PLoS ONE: Analyysi Vatsa ja Gut Microbiomes Itä (Crassostrea virginica) Coastal Louisiana, USA

tiivistelmä

Käytimme suurikapasiteettisten pyrosekvensointi luonnehtia vatsan ja suoliston sisältöä microbiomes on Crassostrea virginica
, pääsiäisen osteri, saadut kaksi sivustoja, yksi Barataria Bay (Hackberry Bay) ja toinen Terrebonne Bay (järvi Caillou), Louisiana, USA. Vatsa microbiomes sisään osterit Hackberry Bay oli ylivoimaisesti hallitsevat Mollicutes läheisintä sukua Mycoplasma
; enemmän rikkaita yhteisöä hallitsevat Planctomyctes tapahtui järven Caillou osteri vatsat. Gut yhteisöjä osterit molemmat paikat erosi vatsaan yhteisöjä, ja kanna suhteellisen monipuolinen yhdistämisestä phylotypes. Phylotypes läheisintä sukua Shewanella
ja Chloroflexi kanta hallitsee järven Caillou ja Hackberry Bay suoliston mikrobiston, vastaavasti. Vaikka monet jäsenet vatsan ja suoliston microbiomes näytti olevan transientit tai opportunistien, otaksuttu ydin microbiome tunnistettiin perustuen phylotypes joka tapahtui kaikissa vatsassa tai suolistossa näytteitä vain. N oletettu ytimen mahassa microbiome käsitti 5 Otus 3 phyla, kun oletetun ytimen suolistossa microbiome sisältämän 44 Otus 12 phyla. Nämä tulokset yhdessä paljastivat novel mikrobiyhteisö sisällä osteri ruoansulatuskanavan, toiminnot osteri microbiome ovat suurelta osin tuntemattomia. Vertailu microbiomes Louisiana ostereita bakteeri yhteisöt raportoitu muille meren selkärangattomien ja kalojen osoitti, että nilviäisten microbiomes olivat samankaltaisia ​​toistensa kuin microbiomes of monisukasmadot, decapods ja kalaa.

Citation: kuningas GM, Judd C , Kuske CR, Smith C (2012) analyysi Vatsa ja Gut Microbiomes Itä Oyster ( Crassostrea virginica
) Coastal Louisiana, USA. PLoS ONE 7 (12): e51475. doi: 10,1371 /journal.pone.0051475

Editor: Josh Neufeld, University of Waterloo, Kanada

vastaanotettu: 8. kesäkuuta, 2012 Hyväksytty: 5. marraskuuta 2012 Julkaistu: 12 joulukuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tekijät myöntävät NSF palkinnon OCE-1043126 ja GoMRI-NY rahoitusta GK tukea GK, CS ja CJ. 454 Titanium sekvensointi on jonkin Los Alamos National Laboratory Laboratory Ohjaus tutkimus ja kehitys Grant (LDRD) ja CRK (20080464ER). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Itä osteri, Crassostrea virginica
, on tunnettu sen kaupallinen arvo ja merkitys kuin "ekosysteemi insinööri" [1] - [3]. Volyymit on kirjoitettu sen biologia ja ekologia, mukaan lukien vuorovaikutus bakteereja ja muita mikrobeja. Suuri osa tästä kirjallisuudesta on korostanut sairauksia [4], [5] ja läsnäolo ihmisen taudinaiheuttajien, etenkin Vibrio parahaemolyticus
ja V
. vulnificus
[6] - [9].

Useat tutkimukset ovat käsitelleet muita näkökohtia osteri-bakteerien vuorovaikutusta. Cristispira
on tunnistettu symbiootti liittyy kiteisen tyyli, joka on nilviäisten ruoansulatuskanavan rakenteeseen [10]. Stappia
(nyt Labrenzia
) on eristetty C
. gigas
ja C
. virginica
, ja jälkimmäisessä osallinen antagonistina etiologinen nuoriso Oyster Disease [11]. Culture riippuva tutkimukset ovat ominaista Vibrio
ja muiden sukujen liittyy irto- eläinten ja tiettyjen kudosten [6] - [8], [12], [13] kuten tunnistaminen "alkuperäiskansojen" bakteerit C . gigas
hemolymfassa [14], [15]. Tällaiset tutkimukset ovat myös osoittaneet, että itäisen Välimeren öljyvuoto ei vaikuttanut oyster liittyviä bakteereita [16]. Culture-riippumattomat tutkimukset ovat dokumentoineet malleja monimuotoisuuden eri populaatioissa ja kudoksissa verrattuna hautomo-esiin ja villieläinten, ja tunnistaa ε-Proteobacterium, Arcobacter
, koska merkittävä tekijä mikrobien Chilen osteri Tiostrea chiliensis
[17].

