PLoS ONE: Analyse von Magen und Darm Microbiomes der östlichen Oyster (Crassostrea virginica) von Coastal Louisiana, USA

Abstrakt

Wir haben einen hohen Durchsatz Pyrosequenzierung Magen und Darminhalt microbiomes von zu charakterisieren Crassostrea virginica
, die Auster Ostern, erhalten von zwei Stellen, eine in Barataria Bay (Zürgelbaum Bay) und die andere in Terrebonne Bay (See Caillou), Louisiana, USA. Magen microbiomes in Austern aus Zürgelbaum Bay wurden überwiegend geprägt von Mollicutis am ehesten im Zusammenhang mit Mycoplasma
; eine reiche Gemeinde von Planctomyctes dominiert aufgetreten in Lake Caillou Auster Mägen. Gut Gemeinden für Austern von beiden Standorten unterschied sich von Magen Gemeinden und beherbergte eine relativ vielfältige Ansammlung von Phylotypen. Phylotypen am ehesten im Zusammenhang mit Shewanella
und einem Chloroflexi Stamm, der die See Caillou und Zürgelbaum Bay Darmmikrobiota dominiert sind. Während viele Mitglieder des Magens und Darms microbiomes erschien Transienten oder Opportunisten, eine putative Kern microbiome basierte auf Phylotypen identifiziert werden, die nur in den Magen oder Darmproben auftrat. Der vermeintliche Kern Magen microbiome umfasste 5 OTUs in 3 phyla, während der vermeintliche Kern gut microbiome 44 OTUs in 12 phyla enthalten. Diese Ergebnisse gemeinsam neuartige mikrobielle Gemeinschaften in der Auster Verdauungssystem offenbart, sind die Funktionen der Auster microbiome weitgehend unbekannt. Ein Vergleich von microbiomes aus Louisiana Austern mit Bakteriengemeinschaften für andere wirbellose Meerestiere und Fische berichtet angegeben, dass Mollusken microbiomes einander ähnlicher waren als zu microbiomes von Polychaeten, decapods und Fisch

Citation:. König GM, Judd C , Kuske CR, Smith C (2012) Analyse von Magen und Darm Microbiomes der Eastern Oyster ( Crassostrea virginica
) von Coastal Louisiana, USA. PLoS ONE 7 (12): e51475. doi: 10.1371 /journal.pone.0051475

Editor: Josh Neufeld, University of Waterloo, Kanada

Empfangen: 8. Juni 2012; Akzeptiert: 5. November 2012; Veröffentlicht am: 12. Dezember 2012

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Finanzierung:. Die Autoren danken NSF Auszeichnung OCE-1043126 und Gomri-LSU Mittel für die Unterstützung von GK, CS und CJ GK. Die 454 Titanium Sequenzierung wurde von einem Los Alamos National Laboratory Laboratory Directed Forschung und Entwicklung Grant (LDRD) nach CRK (20080464ER) zur Verfügung gestellt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Die Amerikanische Auster, Crassostrea virginica
, ist bekannt für ihren wirtschaftlichen Wert und Bedeutung als "Ökosystem-Ingenieur" bekannt [1] - [3]. Bände wurden über ihre Biologie und Ökologie geschrieben, auch der Wechselwirkungen mit Bakterien und anderen Mikroben. Ein großer Teil dieser Literatur hat betont, Krankheiten [4], [5] und die Anwesenheit von menschlichen Krankheitserregern, insbesondere Vibrio parahaemolyticus
und V
. vulnificus
[6] - [9].

Viele Studien andere Aspekte der Auster-Bakterien Interaktionen angesprochen haben. Cristispira
als Symbionten mit dem kristallinen Stil, eine Mollusken Verdauungs Struktur [10] assoziiert identifiziert wurde. Stappia
( jetzt Labrenzia
) wurde von C
isoliert. gigas
und C
. virginica
, und im letzteren als Antagonist für den Erreger der Juvenile Oyster Krankheit in Verbindung gebracht [11]. Kultivierungsabhängige Untersuchungen charakterisiert Vibrio Karten und andere Gattungen, die mit Masse Tieren und bestimmten Geweben [6] - [8], [12], [13] einschließlich der Identifizierung von "einheimischen" Bakterien in C . gigas
Hämolymphe [14], [15]. Solche Studien haben auch, dass eine östliche Mittelmeer Ölpest Auster-assoziierten Bakterien beeinflussen nicht gezeigt [16]. Kultur-unabhängige Studien haben unter verschiedenen Populationen und Gewebe-Muster der Vielfalt dokumentiert, verglichen Brüterei aufgezogen und wilde Tiere, und identifiziert die ε-Proteo, Arcobacter
als wichtiger Faktor für die mikrobielle Gemeinschaft der chilenischen Auster Tiostrea chiliensis
[17].

