos. Recientemente, un estudio de PCR y DGGE de C
. virginica
ha reportado diferencias espaciales y temporales del microbioma animales completos para dos poblaciones de Maine (EE.UU.), pero la composición filogenético no ha sido evaluada cualitativa o cuantitativamente [27], ni tienen variaciones entre animales individuales sido descrito.

parciales secuencias de genes 16S rRNA derivados de pirosecuenciación de alto rendimiento tal como se utiliza en este estudio revelan diferencias en la composición de ostras microbioma a varios niveles, aunque algunos de los detalles de la composición puede variar con la tubería elegido para el análisis de secuencias (por ejemplo, las Tablas 1 , 2). Ver la información de apoyo S1 para un análisis adicional de estas diferencias, las cuales no afectan los patrones de variación entre el microbioma del estómago y del intestino o variaciones entre sitios.

En general, los resultados muestran diferencias sustanciales entre microbioma del estómago y del intestino, y entre el microbioma del estómago de los animales de Hackberry Bay y el lago Caillou (por ejemplo, la figura 1a, b y 2;. tablas 1, 2). Además, las composiciones microbioma de animales replicados individuales varían (Fig. 3, 4). Las variaciones entre microbiomas del estómago y del intestino probablemente reflejan detalles del sistema digestivo, pero las diferencias entre sitios y entre repeticiones sugieren que la composición del microbioma podría responder a factores locales, y tal vez a las diferencias genéticas entre individuos. la variabilidad análoga se ha informado de otros animales [28], [29].

Estómago Oyster microbioma

Sobre la base de la frecuencia de ocurrencia OTU, el microbioma estómago de ostras de Louisiana puede existir en al menos dos estados. Mollicutes más estrechamente relacionados con Mycoplasma
dominan abrumadoramente las secuencias de anuncios (> 80%) de un estado representados por las ostras Lago Caillou (figura 1a;. Tablas 1, 3). Ninguna otra clase contribuye más de aproximadamente 2%. Planctomycetes dominan (23% -33%) de la declaración de que se alternan de ostras Hackberry Bay (Fig 1a;. Tablas 1, 3) - pero varios otros grupos también se producen en los estómagos de estas ostras en abundancias modestas, por ejemplo, Chloroflexi (8 %), Firmicutes (9% -11), Mollicutes (5% -9%), Proteobacteria (5% -12%), y Verrucomicrobia (3% -14%). Además, dos de manera similar abundante UOT que pertenecen a diferentes phyla (Planctomyces y, o bien Firmicutes, Tenericutes o Verrucomicrobia) dominan los estómagos de ostras Almecina Bay en un nivel de especie (distancia evolutiva = 0,03; Tabla 3). La proporción de UOT clasificada explica por diversos phyla y clases también es consistente con dos estados distintos para el microbioma estómago (Fig. 2), aunque las diferencias son menos pronunciadas para esta métrica que para las estimaciones basadas en la frecuencia de la composición. UniFrac PCA (ponderado y no ponderado) y el análisis de cluster proporcionar apoyo adicional para el "dos estados" concepto (Fig. 3, 4).

El significado fisiológico y ecológico de estos microbioma de ostras estómago es incierto. Predominio de Mollicutes o Planctomycetes es algo inusual en relación con otros microbioma [28], [30] - [32], aunque Mollicutes aparecen abundantes en la glándula digestiva de la ostra de roca de Sydney ( Saccostrea glomerata
) y en el delgado de la oreja de mar, Haliotis discus hannai
[33], [34]. Mollicutes también se han reportado en las células caliciformes del intestino ostras basado en evidencia microscópica [25], y documentado para otros invertebrados y las tripas de pescado por la cultura basada en métodos moleculares y ecológicos [30], [35] - [42]. De lo contrario, se sabe relativamente poco acerca de sus asociaciones con los sistemas digestivos de invertebrados. De hecho, las funciones ecológicas de Mollicutes más en general siguen siendo inciertas, con algunos informes de la patogénesis de los peces e invertebrados seleccionados [43] -. [46], pero otros informes que indican algún tipo de comensalismo [30], [39]

hasta ahora, la evidencia genómica ofrece algunas perspectivas, ya que el repertorio genético de Mycoplasma móvil
, el taxón más estrechamente relacionados con la ostra UOT, es limitada en su alcance [47]. M
. móvil en congéneres en los estómagos de ostras podrían proliferar simplemente usando sustrato producido por el huésped u otros microbios durante la digestión; sugerencias similares se han hecho para dar cuenta de las asociaciones mollicute con los corales de agua fría [39]. No obstante, la posibilidad de que Mollicutes podría contribuir de manera simbiótica con sus anfitriones no se puede descartar.