huolimatta taudinaiheuttajista liittyvien ja sormenjälkien tutkimukset lyhyesti edellä, ja mahdollista merkitystä bakteerien osteri ravinteiden hankintaa, yllättävän vähän on tietoa osteri vatsan ja suoliston microbiome monimuotoisuutta. Vaikka pH-arvot mahan ja suoliston kudokset ovat samanlaisia, ja hiukkasten kuljetusajoista suhteellisen lyhyt (noin 1-2 h) aktiivisessa ruokinta [18], on epäselvää, onko ominaisuus yhteisöjä olemassa sisällön näiden kudosten; se on yhtä epävarmaa, kuinka microbiomes saattaa vaihdella populaation tai väestöstä kauttaaltaan. Vastatakseen näihin kysymyksiin, saimme kaksi kolmena kappaleena eläimiä, yhdet kumpikin Hackberry Bay ja Lake Caillou rannikon Louisiana kesällä 2010. Nämä kaksi maantieteellisesti erillistä kohtaa (Barataria Bay ja Terrebonne Bay, vastaavasti) edustavat taloudellisesti tärkeitä lähteitä osterit , ja kokemus muistuttaa suolapitoisuus järjestelmien ja vaihtelevuutta [19]. Me erilliskerätyn mahan ja suolen sisältö, ja sekvensoitiin PCR-monistettu 16S rRNA geenejä käyttäen pyrosekvensointi alustalla (Roche Diagnostics 454 Titanium). Tulokset paljastivat merkittäviä eriyttäminen vatsan ja suoliston microbiomes eläinten paikasta (järven Caillou), mutta jonkin verran vähemmän eriyttäminen toisen sivuston (Hackberry Bay). Erityisesti Mollicutes osuus > 80% kaikista bakteerisekvenssejä vatsassa microbiomes järven Caillou ostereita, mutta < 10% Hackberry Bay ostereita. Vatsa Otus myös Actinobacteria, Chloroflexi, firmicutes, Planctomycetes, proteobacteria, ja Spartobacteria. Chloroflexi, Mollicutes, Planctomycetes ja Spartobacteria voi käsittää oletetun ydin vatsa microbiome, kun taas Chloroflexi, firmicutes, α-proteobacteria ja Verrucomicrobia saattavat myötävaikuttaa oletetun ydin gut microbiome.

Materiaalit ja menetelmät

Sample Collection

osterit kerättiin 4. elokuuta 2010 Hackberry Bay, pienen lahden vieressä Barataria Bay, Louisiana, USA. Tämä sivusto ei ollut vaikutusta öljyn Deepwater Horizon öljyvuoto [20]. Kolmena kappaleena osterit pidettiin jäissä (< 6 h) jalostusta Louisianan Sea Grant Oyster hautomossa, Grand Isle, LA, USA. Ulkoiset venttiilit puhdistettava poistaa epäpuhtaudet, ja sitten varovasti avasi jättäen eläimen ehjä. Mahan sisällön yksittäisten eläinten otettiin näytteet käyttämällä 23 gaugen neulojen ja 1-cm ^{3 ruiskua, jolloin saadaan noin 0,2 cm 3 nestettä, joka siirrettiin steriiliin 1,5 cm 3 mikrofugiputkiin. Suolen sisältö saatiin sijoittamalla suolistossa yksittäisten eläinten ja sitten varovasti puristamista hindgut materiaalia peräaukon steriiliin 1,5 cm 3 mikrofugiputkiin. Vatsan ja suoliston sisältö kuljetettiin jäissä laboratorioon at Louisiana State University (NY), jossa DNA uutettiin käyttäen MoBio PowerMaxin maaperän liuuttovälinepakkausta (MoBio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA) seuraten valmistajan ohjeita lisäämällä jäädyttämistä (-80 ° C, 10 min) /sulatus (60 ° C, 5 min) aikana kolme kertaa. Toinen sarja ostereita kerättyjen 1. syyskuuta 2010 Caillou Bay (Caillou järven), Louisiana, USA käsiteltiin samalla tavoin sillä poikkeuksella, että eläimet kuljetettiin jäillä laserskannausyksikkö laboratorioon ennen näytteenottoa mahan ja suolen sisältö. Tämä sivusto oli myös vaikuttanut Deepwater Horizon öljyvuoto. Näytteenotto lupia ei tarvita myöskään päällä.}