Trotz der pathogen-associated erkennungs Studien oben zusammengefasst, und die potenzielle Bedeutung der Bakterien für Auster Nährstofferfassung, überraschend wenig Informationen gibt es auf Auster Magen und Darm microbiome Vielfalt. Obwohl pH-Werte von Magen und Darmgewebe ähnlich sind, und die Partikellaufzeiten relativ kurz (ca. 1-2 h) während der aktiven Fütterung [18], ist es unklar, ob charakteristischen Lebensgemeinschaften gibt es in den Inhalt dieser Gewebe; es ist ebenso ungewiss, wie microbiomes innerhalb einer Population oder über Populationen variieren. Um diese Fragen zu beantworten, erhalten wir zwei Sätze von Dreifach Tiere, ein Satz jeweils von Hackberry Bay und den See Caillou in Küsten Louisiana im Sommer 2010. Diese zwei geografisch getrennten Standorten (Barataria Bay und Terrebonne Bay, beziehungsweise) repräsentieren wirtschaftlich wichtige Quellen für Austern und ähnliche Erfahrung wie Salinität Regimen und Variabilität [19]. Wir separat Magen- und Darminhalt gesammelt und sequenziert PCR-amplifizierte 16S rRNA-Gene unter Verwendung einer Pyrosequenzierung Plattform (Roche Diagnostics 454 Titanium). Die Ergebnisse zeigten deutliche Differenzierung zwischen Magen und Darm microbiomes von Tieren von einem Ort (See Caillou), aber etwas weniger Differenzierung für die zweite Stelle (Zürgelbaum Bay). Bemerkenswert ist, entfielen Mollicutis für > 80% aller bakteriellen Sequenzen in den Magen microbiomes des Lake Caillou Austern, aber < 10% der Zürgelbaum Bay Austern. Magen OTUs enthalten auch Actinobacteria, Chloroflexi, Firmicutes, Planctomycetes, Proteo und Spartobacteria. Chloroflexi, Mollicutis, Planctomycetes und Spartobacteria könnte ein mutmaßliches Kern Magen microbiome umfassen, während Chloroflexi, Firmicutes, α-Proteo und Verrucomicrobia zu einem vermeintlichen Kern gut microbiome beitragen könnten.

Materialien und Methoden

Proben Sammlung

Austern wurden am 4. August gesammelt 2010 von Hackberry Bay, einer kleinen Bucht angrenzenden Barataria Bay, Louisiana, USA. Diese Seite war unbeeinflusst von Öl aus dem Deepwater Horizon Ölpest [20]. Triplicate Austern wurden auf Eis gehalten (< 6 h) für die anfängliche Verarbeitung an der Louisiana Sea Grant Oyster Hatchery, Grand Isle, LA, USA. Die externen Ventile wurden gründlich gereinigt Oberflächenverunreinigungen zu entfernen, und dann intakt bleibt das Tier vorsichtig geöffnet. Der Mageninhalt der einzelnen Tiere beprobt mit 23-Gauge-Nadeln und 1-cm ^{3 Spritzen, wodurch man etwa 0,2 cm 3 von Flüssigkeit, die in sterile 1,5 cm übertragen wurde 3 Mikrozentrifugenröhrchen. Gut Inhalte wurden, indem der Darm von einzelnen Tieren gewonnen und dann sorgfältig Enddarm Material aus dem After in sterile 1,5 cm extrudiert 3 Mikrozentrifugenröhrchen. Magen-und Darminhalt wurden auf Eis in ein Labor an der Louisiana State University (LSU) transportiert, wo DNA extrahiert wurde eine MOBIO PowerMax Boden-Extraktions-Kits (MOBIO Laboratories, Inc., Carlsbad, CA) mit folgenden Anweisungen des Herstellers mit der Zugabe eines Gefrier (bei -80 ° C, 10 min) /Auftau (bei 60 ° C, 5 min) Zyklus dreimal wiederholt. Ein zweiter Satz von Austern am 1. September gesammelt 2010 von Caillou Bay (Caillou See), Louisiana, USA wurden in ähnlicher Weise mit der Ausnahme verarbeitet, dass die Tiere auf dem Eis ins Labor LSU transportiert wurden vor der Probenahme Magen und Darminhalt. Diese Seite war auch unbeeinflusst von der Bohrinsel Deepwater Horizon Ölpest. Sampling Genehmigungen wurden für beide Seite nicht erforderlich.}