El papel de Planctomyces en los sistemas digestivos también es incierto. A pesar de que son miembros de importancia ecológica del bacterioplancton marino, con diversidad funcional y asociados con las algas, invertebrados y vertebrados [48], [49], por lo general se producen en abundancia relativamente bajos en microbioma intestinal (< aproximadamente 5%) [30] - [32]. Sin embargo, los resultados de este estudio sugieren que las condiciones desconocidas en el favor Almecina Oyster Bay estómago planctomycetes proliferación (Tabla 1).

Es tentador especular aquí, al igual que otros tienen en otras partes [50], que Pirellula
-como miembros de la ostra microbioma explotan polisacáridos de algas sulfatados para el crecimiento, ya que numerosos genes supuestamente codifican enzimas sulfohydrolase se han observado en el Rhodopirellula baltica
genoma [51], y dado que los polisacáridos sulfatados podrían ser comúnmente ingerido por las ostras, como consecuencia del consumo de fitoplancton. La capacidad de utilizar polisacáridos sulfatados sería por lo tanto proporcionar una explicación para planctomycetes abundancia. Por desgracia, las relaciones filogenéticas entre los R
. Baltica Opiniones y planctomycetes UOT identificados en este estudio son suficientes para apoyar tales inferencias. No obstante, todos los Blastopirellula
, Pirellula
, y Rhodopirellula
aislamientos caracterizado hasta la fecha utilizan una amplia gama de azúcares simples no sulfatado [48], [49], [ ,,,0],52], al menos, algunas de las cuales es probable que se produzca en el tracto digestivo de ostras como se hidroliza la biomasa de algas.

Oyster Gut microbioma

el microbioma intestinal alberga una ostra más speciose o OTU-rica comunidad que lo hace el microbioma estómago basada en las especies observadas (S _{obs) y de la ECA y Chao1 estimadores de diversidad (Tabla 5). Estos índices indican también que el estómago y los intestinos de las ostras Lago Caillou albergan menos que UOT ostras Almecina Bay. De este modo, la riqueza OTU varía entre los tejidos de ostras (por ejemplo, el estómago y los intestinos) como ha sido bien documentado para el microbioma humano [53], sino que también parece variar entre poblaciones. La fuente de las variaciones en la riqueza entre las poblaciones de ostras es desconocido.}

Las variaciones en la riqueza no obstante, el microbioma intestinal no es necesariamente más diverso que el microbioma estómago basado en Shannon e inversa índices de Simpson y el estimador de uniformidad, cada uno de los cuales son similares para el microbioma intestinal Lago Caillou y los dos microbioma almecina Bay (Tabla 5). Esta similitud indica que en algunos casos la estructura de la diversidad microbioma ostra (riqueza y uniformidad) es independiente del sistema digestivo y de la composición filotipo. Por el contrario, todos los índices de diversidad para el microbioma estómago Lago Caillou son sustancialmente más bajos que para los estómagos Almecina Bay, y más bajo que para ambos microbioma intestinal también. Esto se puede atribuir a la dominancia en Lake Caillou estómagos de ostras de la mollicute UOT (por ejemplo, la Tabla 5 y la Fig. 1a).

La composición de microbiomas intestinales de las ostras de Louisiana difiere de la de otros moluscos y de la de otros animales marinos y no marinos (Fig. 5). Gruenthal [54] ha demostrado que dominan proteobacterias (> 80%), el microbioma intestinal de negro de California ( Haliotis cracherodii
) y abulón chino ( H
sorenseni
. ); Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomyces y Verrucomicrobia parecen estar ausentes de ambos. Huang et al. [41] indican que Mollicutes y δ-Proteobacteria dominan el intestino de la pequeña oreja de mar. Cardoso et al. [55] informan de que Bacteroidetes y Firmicutes dominan el intestino del caracol gasterópodo, Achatina fulica
. Firmicutes, junto con Bacteroidetes, Proteobacteria y Actinobacteria dominan las tripas de otros invertebrados (por ejemplo, las termitas del suelo de amamantar [56] y las cucarachas [57]) y vertebrados (por ejemplo, peces marinos herbívoros [58]; la hierba carpa, [31], [ ,,,0],59] y primates [60]), mientras que Mollicutes dominan las entrañas de algunos peces [30], [36]. Por el contrario, la cuenta Proteobacteria sólo alrededor del 20% de la composición intestino de las ostras en este estudio, Chloroflexi, Planctomyces y Verrucomicrobia son cada uno relativamente abundante, y Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, y Mollicutes cada contribuyen aproximadamente el 10% o menos (Fig. 1a;. Tabla 3)

Estas diferencias en la composición entre los sistemas de tripa surgen de los efectos de múltiples variables que interactúan, incluyendo la arquitectura intestino, fisiología digestiva, la dieta y el grado en que los anfitriones y microbiomas han evolucionado simbióticamente [61 ] - [63].

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