DNA Analysis

DNA otteita kaikista näytteistä monistettiin PCR: llä Platinum hifi-DNA-polymeraasia (Life Technologies Corp., La Jolla, CA) vuonna 25 ui reaktiot käyttämällä standardimenetelmiä, lukuun ottamatta 68 ° C laajennus lämpötila, ja alukkeita 515f ja 806R modifioitu viivakoodit ja adapterit sekvensointia käyttäen Roche 454 pyrosekvensointi alustaa titaani kemia [21]. Kukin reaktio sisälsi 11,5 ui vettä, 2,5 ui 10X hifi-puskuria (Life Technologies Corp., La Jolla, CA), 0,75 ui 100 mM dNTP: itä, 1 pl MgSO _{4, 5 ui 0,5 mg ml: ^{-1 BSA: ta, 1,5 ui kutakin 515f ja 806R-alukkeita, 0,2 ui hifi-DNA-polymeraasia (Life Technologies Corp., La Jolla, CA), ja 1 ui uutettua DNA: ta. Reaktioseokset denaturoitiin 3 min ajan 94 ° C: ssa, jota seurasi 26 sykliä 94 ° C 1 min, 1 min 54 ° C: ssa, ja 2 minuuttia 68 ° C: ssa, 10 min pidennysvaihe 68 ° C: ssa sen jälkeen, kun syklit olivat täydellisiä. Kolmena kappaleena reaktioita kunkin näytteen yhdistettiin, ja sitten lopullinen seos valmistettiin sekvensointia varten lisäämällä amplikoneihin kunkin näytteen yhtä massoja. Pyrosekvensointi toteutti Los Alamos National Laboratory sekvensointi laitos, tuloksena on yhteensä 237842 raaka lukee, joiden keskimääräinen pituus on 295 emäsparia. Sekvenssit on toimitettu MG-RAST palvelimen +4.501.864,3-+4.501.873,3 (http://metagenomics.anl.gov/linkin.cgi?project=1994).}}

Sequence Analysis

Raw sekvenssit jossa laatupisteet käsiteltiin kolmella putkistoja. PANGEA [22], käytettiin vertaamaan fylogeneettiseen koostumus näytteitä, jotka otus luokiteltiin käyttäen MEGABLAST viittauksella tietokanta, joka sisältää 170273 täyspitkän 16S rRNA-geenin sekvenssit Bakteerit ja Archaea eristää. Raw lukee seulottiin käyttämällä oletusarvot (keskimääräinen laatu pisteet, 20; vähimmäispituus, 100 emäsparia) [22]. Lukee olivat binned perustuu viivakoodeja, jotka leikataan ennen MEGABLAST. Sekvenssit osoitettu domain /pääjakso, luokka /tilaus /perhe ja suku ja laji tasoilla, vastaavasti, käyttäen samankaltaisuus kynnysarvoja 0,8, 0,9, 0,95 ja 0,99 [22]. Sekvenssejä ei ole luokitellut MEGABLAST olivat ryhmittyneet Otus perustuu samaan samankaltaisuutta kynnysarvoja. PANGEA myös luoneet toinen analyysi, jossa kaikki näytteet koostuivat yhtä monta lukee; nämä normalisoitu näyte aineistot muodostettiin käyttäen sekvenssejä satunnaisesti valittua vaihtamatta alkuperäisestä seulotaan mallitiedostot. Koostumukset vatsan ja suoliston näytteitä verrattiin käyttämällä pääkomponenttianalyysi eliminoinnin jälkeen singletons (sekvenssit edusti vain kerran koko aineisto), ja poistamisen jälkeen syanobakteerien ja eukaryoottiset sekvenssit (kloroplastikuljetuspeptidiä ja mitokondrioiden 16S rRNA peräisin levistä vuonna mahat ja suolet). Lopuista sekvenssit tunnistettu klo phylum tasolla tai alempana, edustaja sekvenssit Otus osuus ≥0.1% koko oli kuratoi käsin MEGABLAST GenBankin. Mikä tahansa sekvenssit tunnistettu väärin by PANGEA luokiteltiin uudelleen tarpeen.

CloVR putki [23] käytettiin oletusasetukset (esim keskimääräinen laatu pisteet, 25, vähimmäispituus, 100 emäsparia) luoda analyysit perustuvat taksonomisen kytkökset (eli näytteen koostumusta) ja sekvenssin fylogenia. Tätä tarkoitusta varten CloVR käytetään hybridi putki koostuu Mothur osa-rutiineja, jotka on luokiteltu sekvenssit kanssa RDP tietokantaan, ja QIIME osa-rutiinit eri tilastollisia analyysejä. Poistamisen jälkeen syanobakteerien ja eukaryoottiset sekvenssit, Otus luokiteltu CloVR että osuus ≥0.1% koko jäljellä lukee alistettiin manuaalinen kuratointiin kuten edellä. Aligned edustaja sekvenssit luokiteltujen, kuratoinut Otus käytettiin sitten Fast UniFrac analyysi (http://bmf2.colorado.edu/fastunifrac/), joka perustuu naapuri-liittymällä puu syötteenä.