DNA-Analyse

DNA-Extrakte von allen Proben mittels PCR wurden mit Platin High-Fidelity DNA-Polymerase (Life Technologies Corp, La Jolla, CA) in 25 &mgr; l-Reaktionen unter Verwendung von Standardprotokollen mit Ausnahme einer 68 ° C-Erweiterung Temperatur und Primer 515f und 806r, modifiziert mit Barcodes und Adapter für die Sequenzierung der Roche 454 Pyrosequenzierung Plattform mit Titanchemie [21]. Jedes Reaktionsgemisch enthielt 11,5 ul Wasser, 2,5 ul 10x-High-Fidelity-Puffer (Life Technologies Corp, La Jolla, CA), 0,75 ul 100 mM dNTPs, 1 ul MgSO _{4, 5 ul 0,5 mg ml ^{-1 BSA, 1,5 &mgr; l für jede 515f und 806r Primer, 0,2 &mgr; l High-fidelity DNA-Polymerase (Life Technologies Corp., La Jolla, CA) und 1 &mgr; l der extrahierten DNA. Reaktionsgemische wurden für 3 min bei 94 ° C denaturiert, gefolgt von 26 Zyklen von 94 ° C für 1 min, 1 min bei 54 ° C und 2 min bei 68 ° C, mit einer 10 min Verlängerungsschritt bei 68 ° C nach die Zyklen vollständig waren. Triplicate Reaktionen für jede Probe wurden gepoolt und anschließend auf eine endgültige Mischung wurde für die Sequenzierung hergestellt durch Amplicons aus jeder Probe in gleichen Massen hinzuzufügen. in insgesamt 237.842 roh wurde von der Los Alamos National Laboratory Sequenzierung Anlage durchgeführt Pyrosequencing, was liest mit einer durchschnittlichen Länge von 295 bp. Die Sequenzen wurden mit dem MG-RAST-Server als 4.501.864,3-4501873,3 (http://metagenomics.anl.gov/linkin.cgi?project=1994) vorgelegt.}}

Sequenzanalyse

Rohsequenzen mit Qualitätskennzahlen wurden drei Pipelines verarbeitet werden. PANGEA [22] wurde verwendet, um die phylogenetische Zusammensetzung von Proben zu vergleichen, für die OTUs klassifiziert wurden unter Verwendung von MEGABLAST mit einer Referenzdatenbank enthält 170.273 voller Länge 16S rRNA-Gen-Sequenzen aus Bakterien und Archaea isoliert. Raw liest wurden unter Verwendung von Standardwerten (durchschnittliche Qualität der Gäste, 20; Mindestlänge, 100 bp) gescreent [22]. Liest beruhten auf Barcodes binned, die vor MEGABLAST getrimmt wurden. Die Sequenzen wurden auf Domäne /Phylum, Klasse /Ordnung /Familie und Gattung und Art Stufen zugeordnet, die jeweils unter Verwendung von Ähnlichkeitsschwellenwerten von 0,8, 0,9, 0,95 und 0,99 für [22]. Sequenzen nicht von MEGABLAST klassifiziert wurden in OTUs gruppierten basiert auf den gleichen Ähnlichkeitsschwellen. PANGEA erstellt auch eine zweite Analyse wurden alle Proben der gleichen Anzahl von Lesevorgängen bestand; Diese normierten Proben Datensätze wurden unter Verwendung von Sequenzen zufällig ausgewählt ersatzlos von den ursprünglichen gescreent Beispieldateien aufgebaut. Die Zusammensetzungen der Magen- und Darmproben wurden verglichen unter Verwendung von Hauptkomponentenanalyse nach singletons (Sequenzen repräsentiert nur einmal in der vollständigen Datensatz) eliminiert, und nach Cyanobakterien und eukaryotischen Sequenzen (Chloroplasten und Mitochondrien-16S-rRNA von Algenzellen in Magen und Därme) zu entfernen. Von den verbleibenden Sequenzen bei einer phylum Ebene identifiziert oder niedriger ist, repräsentative Sequenzen für OTUs Bilanzierung von ≥0.1% des gesamten kuratiert wurden manuell MEGABLAST in GenBank verwenden. Alle Sequenzen von PANGEA falsch identifiziert wurden als notwendig umklassifiziert

Die CloVR Pipeline [23] wurde mit den Standardeinstellungen verwendet (zB durchschnittliche Qualität der Gäste, 25; Mindestlänge, 100 bp). Analysen zu erstellen basierend auf taxonomische Zugehörigkeiten (dh Probenzusammensetzung) und Sequenz Phylogenie. Zu diesem Zweck verwendet CloVR eine Hybrid-Pipeline, bestehend aus Mothur Unterroutinen, die Sequenzen mit der RDP-Datenbank klassifiziert und QIIME Subroutinen für verschiedene statistische Analysen. Nach dem Entfernen Cyanobakterien und eukaryotischen Sequenzen, klassifiziert OTUs durch CloVR die für ≥0.1% der Gesamt entfielen verbleibenden liest, wie oben in den Hand curation unterworfen wurden. Aligned repräsentative Sequenzen für Kleinanzeigen, kuratiert OTUs wurden dann für eine schnelle UniFrac Analyse verwendet (http://bmf2.colorado.edu/fastunifrac/) basierend auf einem Neighbor-Joining Baum als Eingabe.

Die Mothur Pipeline [ ,,,0],24] wurde mit strengere Werte als die anderen Plattformen für die Sequenz verwendet Trimmen (dh ein sich bewegendes Fenster von 50 bp mit einer durchschnittlichen Qualitätsfaktor von 35; Mindestlänge, 100 bp). Die "Klassifizieren" -Funktion der Mothur Pipeline verwendet wurde für die Probenzusammensetzung zu identifizieren OTUs darstellt ≥0.1% der Datenbank Cyanobakterien und eukaryotischen Sequenzen nach dem Entfernen. Die restlichen Sequenzen wurden wie oben kuratiert. Diese kuratierte Sequenzen sowie die kleineren OTUs ohne Singletons wurden verwendet, um Diversitätsindizes für die Proben unabhängig von taxonomischen Identifikationen (zB Shannon, inverse Simpson und Gleichmässigkeit Indizes).

Ergebnisse |

Die prä- erzeugen Verarbeitungsroutinen der drei Rohrleitungen in dieser Studie eingesetzt ergab deutlich unterschiedlichen Sequenznummern für die Analyse (Tabelle S1). PANGEA ergab die größte Lesenummer (199592) und Mothur ergab die am wenigsten (45.626). Die Sequenzen am ehesten im Zusammenhang mit Cyanobakterien und Eukaryoten (Chloroplasten und Mitochondrien-16S-rRNA-Gene) dominierten die getrimmten Datensätze (> 70%) unabhängig von ihrer Größe (Tabelle S1). Diese Sequenzen wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Singleton-Sequenzen von 0,5% (CloVR) bis 5,9% (PANGEA) der Datensätze nach der Vorverarbeitung dargestellt; Diese Sequenzen wurden auch zu minimieren Auswirkungen der Sequenzierung Fehler beseitigt. Chimäre Sequenzen wurden von PANGEA nicht identifiziert wird, aber erschien nur ein kleiner Bruchteil (< 0,2%) zu bilden. Der gesamten Sequenz (Tabelle S1), basierend auf den Ergebnissen von CloVR und Mothur

Mehrere Modelle erschien konsequent . Die relative Häufigkeit von OTUs als Prozentsatz der Anzahl der Sequenzen zeigte, analysiert, dass See Caillou Austern Magen und Darm microbiome Zusammensetzungen unterschieden sich erheblich (Fig 1a;. Tabellen 1, 2). Eine kleine Anzahl von Mollicutes OTUs dominiert das ehemalige, während Chloroflexi (meist Caldilineae), Firmicutes, γ-Proteo und Verrucomicrobia (Spartobacteria) die später dominiert. Alle drei Rohrleitungen zeigte auch Unterschiede zwischen Hackberry Bay Austern Magen und Darm microbiomes (1a;. Tabellen 1, 2), aber die Unterschiede waren weniger ausgeprägt als jene für Lake Caillou Austern. Die Unterschiede zwischen den Hackberry Bay Magen und Darm microbiomes resultierte in erster Linie aus bescheidenen Änderungen in mehreren Linien (z.B. Chloroflexi, Firmicutes, α-Proteo, δ-Proteo, Planctomycetes und Spartobacteria). Darüber hinaus hat jeder der Pipelines ergab deutliche Unterschiede zwischen den microbiomes der zwei Populationen von Zürgelbaum Bay und den See Caillou. Die bemerkenswertesten Unterschiede gab es zwischen den beiden Sätzen von Magen microbiomes, mit etwas weniger Differenzierung zwischen den Darm microbiomes (Abb. 1a, Tabellen 1, 2).

Trotz vieler Ähnlichkeiten, PANGEA, CloVR und Mothur Ausgang in wichtigen Punkten unterscheiden. Bezogen auf CloVR und Mothur, identifiziert PANGEA weniger Proteo, Mollicutis und Verrucomicrobia in Hackberry Bay Auster Magen microbiomes und weniger Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes und Verrucomicrobia in gut microbiomes. PANGEA auch aufgezeichnet konsequent einen größeren Anteil der "nicht klassifiziert" Sequenzen als CloVR oder Mothur tat; PANGEA nicht identifizieren 60% der Zürgelbaum Bay Auster Magen-Sequenzen über die Domain-Ebene (Tabellen 1, 2).

Unterschiede auch in den taxonomischen Zugehörigkeit der am häufigsten vorkommenden OTUs (Tabelle 3) beobachtet wurden. PANGEA, CloVR und Mothur alle berichteten Planctomycetes als einer von zwei gleich am reichlichsten OTUs in Hackberry Bay Auster Magen microbiomes, aber die spezifischen Zugehörigkeiten innerhalb der Planctomycetes unterschieden. Die Einstellung des zweiten OTU auch unterschieden, darunter ein Firmicute (PANGEA), Spartobacteria (CloVR) und Mollicutes (Mothur). Darüber hinaus berichtete PANGEA eine Sequenz im Zusammenhang mit Mycoplasma Handy
als häufigste OTU für Hackberry Bay Auster gut microbiomes, während die anderen Pipelines eine Chloroflexi Stamm (Tabelle 3) berichtet. Im Gegensatz dazu zeigten die drei Pipelines viel näher Vereinbarung für Lake Caillou Proben: alle festgestellt, dass ein eng OTU im Zusammenhang mit M
. Mobil
war am häufigsten in Magen microbiomes und ein OTU eng verwandt mit einem Shewanella
sp. war am meisten in gut microbiomes reichlich vorhanden. Die beiden Shewanella
Isolate berichtet, MOLA 59 (PANGEA) und THt8-1 (CloVR und Mothur) waren identisch über den Nukleotid-Positionen analysiert. Allerdings Shewanella
sp. THt8-1 und Shewanella
sp. 59 MOLA wurden von terrestrischen Pflanzen und marinen Quellen isoliert wurden.