Mothur putki [ ,,,0],24] käytettiin tiukempia arvoja kuin muut alustoja järjestyksessä trimmausta (eli liikkuva ikkuna 50 bp, joiden keskimääräinen laatu pisteet 35, vähimmäispituus, 100 emäsparia). "Classify" -toiminnon Mothur putki käytettiin tunnistamaan näytteen koostumusta Otus edustavat ≥0.1% tietokannan poistamisen jälkeen syanobakteerien ja eukaryoottiset sekvenssit. Jäljellä olevat sekvenssit kuratoitu kuten edellä. Nämä kuratoinut sekvenssit sekä vähäinen Otus lukuun singletons käytettiin tuottamaan monimuotoisuuden indeksejä näytteiden riippumattomia taksonomisten tunnuksilla (esim Shannon, käänteinen Simpsonin ja tasaisuus indeksit).

Tulokset

pre- käsittely rutiinit kolmesta putkistojen tässä tutkimuksessa käytetyt johti selvästi eri järjestyksessä numerot analyysi (taulukko S1). PANGEA tuotti eniten luettu numero (199592), ja Mothur saatiin vähiten (45626). Sekvenssit, läheisintä sukua syanobakteerien ja eukaryooteissa (kloroplastit ja mitokondrioiden 16S rRNA geenejä) hallitsi rajatun aineistoja (> 70%) riippumatta niiden koosta (taulukko S1). Nämä sekvenssit poistettiin muihin analyyseihin. Singleton sekvenssit välillä 0,5% (CloVR) 5,9% (PANGEA) paikkatietoaineistojen esikäsittelyn jälkeen; nämä sekvenssit eliminoidaan minimoida vaikutukset sekvensointi virhe. Kimeeriset sekvenssit ei tunnistettu mukaan PANGEA, vaan näytti olevan vain pieni osa (alle 0,2%) koko sekvenssin set (taulukko S1), joka perustuu tuloksiin CloVR ja Mothur.

Useat kuvioita esiintyi johdonmukaisesti . Suhteellinen runsaus otus prosentteina sekvenssien määrä analysoitiin osoitti, että järven Caillou Oyster vatsan ja suoliston microbiome koostumukset eroavat merkittävästi (Fig. 1 a, taulukot 1, 2). Pieni määrä Mollicute otus hallitsee entinen, kun taas Chloroflexi (enimmäkseen Caldilineae), firmicutes, γ-proteobacteria ja Verrucomicrobia (Spartobacteria) hallitsi myöhemmin. Kaikki kolme putkistojen paljasti myös eroja Hackberry Bay osteri vatsan ja suoliston microbiomes (Fig. 1a, taulukot 1, 2), mutta erot olivat vähäisempiä kuin Lake Caillou osterit. Erot Hackberry Bay vatsan ja suoliston microbiomes johtui pääasiassa vaatimaton muutoksista useisiin suvusta (esim Chloroflexi, firmicutes, α-proteobacteria, δ-proteobacteria, Planctomycetes ja Spartobacteria). Lisäksi kukin putkilinjojen paljasti erillisen eroja microbiomes kahden populaatioita Hackberry Bay ja Lake Caillou. Merkittävin erot tapahtui kahden sarjaa vatsan microbiomes, jossa jonkin verran vähemmän erottelu suolen microbiomes (Fig. 1a, taulukot 1, 2).

Huolimatta paljon yhtäläisyyksiä, PANGEA, CloVR ja Mothur ulostulo poikkesi tärkeissä suhteissa. Suhteessa CloVR ja Mothur, PANGEA tunnistettu vähemmän proteobacteria, Mollicutes ja Verrucomicrobia in Hackberry Bay osteri vatsa microbiomes, ja vähemmän Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, ja Verrucomicrobia suolen microbiomes. PANGEA johdonmukaisesti kirjasi suurempi osa "luokkiin" sekvenssit kuin teki CloVR tai Mothur; PANGEA ei yksilöinyt 60% Hackberry Bay osteri vatsa sekvenssit yli verkkotunnustasolla (taulukot 1, 2).

Eroja havaittiin myös taksonomisen kytkökset runsaimmin Otus (taulukko 3). PANGEA, CloVR ja Mothur kaikki raportoidut Planctomycetes yhtenä kahdesta yhtä runsaimmin otus in Hackberry Bay osteri vatsan microbiomes, mutta erityinen kytkökset sisällä Planctomycetes erosivat. Kytkökset Toisen OTU erilaisin, kuten firmicutes (PANGEA), Spartobacteria (CloVR) ja Mollicute (Mothur). Lisäksi, PANGEA raportoitu sekvenssi liittyvä Mycoplasma mobiili
kuin runsain OTU varten Hackberry Bay osteri gut microbiomes, kun taas muut putkilinjojen raportoitu Chloroflexi kanta (taulukko 3). Sitä vastoin kolme putkilinjojen osoitti paljon lähempänä sopimuksen Lake Caillou näytteet: kaikki havaittu, että OTU liittyy läheisesti M
. mobiili
oli runsain vatsassa microbiomes, ja OTU läheistä sukua Shewanella
sp. oli runsain suolen microbiomes. Kaksi Shewanella
isolaattien ilmoiteta, MOLA 59 (PANGEA) ja THt8-1 (CloVR ja Mothur), olivat identtiset yli nukleotidipaikat analysoitu. Kuitenkin Shewanella
sp. THt8-1 ja Shewanella
sp. MOLA 59 eristettiin maanpäällisten kasvien ja meren lähteistä, vastaavasti.