Die Analyse der Zusammensetzung (phyla und Klassen) der 284 klassifiziert OTUs (Abb. 1b) ergab, Muster, die etwas von denen auf der Grundlage relativer Fülle wichen von phyla und Klassen unter allen Sequenzen (Abb. 1a). Zunächst Unterschiede zwischen Magen und Darm microbiomes innerhalb einer Website und über Standorte hinweg basierend auf OTU Zusammensetzung waren weniger ausgeprägt als solche, die auf Frequenzen des Auftretens (Abb. 1a vs. 1b). Dies zeigte sich für die großen (z.B. Chloroflexi, Firmicutes, γ-Proteo, δ-Proteo und Planctomyces) und kleinere (zum Beispiel Archaea, β-Proteo und Spartobacteria) Mitwirkende zu OTU Zusammensetzung (Abb. 1b). Zweitens wurde der prozentuale Anteil von rund phyla und Klassen der klassifizierten OTUs im Wesentlichen überrepräsentiert im Verhältnis zu ihrer Hülle und Fülle in den Datensatz-Sequenz, während andere Stämme und Klassen im Wesentlichen unterrepräsentiert waren (Abb. 1a, b). Mollicutis wurden in Hackberry Bay und den See Caillou Magen microbiomes stark überrepräsentiert, aber in gut microbiomes unterrepräsentiert. Chloroflexi und Planctomyces wurden auch in Lake Caillou Auster gut überrepräsentiert und Zürgelbaum Bay Auster Magen und Darm microbiomes, während α- und β-Proteo wurden in allen microbiomes (Abb. 1a, b).

Ein analoges Muster unterrepräsentiert wenn die phylogenetische Zusammensetzung aller OTUs wurde beobachtet, dass in gepoolten Zürgelbaum Bay und den See Caillou Magen microbiomes auftrat, wurde mit der Zusammensetzung von OTUs verglichen, die in aufgetreten oder wurden geteilt (SHR-S) über beide Seiten. Insbesondere Chloroflexi, Mollicutis, Planctomyces und Spartobacteria wurden unter den SHR-S OTUs (Abb. 2) überrepräsentiert. In ähnlicher Weise zeigte ein Vergleich der OTUs vorkommenden in gepoolten Zürgelbaum Bay und den See Caillou gut microbiomes mit dem gemeinsamen Darm OTUs (SHR-G), dass Chloroflexi, Firmicutes, α-Proteo, Planctomyces und Verrucomicrobia überproportionaler (Abb. 2). Die Anzahl der SHR-S OTUs (44) war viel kleiner als die Anzahl der SHR-G OTUs (112), von denen die letztere fast 40% aller klassifizierten OTUs entfielen, und ein noch größerer Prozentsatz derjenigen im Darm gefunden microbiomes (Tabelle 4).

OTUs, die eindeutig in Magen oder Darm microbiomes sowohl Hackberry Bay und den See Caillou Auster Populationen (SHRU-S, SHRU-G) repräsentiert einen weiteren deutlichen Untergruppe auftrat. Die SHRU-S microbiome wurde von nur 5 der 44 SHR-S OTUs in nur 3 phyla /Klassen repräsentiert, und einen Anteil von nur 2,1% der 284 insgesamt OTUs im kollektiven Magen identifiziert und gut microbiomes (Tabelle 4). Im Gegensatz dazu waren die SHRU-G microbiome von 44 der 112 SHR-G OTUs 12 phyla /Klassen repräsentiert, und einen Anteil von 15,5% aller identifizierten OTUs (Tabelle 4). Die Zusammensetzung von SHR-S und SHRU-S microbiome OTUs unterschied sich deutlich, während Unterschiede zwischen den SHR-G und SHRU-G microbiomes zu weniger phyla und Klassen beschränkt waren (Abb. 2).

Neben der Variabilität zwischen Magen und Darm phylogenetische Zusammensetzung, die microbiomes von jedem Standort unter den Wiederholungs Austern variiert. Für einige Stämme und Klassen waren relativen Häufigkeiten ähnlich unter den Wiederholungen und Variabilität (als Standardfehler des Mittelwerts ausgedrückt wird) für jede der drei Rohrleitungen ähnlich war (siehe beispielsweise Mollicutes und α-Proteo in Magen und Darm microbiomes sind; Tabelle 1, 2). Jedoch repliziert wesentlichen in vielen Fällen variiert, und das Ausmaß der Variabilität unter Rohrleitungen unterschieden. Mollicutis im Darm microbiome Zürgelbaum Bay, zum Beispiel, wurde von CloVR und Mothur und waren überproportional häufig in einem Wiederholungs nach PANGEA (Tabelle 2).

Veränderlichkeit unter den Wiederholungen in nur 1 von 3 Replikaten beobachtet wurden gefangen durch Clusteranalyse (Abb. 3) und Hauptkomponentenanalyse (PCA) von CloVR Ergebnisse mit UniFrac Entfernungen (Abb. 4a, b), und auch durch PCA der relativen Häufigkeiten von klassifizierten OTUs (Abb. S1). Die Ergebnisse einer Clusteranalyse des gewichteten UniFrac Metrik zeigte, dass der See Caillou Magen repliziert und Zürgelbaum Bay gut repliziert jeweils gebildet unterschiedliche Cluster, und dass die einzelnen Replikate in Abstand relativ nah waren. Die restlichen Magen und Darm Proben waren viel weniger kohärent, mit Replikaten in größeren Abständen aufgelöst. Ungewichteten UniFrac PCA zeigte, dass See Caillou gut microbiomes gruppierten zusammen auf der Achse ein und zwei, aber das repliziert für die anderen microbiomes viel mehr dispergiert waren, obwohl die Unterscheidungen zwischen den Standorten und zwischen Darm und Magen verblieb offensichtlich (Fig. 4a). Die gewichteten UniFrac PCA, der die relativen Häufigkeiten von OTUs betrachtet, zeigte, dass See Caillou Magen und Darm Bay Zürgelbaum jeweils relativ engen Cluster auf beiden Achsen gebildet repliziert, während Replikate für die anderen microbiomes verteilt waren (Abb. 4b). Die beiden Magen microbiomes blieb gut getrennt auf PCA Achse 1, aber die gut microbiomes gruppierten zusammen (Abb. 4b).

Diskussion

Wir stellen Ihnen hier die ersten detaillierten Analysen von Crassostrea virginica
Magen und Darm microbiome Kompositionen. Die Stichprobengröße (dreifacher Ausfertigung Tiere für jede der beiden Seiten) und Einzelgrenzt Abtastzeit Extrapolation der Ergebnisse, aber eine Reihe neuer Erkenntnisse. Frühere Studien haben cultivable Mitglieder der Gemeinschaft gut, ganze Tiere, Pathogenen (human und Austern) oder spezifische Gruppen hervorgehoben, die Verdauung beitragen könnten, beispielsweise Cristispira
[5], [8] - [11] [13], [25]. Der Anbau freie Ansätze offenbart haben Arcobacter
(ε-Proteo) als wichtigen Beitrag zur mikrobiellen Gemeinschaften der ganzen chilenischen Austern, Tiostrea chilensis
, aber ganz spezifische Gewebeverbände wurden nicht gemeldet [17 ]. Hernadez-Zárate und Olmos-Soto [26] haben gruppenspezifische FISH und PCR verwendet, um Bakterien in C
zu identifizieren. gigas
Gewebe, aber sie haben nicht die Sequenz PCR-Produkte oder relativen Häufigkeiten bestimmter phylogenetischen Gruppen berichten. Vor kurzem wurde eine PCR und DGGE Studie von C
. virginica
hat für zwei Populationen aus Maine (USA), aber phylogenetische Zusammensetzung räumliche und saisonale Unterschiede in der ganzen Tier microbiomes berichtet wurde, qualitativ oder quantitativ [27], noch haben Unterschiede zwischen den einzelnen Tieren beschrieben worden, nicht bewertet werden.

Partielle 16S-rRNA-Gensequenzen aus hohem Durchsatz Pyrosequenzierung abgeleitet, wie in dieser Studie verwendet, um Unterschiede in Austern microbiome Zusammensetzung offenbaren auf mehreren Ebenen, obwohl einige der Details der Zusammensetzung variieren mit der Rohrleitung für die Sequenzanalyse ausgewählt (beispielsweise Tabellen 1 , 2). Siehe Hintergrundinformationen S1 für weitere Diskussion dieser Unterschiede, die nicht die Variationsmuster zwischen Magen und Darm microbiomes oder Variationen zwischen den Standorten beeinflussen.

Insgesamt zeigen die Ergebnisse erhebliche Unterschiede zwischen Magen und Darm microbiomes und zwischen der Magen microbiomes von Tieren aus Zürgelbaum Bay und den See Caillou (zB 1a, b und 2;. die Tabellen 1, 2). Darüber hinaus variieren die microbiome Zusammensetzungen einzelner replicate Tieren (Fig. 3, 4). Variationen zwischen Magen und Darm microbiomes wahrscheinlich reflektieren Details des Verdauungssystems, aber die Unterschiede zwischen den Standorten und unter den Wiederholungen legen nahe, dass microbiome Zusammensetzung auf lokale Faktoren reagieren könnten, und vielleicht auf genetische Unterschiede zwischen den Individuen. Analoge Variabilität wurde für andere Tiere berichtet [28], [29].