Analyysit koostumuksen (pääryhmät ja luokat) ja 284 luokitellut Otus (Fig. 1b) paljasti, kuvioita, jotka erosivat hieman vuodesta perustuvat suhteellinen runsaus phyla ja luokat kaikkien sekvenssit (Fig. 1a). Ensinnäkin erot vatsan ja suoliston microbiomes sivuston sisällä ja eri toimipaikkojen perustuvat OTU koostumus oli vähäisempi kuin perustuu esiintymistaajuuksia (Fig. 1a vs. 1b). Tämä ilmeni suuria (esim Chloroflexi, firmicutes, γ-proteobacteria, δ-proteobacteria ja Planctomyces) ja pieniä (esim Archaea, β-proteobacteria, ja Spartobacteria) avustajat OTU koostumus (Fig. 1b). Toiseksi prosentuaalinen osuus joidenkin phyla ja luokat luokitellut Otus oleellisesti yliedustettuina suhteessa niiden runsaus järjestyksessä tietojoukon, kun taas muut phyla ja luokat olivat merkittävästi aliedustettuina (Fig. 1a, b). Mollicutes olivat huomattavasti yliedustettuna Hackberry Bay ja Lake Caillou vatsa microbiomes, mutta aliedustettuja gut microbiomes. Chloroflexi ja Planctomyces myös yliedustettuna järven Caillou osteri suolen ja Hackberry Bay osteri vatsan ja suoliston microbiomes, kun α- ja β-proteobacteria ovat aliedustettuina kaikissa microbiomes (Fig. 1a, b).

Vastaava kuvio havaittiin, kun fylogeneettiseen kokoonpanon kaikki Otus tapahtuneen yhdistettiin Hackberry Bay ja Lake Caillou vatsa microbiomes verrattiin koostumukseen Otus, joka tapahtui tai jaettiin (SHR-S) molemmilla sivustoilla. Erityisesti, Chloroflexi, Mollicutes, Planctomyces ja Spartobacteria olivat yliedustettuina SHR-S otus (Fig. 2). Vastaavasti vertailu otus esiintyvien yhdistettiin Hackberry Bay ja Lake Caillou suolen microbiomes jaetun suolen otus (SHR-G) osoitti, että Chloroflexi, firmicutes, α-proteobacteria, Planctomyces ja Verrucomicrobia olivat yliedustettuna (Fig. 2). Määrä SHR-S Otus (44) oli paljon pienempi kuin määrä SHR-G Otus (112), joista jälkimmäinen oli lähes 40% kaikista luokiteltujen Otus, ja vielä suurempi osuus kuin löytyy suolistossa microbiomes (taulukko 4).

Otus, joka tapahtui yksilöllisesti vatsassa ja suolistossa microbiomes sekä Hackberry Bay ja Lake Caillou osteri populaatiot (SHRU-S, SHRU-G) edustaa toista erillistä alaryhmä. SHRU-S microbiome edusti vain 5 44 SHR-S Otus vain 3 phyla /luokat, ja osuus oli vain 2,1% 284 koko Otus tunnistettu kollektiivinen vatsan ja suoliston microbiomes (taulukko 4). Sen sijaan SHRU-G microbiome edustivat 44 112 SHR-G Otus 12 phyla /luokat, ja osuus 15,5% kaikista tunnistetut Otus (taulukko 4). Koostumus SHR-S ja SHRU-S microbiome Otus erosivat selvästi, kun taas erot SHR-G ja SHRU-G microbiomes rajoittuivat vähemmän phyla ja luokat (Fig. 2).

Lisäksi vaihtelevuus välillä mahan ja suoliston fylogeneettiseen koostumuksessa microbiomes vaihteli joukossa rinnakkaisten osterit jokaisesta sivustosta. Joidenkin phyla ja luokat, suhteellinen runsaus oli samankaltainen rinnakkaisnäytteiden, ja vaihtelu (ilmaistuna standardi keskivirhe) oli samanlainen kullekin kolmesta putkilinjojen (katso esimerkiksi Mollicutes ja α-proteobacteria vatsassa ja suolistossa microbiomes, vastaavasti; Taulukko 1, 2). Kuitenkin monissa tapauksissa replikaatissa vaihdella huomattavasti ja laajuus vaihtelua erosivat keskuudessa putkistoja. Mollicutes että Hackberry Bay suolen microbiome esimerkiksi havaittiin vain 1 3 rinnakkaisnäytteiden mukaan CloVR ja Mothur, ja olivat suhteettoman runsas yhdessä toistossa mukaan PANGEA (taulukko 2).