Oyster Magen Microbiome

Auf der Grundlage der Frequenz des OTU Auftreten, der Magen microbiome von Austern aus Louisiana in existieren bei dest zwei Zustände. Mollicutis am ehesten im Zusammenhang mit Mycoplasma
dominieren überwiegend die klassifizierten Sequenzen (> 80%) eines Staates durch See Caillou Austern dargestellt (Abb 1a;. Die Tabellen 1, 3). Keine andere Klasse trägt mehr als etwa 2%. Planctomycetes dominieren (23% -33%) die alternative Aussage, dass der Zürgelbaum Bay Austern (1a;. Die Tabellen 1, 3) - aber mehrere andere Gruppen auch in den Mägen dieser Austern bei bescheidenen Häufigkeiten auftreten, zum Beispiel Chloroflexi (8 %), Firmicutes (9% -11), Mollicutes (5% -9%), Proteobacteria (5% -12%) und Verrucomicrobia (3% -14%). Darüber hinaus sind zwei ähnlich reichlich OTUs, die zu verschiedenen Stämmen gehören (Planctomyces und entweder Firmicutes, Tenericutes oder Verrucomicrobia) dominieren Auster Zürgelbaum Bay Mägen bei einer Spezies Ebene (evolutionäre Distanz = 0,03; Tabelle 3). Der Anteil der klassifizierten OTUs entfielen durch verschiedene Stämme und Klassen ist auch im Einklang mit zwei unterschiedlichen Zuständen für den Magen microbiome (Abb. 2), obwohl die Unterschiede für diese weniger ausgeprägt sind metrisch als für frequenzbasierten Schätzungen der Zusammensetzung. UniFrac PCA (gewichtet und ungewichtet) und Clusteranalysen für die "Zwei-Staaten" -Konzept zusätzliche Unterstützung bieten (Abb. 3, 4).

Die physiologische und ökologische Bedeutung dieser Auster Magen microbiomes ist ungewiss. Dominance von Mollicutis oder Planctomycetes ist etwas ungewöhnlich im Vergleich zu anderen microbiomes [28], [30] - [32], obwohl Mollicutis reichlich erscheinen in der Verdauungsdrüse des Felsens Auster Sydney ( Saccostrea glomerata
) und in der Darm des Abalone, Haliotis Diskus hannai
[33], [34]. [42] - Mollicutis haben auch in Auster gut Becherzellen basierend auf mikroskopischen Nachweis [25], und dokumentiert für andere wirbellose Tiere und Fischeingeweide von kulturbasierten und molekularen ökologischen Methoden [30], [35] berichtet. Ansonsten ist relativ wenig mit wirbellosen Verdauungssystem über ihre Verbände bekannt. Tatsächlich bleiben die ökologische Rolle von Mollicutis generell unsicher, einigen Berichten zufolge der Pathogenese in ausgewählten Fischen und wirbellosen Tieren [43] - [46]., Aber auch andere Berichte, irgendeine Form von commensalism angibt, [30], [39]

bisher genomische Beweise bietet einige Einblicke, da das genetische Repertoire von Mycoplasma Handy
, die Taxon am ehesten im Zusammenhang mit der Auster OTUs, beschränkt sich in ihrem Umfang [47]. M
. Mobil
congenerics in Auster Mägen einfach könnte wuchern Substrat durch den Wirt oder anderen Mikroben während der Verdauung produziert verwendet wird; Ähnliche Vorschläge wurden zur Berücksichtigung von Mollicutes Vereinigungen mit Kaltwasserkorallen [39] gemacht. Trotzdem, dass die Möglichkeit Mollicutis könnte symbiotisch zu ihren Wirten beitragen kann nicht entlassen werden.

Die Rolle der Planctomyces in das Verdauungssystem ist auch ungewiss. Obwohl sie ökologisch wichtige Mitglieder der Meeres Bakterioplankton sind, funktionell sehr unterschiedlich und im Zusammenhang mit Algen, wirbellose Tiere und Wirbeltiere [48], [49], in der Regel sie bei relativ niedrigen Häufigkeiten in gut microbiomes auftreten (< 5%) [30] - [32]. Allerdings ergibt sich aus dieser Studie legen nahe, dass unbekannte Bedingungen in der Hackberry Bay Auster Magen zugunsten Planctomyceten Proliferation (Tabelle 1).