vaihtelevuuden rinnakkaista vangittiin klusterin analyysi (Fig. 3) ja pääkomponenttianalyysi (PCA) on CloVR tuloksia käyttämällä UniFrac etäisyydet (Fig. 4a, b), ja myös PCA n suhteellinen runsaus luokiteltujen Otus (Fig. S1). Tulokset Ryhmäanalyysin painotetun UniFrac metrinen osoitti, että järven Caillou mahassa replikoituu ja Hackberry Bay suolen jäljittelee kukin muodostaa erillisen klustereita, ja että yksittäiset toistojen olivat suhteellisen lähellä etäisyyden. Loput vatsan ja suoliston näytteet olivat paljon vähemmän johdonmukaista, jossa toistojen ratkaista kauempana. Painottamaton UniFrac PCA osoitti, että järven Caillou suolen microbiomes ryhmitelty yhteen akselilla yksi ja kaksi, mutta joka replikoituu muiden microbiomes olivat paljon enemmän hajallaan, vaikka eroja sivustoja ja välillä suolistossa ja mahan pysyi selvästi (Fig. 4a). Painotettu UniFrac PCA, joka pidetään suhteellinen runsaus on Otus, osoitti, että järven Caillou vatsa ja Hackberry Bay suolen jäljittelee kukin muodostaa suhteellisen tiukka klustereita kummallakin akselilla, kun taas rinnakkaista muiden microbiomes hajaantuivat (Fig. 4b). Kaksi mahassa microbiomes jäi tarkoin erotettu PCA akselilla 1, mutta suolen microbiomes ryhmittyivät yhteen (Fig. 4b).

Keskustelu

Esitämme tässä ensimmäinen perusteellisia analyysejä Crassostrea virginica
vatsan ja suoliston microbiome koostumuksia. Näytteen koko (kolmena kappaleena eläimet kullekin kaksi aluetta) ja yhden näytteenoton aikaraja tulosten yleistäminen, mutta tarjoavat useita uusia oivalluksia. Aiemmat tutkimukset ovat korostaneet viljelykelpoista jäseniä suolen yhteisöä, kokonainen eläin, taudinaiheuttajia (ihmisen ja osteri), tai tiettyjen, jotka saattavat edistää ruoansulatusta, esimerkiksi Cristispira
[5], [8] - [11] , [13], [25]. Viljely-vapaa lähestymistavat ovat paljastaneet Arcobacter
(ε-proteobacteria) olevan merkittävä mikrobien yhteisöjä koko Chilen osterit, Tiostrea chilensis
, mutta koko kudosspesifisiä yhdistyksiä ei ole raportoitu [17 ]. Hernádez-Zárate ja Olmos-Soto [26] ovat käyttäneet ryhmäkohtaisia ​​FISH ja PCR tunnistaa bakteerit C
. gigas
kudoksissa, mutta he eivät sekvenssi PCR-amplikonit tai raportoida suhteellinen runsaus tiettyjen fylogeneettiseen ryhmiä. Äskettäin PCR ja DGGE tutkimus C
. virginica
on raportoitu tila- ja vuodenaikojen erot koko eläimen microbiomes kaksi väestöä Maine (USA), mutta fylogeneettinen koostumus ei ole arvioitu laadullisesti tai määrällisesti [27], eivätkä vaihtelut joukossa yksittäisiä eläimiä on kuvattu.

Osittainen 16S rRNA geenisekvenssien peräisin suurikapasiteettisten pyrosekvensointi tarkoitetaan tässä tutkimuksessa paljastaa eroja osteri microbiome koostumuksessa useilla tasoilla, vaikka joitakin yksityiskohtia koostumus vaihtelee putkilinjan valittu sekvenssin analyysiä (esim taulukot 1 , 2). Katso tukeminen Tietoa S1 ylimääräisiä keskustella näistä eroista, jotka eivät vaikuta kuviot vaihtelua mahan ja suoliston microbiomes tai erot sivustoja.

Kaiken kaikkiaan tulokset osoittavat huomattavia eroja mahan ja suoliston microbiomes, ja välillä vatsan microbiomes eläimiä Hackberry Bay ja Lake Caillou (esim Fig. 1a, b ja 2, taulukot 1, 2). Lisäksi microbiome koostumukset yksittäisten rinnakkaisten eläinten vaihdella (Fig. 3, 4). Erot vatsan ja suoliston microbiomes todennäköisesti heijastavat yksityiskohdat ruoansulatuskanavan, mutta erot sivustoja ja joukossa rinnakkaista mukaan microbiome koostumus saattaa reagoida paikallisiin tekijöihin, ja ehkä geneettisiä eroja yksilöiden välillä. Analogisia vaihtelevuus on raportoitu muille eläimille [28], [29].