Es ist verlockend, hier zu spekulieren, wie andere an anderer Stelle haben [50], dass Pirellula
-ähnlichen Mitglieder der Auster microbiome ausnutzen sulfatierten Algenpolysaccharide für Wachstum, da die mutmaßlich zahlreiche Gene, die für Enzyme kodieren sulfohydrolase haben in der Rhodopirellula Baltica
Genom [51], und da Sulfatpolysaccharide könnten häufig beobachtet worden sein von Austern als Folge des Phytoplanktons Verbrauch eingenommen. Die Fähigkeit, sulfatierte Polysaccharide zu verwenden wäre somit eine Erklärung für Fülle Planctomyceten bieten. Leider sind die Verwandtschaftsbeziehungen zwischen R
. Baltica
und Planctomyceten OTUs in dieser Studie identifiziert wurden, sind unzureichend solche Schlüsse zu unterstützen. Trotzdem alle Blastopirellula
, Pirellula
und Rhodopirellula
bis heute eine breite Palette von einfachen, nicht-sulfatierten Zucker verwenden gekennzeichnet Isolate [48], [49], [ ,,,0],52], zumindest einige davon sind wahrscheinlich in der Auster Verdauungstrakt auftreten als Algenbiomasse hydrolysiert wird.

Oyster Gut Microbiome

die Auster gut microbiome birgt eine speciose oder OTU-rich Gemeinschaft, als dies die microbiome Magen basierend auf beobachteten Arten (S _{obs) und ACE und CHAO1 Vielfalt Schätzer (Tabelle 5). Diese Indizes zeigen auch, dass Mägen und Därme des Sees Caillou Austern weniger OTUs als Hackberry Bay Austern Hafen. Somit ändert sich OTU Reichtum zwischen Auster Gewebe (zum Beispiel Magen und Darm), wie es für den menschlichen microbiome gut dokumentiert [53], scheint aber auch zwischen den Populationen zu variieren. Die Quelle von Variationen in Reichhaltigkeit unter Auster Populationen ist unbekannt.}

Variations in Reichhaltigkeit Trotz der gut microbiome nicht notwendigerweise vielfältiger als Magen microbiome basierend auf Shannon und Simpson-Indizes und die Heitsschätzer invers, von denen jede ähnlich sind, für den Darm microbiome See Caillou und die beiden Hackberry Bay microbiomes (Tabelle 5). Diese Ähnlichkeit zeigt an, dass die Struktur der Auster microbiome Vielfalt in einigen Fällen (Reichhaltigkeit und Gleichmäßigkeit) ist unabhängig von dem Verdauungssystem und phylotype Zusammensetzung. Im Gegensatz dazu sind alle Diversity-Indizes für den See Caillou Magen microbiome wesentlich niedriger als für Mägen Zürgelbaum Bay, und niedriger als für beide gut microbiomes auch. Dies kann in Lake Caillou Auster Mägen von Mollicutes OTUs (zB Tabelle 5 und Abb. 1a) auf die Dominanz zurückgeführt werden.

Die Zusammensetzung der Darm microbiomes aus Louisiana Austern von der anderer Mollusken unterscheidet und von der andere Meeres und nicht-Meerestiere (Abb. 5). Gruenthal [54] hat gezeigt, dass Proteo dominieren (> 80%) die gut microbiomes of California schwarz ( Haliotis cracherodii
) und weiße Abalone ( H
sorenseni
. ); Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomyces und Verrucomicrobia erscheinen von beiden fehlen. Huang et al. [41] zeigen an, daß Mollicutes und δ-Proteobacteria den Darm des kleinen Abalone dominieren. Cardoso et al. [55] berichten, dass Bacteroidetes und Firmicutes den Darm der Gastropoden Schnecke dominieren, Achatina Fulica
. Firmicutes zusammen mit Bacteroidetes, Proteo und Actinobacteria dominieren die Eingeweide von anderen wirbellosen Tieren (zB Boden-Fütterung Termiten [56] und Kakerlaken [57]) und Wirbeltiere (zB pflanzenfressende Meeresfische [58]; Graskarpfen, [31], [ ,,,0],59] und Primaten [60]), während Mollicutis dominieren den Mut einiger Fische [30], [36]. Im Gegensatz dazu ist für Proteo Konto nur etwa 20% der Darm Zusammensetzung der Austern in dieser Studie, Chloroflexi, Planctomyces und Verrucomicrobia jeweils relativ reichlich vorhanden, und Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes und Mollicutis tragen jeweils etwa 10% oder weniger (Abb. 1a;. Tabelle 3)

Diese Unterschiede in der Zusammensetzung zwischen Darm-Systemen ergeben sich aus den Auswirkungen mehrerer interagierender Variablen, darunter Darm-Architektur, Verdauungsphysiologie, Ernährung und dem Ausmaß, in dem und microbiomes Gastgeber haben symbiotisch entwickelt [61 ] - [63].

• PLoS ONE: Cannabinoid HU210 Schützt Isolierte Rattenmagen gegen Beeinträchtigung verursacht durch Serum von Ratten mit experimentellen akuten Pankreatitis
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