Oyster Vatsa Microbiome

Perustuu taajuus OTU esiintyminen, vatsan microbiome ostereita Louisiana voivat esiintyä osoitteessa ainakin kaksi valtiota. Mollicutes läheisintä sukua Mycoplasma
ylivoimaisesti hallitsevat luokitellut sekvenssit (> 80%) valtion edustaa järven Caillou ostereita (Fig. 1a, taulukot 1, 3). Mikään muu luokan osuus on suurempi kuin noin 2%. Planctomycetes hallitsevat (23% -33%) vaihtoehtoisen lau- että Hackberry Bay osterit (Fig. 1 a, taulukot 1, 3) -, mutta useita muita ryhmiä esiintyy myös vatsat näiden osterit vähäisin runsaus, esim Chloroflexi (8 %), firmicutes (9% -11), Mollicutes (5% -9%), proteobacteria (5% -12%), ja Verrucomicrobia (3% -14%). Lisäksi kaksi samalla runsas Otus jotka kuuluvat eri phyla (Planctomyces ja joko firmicutes, Tenericutes tai Verrucomicrobia) hallitsevat Hackberry Bay osteri vatsat klo lajitasolla (evolutiivinen etäisyys = 0,03; taulukko 3). Osuus luokiteltujen Otus osuus eri phyla ja luokat on sopusoinnussa myös kaksi erillistä valtiota varten mahan microbiome (Fig. 2), vaikka erot eivät ole yhtä suuri, jotta näitä tietoja kuin taajuus perustuvat arviot koostumuksen. UniFrac PCA (painotettu ja painottamaton) ja klusterin analyysit tarjoavat lisätukea "kahden valtion" käsite (Fig. 3, 4).

fysiologinen ja ekologinen merkitys näiden osteri vatsa microbiomes on epävarmaa. Määräävää Mollicutes tai Planctomycetes on hieman epätavallinen verrattuna muihin microbiomes [28], [30] - [32], vaikka Mollicutes näkyvät runsaasti ruoansulatus rauhanen Sydney kallion osteri ( Saccostrea glomerata
) ja suolistossa abalone, Haliotis kiekko hannai
[33], [34]. Mollicutes on myös raportoitu osteri suolistossa pikarisoluille perustuu mikroskooppisen todisteiden [25], ja dokumentoitu muiden selkärangattomien ja kalojen sisälmykset kulttuurin-pohjainen ja molekyylitason ekologisia menetelmiä [30], [35] - [42]. Muutoin suhteellisen vähän tiedetään niiden yhteenliittymien selkärangattomien ruoansulatusjärjestelmän. Todellakin, ekologinen asema Mollicutes yleisemmin jää epävarmaksi, joidenkin raporttien patogeenisuusmekanismien valituissa kalojen ja selkärangattomien [43] - [46], mutta muut kertomuksia jonkinlaista kommensalismi [30], [39].

toistaiseksi genomista todisteita tarjoaa muutamia oivalluksia, koska geneettinen ohjelmistoon Mycoplasma mobiili
, taksoniin läheisimmin liittyy osteri Otus, on rajoitettu sen soveltamisalaan [47]. M
. mobiili
samanlajisten osteri vatsat voi yksinkertaisesti lisääntyä käytettäessä alustan tuotettu isännän tai muiden mikrobien ruoansulatuksen aikana; vastaavia ehdotuksia on tehty tiliä Mollicute yhdistysten kylmän veden korallit [39]. Kuitenkin se mahdollisuus, että Mollicutes saattavat osaltaan symbiotically niiden isännät ei voida erottaa.

rooli Planctomyces ruoansulatuskanavan järjestelmissä on myös epävarmaa. Vaikka ne ovat ekologisesti tärkeitä jäseniä meren Bakteeri, toiminnallisesti monipuolinen ja liittyy levät, selkärangattomat ja selkärankaiset [48], [49], ne yleensä esiintyvät suhteellisen matalissa runsaus suolen microbiomes (< noin 5%) [30] - [32]. Kuitenkin tulokset tästä tutkimuksesta viittaavat siihen, että tuntematon olosuhteet Hackberry Bay osteri vatsa hyväksi Planctomycete lisääntymistä (taulukko 1).

On houkuttelevaa spekuloida tässä, koska muut ovat muualla [50], että Pirellula
kaltainen jäsenet osteri microbiome hyödyntää sulfatoidut levien polysakkaridit kasvulle, koska useat geenit oletetusti koodaavat sulfohydrolase entsyymejä on havaittu Rhodopirellula baltica
genomi [51], ja koska sulfatoidut polysakkaridit voisi olla yleisesti nautittavaksi osterit seurauksena kasviplanktonin kulutuksesta. Kyky käyttää sulfatoidut polysakkaridit olisi siten annettava selvitys Planctomycete runsautta. Valitettavasti fylogeneettiseen väliset suhteet R
. baltica
ja planctomycete Otus tunnistettu tässä tutkimuksessa eivät riitä tukemaan tällaisia ​​päätelmiä. Tästä huolimatta kaikki Blastopirellula
, Pirellula
, ja Rhodopirellula
isolaattien tunnettu tähän mennessä käyttää erilaisia ​​yksinkertaisia ​​ei-sulfatoidut sokerit [48], [49], [ ,,,0],52], ainakin joista osa on todennäköisesti esiintyy osteri ruoansulatuskanavan leväbiomassa hydrolysoituu.

Oyster Gut Microbiome

Oyster suolistossa microbiome satamat enemmän speciose tai OTU-rikas yhteisö kuin tekee vatsan microbiome perustuu havaittu lajin (S _{oBS) ja ACE ja Chao1 monimuotoisuus estimaattorit (taulukko 5). Nämä indeksit osoittavat myös, että vatsat ja suolet järven Caillou osterit satama vähemmän Otus kuin Hackberry Bay ostereita. Siten OTU rikkaus vaihtelee oyster kudosten (esim vatsan ja suoliston) kuten on hyvin dokumentoitu ihmisen microbiome [53], mutta myös näyttää vaihtelevan väestöryhmistä. Lähde vaihtelut rikkauden keskuudessa osteri populaatiot ei tunneta.}

Vaihtelut rikkaus huolimatta, suolistossa microbiome ei välttämättä monipuolisempi kuin mahalaukussa microbiome perustuvat Shannonin ja käänteinen Simpsonin indeksit ja tasaisuus estimaattori, joista kukin ovat samanlaisia ​​järven Caillou suolen microbiome ja kaksi Hackberry Bay microbiomes (taulukko 5). Tämä samankaltaisuus osoittaa, että joissakin tapauksissa rakenteessa osteri microbiome monimuotoisuuden (rikkauden ja tasaisuus) on riippumaton ruoansulatuskanavan ja phylotype koostumus. Sen sijaan kaikki monimuotoisuus indeksit Lake Caillou vatsa microbiome ovat merkittävästi pienempiä kuin Hackberry Bay vatsat, ja alhaisempi kuin molempien gut microbiomes samoin. Tämä johtuu ylivoima Lake Caillou osteri vatsat Mollicute Otus (esimerkiksi taulukko 5 ja kuvio. 1a).

koostumus suolen microbiomes Louisiana osterit poikkeaa muista nilviäisiä ja että muut meren ja ei-merieläinten (Fig. 5). Gruenthal [54] on osoittanut, että proteobacteria dominoivat (> 80%) suolen microbiomes Kalifornian musta ( Haliotis cracherodii
) ja valkoinen abalone ( H
. sorenseni
); Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomyces ja Verrucomicrobia näyttävät olevan poissa molemmista. Huang et al. [41] osoittaa, että Mollicutes ja δ-proteobacteria hallitsevat suolistossa pieni abalone. Cardoso, et ai. [55] raportin, Bacteroidetes ja firmicutes hallitsevat suolistossa on kotilo etana, akaattikotilo
. Firmicutes yhdessä Bacteroidetes, proteobacteria ja Actinobacteria hallitsevat suolet muiden selkärangattomien (esim maaperän ruokinta termiittejä [56] ja torakat [57]) ja selkärankaiset (esim kasvissyöjä merikaloissa [58]; ruohokarppi, [31], [ ,,,0],59] ja kädellisillä [60]), kun taas Mollicutes hallitsevat suolet kalaa [30], [36]. Sen sijaan proteobacteria muodostavat vain noin 20% gut koostumuksen osterit tässä tutkimuksessa, Chloroflexi, Planctomyces ja Verrucomicrobia ovat kukin suhteellisen runsaasti, ja Actinobacteria, Bacteroidetes, firmicutes, ja Mollicutes kukin osaltaan noin 10% tai vähemmän (Fig. 1 a, taulukko 3).

Nämä erot koostumuksessa keskuudessa suolistossa järjestelmissä syntyvät useiden haitalliseksi vuorovaikutuksessa muuttujista kuten suoliston arkkitehtuuri, ruoansulatus fysiologia, ruokavalio, ja missä määrin isännät ja microbiomes ovat kehittyneet symbiotically [61 ] - [63].

• PLoS ONE: kannabinoidiannos HU210 Suojaa yksittäisiä Rat Vatsa vastaan ​​heikentävää Serum of Rats kokeellisten Akuutti Pancreatitis
• PLoS ONE: kitinaasiaktiivisuuden mRNA-tasojen mukaan kvantitatiivinen PCR käyttäminen Standard DNA: Hapan Nisäkkäiden kitinaasiaktiivisuuden on merkittävä Transcript Hiiri Stomach